CC BY
75
локальный цитокиновый профиль при аденовирусной инфекции глаз
© С. А. Кочергин1, Г. М. Чернакова1, Е. А. Клещева1, И. М. Шаповал2, М. В. Мезенцева2
1 ГБОУ ДПО РМАПО Минздравсоцразвития России, г. Москва
2 ФГБУ НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России, г. Москва
ф Обследовано 69 пациентов с аденовирусной инфекцией глаз, из них 27 с острой формой заболевания (группа А) и 42 с хронической (группа В). Группу контроля составили 39 здоровых добровольцев. У всех пациентов диагноз подтвержден положительными результатами полимеразной цепной реакции (ПЦР) на наличие в конъюнктивальном соскобе ДНК аденовируса. Исследовались экспрессия мРНК 11 регуляторных цитокинов и количественное содержание 9-ти основных Тх1/Тх2 цитокинов в конъюнктивальном соскобе в 1-й, 7-й и 14-й день заболевания. Определение мРНК цитокинов проводилось методами обратной транскрипции и ПЦР, содержание цитокинов в материале — методом проточной цитофлуометрии. Оценивая полученные результаты, можно обратить внимание на тенденцию к активации экспрессии генов ряда цитокинов (ИФН-а, ИФН-у, ИЛ-2, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-18) в группах А и В в начале заболевания по сравнению с таковой у здоровых добровольцев, при этом транскрипция ИЛ-1Р, напротив, была угнетена. Отмечается разный характер экспрессии генов ИФН-а и ИФН-у в группах с острой и хронической формами заболевания в динамике. Наблюдается подъем частоты экспрессии генов ИФН-а и ИФН-у ко второму визиту (7-й день) у пациентов группы А. В группе В, напротив, определяется уменьшение количества пациентов с экспрессией генов этих белков, от первого дня к 14-му. Количественный анализ выявил снижение количественного содержания практически всех исследуемых цитокинов в группах А и В по сравнению со здоровыми добровольцами.
ф Ключевые слова: аденовирус; острые и хронические формы аденовирусных инфекций глаз; локальный иммунный статус; цитокины.
УДК 617.72-07 ГРНТИ 76.29.56 ВАК 14.01.07
список сокращений
АДВ — аденовирус
ГМ-КСФ — гранулоцитарно-макрофагальный ко-
лониестимулирующий фактор ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота ИЛ — интерлейкин ИФН — интерферон
мРНК — матричная рибонуклеиновая кислота НК-клетки — натуральные киллерные клетки ПЦР — полимеразная цепная реакция Тх — Т-лимфоциты хелперы ФНО — фактор некроза опухолей S-IgA — секреторный иммуноглобулин А
Воспалительные заболевания глаз вирусной, бактериальной и смешанной этиологии имеют широкое распространение и являются серьезной медико-социальной проблемой, составляя более 40 % всех амбулаторных больных [5, 6]. Наиболее распространенными агентами, вызывающими поражения органа зрения, являются аденовирусы (АДВ). Кроме того, аденовирусы остаются наиболее частыми возбудителями госпитальной офтальмоинфекции [1, 4, 6, 7]. Кроме острых форм, аденовирусная инфекция
глаз может протекать также в виде хронических и рецидивирующих форм, удельный вес которых в настоящее время оценивается с трудом [1].
Иммунопатогенез острых и хронических инфекций глаз — сложная научно-практическая проблема, многие аспекты которой еще только открываются пониманию исследователей. Аденовирусная инфекция оказывает глубокое воздействие на синтез макромолекул в клетках хозяина. При аденовирусных поражениях глаз происходит изменение иммунного статуса больного, характер которого зависит от типоспецифиче-ских свойств вируса, места его репродукции, взаимодействия с иммунокомпетентными клетками [5, 6]. На фоне аденовирусной инфекции происходит развитие иммунной недостаточности, что обусловлено многими факторами, в т. ч. апоптоз-индуцированным снижением количества Т-лимфоцитов, наличием антагонистического эффекта действия фактора некроза опухоли (ФНО), а также, экспрессией так называемых вирус-ассоциированных РНК-генов, которые способствуют подавлению противовирусного действия интерферо-нов (ИФН) и других цитокинов [1, 14, 17, 18].
В последние десятилетие в доступной литературе появилось большое количество работ, посвященных
значимости роли цитокинов в иммунном ответе при вирусных инфекциях глаз [8, 9, 11, 12, 13]. Цитокины представляют собой группу полипептидных медиаторов межклеточного взаимодействия, участвующих в регуляции защитных реакций организма при внедрении патогена и нарушения целостности тканей. Цитокины обладают полифункциональностью и действуют по каскадному принципу: усиление секреции одного из медиаторов приводит к стимуляции (или подавлению) продукции другого [3, 10]. Изучение цитокинового баланса позволяет получить информацию о функциональной активности различных типов иммунокомпетентных клеток, о тяжести воспалительного процесса, о соотношении процессов активации Т-хелперов (Тх)1 и 2-типов, о стадии развития ряда инфекционных, аллергических и аутоиммунных заболеваний. Оценка уровней цитокинов, в частности, с использованием иммуноферментных диагностических тест-систем позволяет по-новому подойти к изучению состояния иммунной системы организма в клинической практике. В связи с этим, в последнее время изучение закономерностей синтеза цитокинов, как важнейшего звена иммунорегуляции, привлекает все больше внимания исследователей всех медицинских специальностей и, в том числе, офтальмологов. В качестве материала для исследований используют слезную и внутриглазные жидкости, ткани глаза, сыворотку крови и другие биологические жидкости и ткани [1, 8, 13].
Сведения, о значении цитокинов при аденовирусной инфекции конъюнктивы и роговицы в научной литературе, единичны. Так, согласно данным S. ^ Mondal, развитие воспалительных процессов в конъюнктиве глаза при аденовирусной инфекции ассоциируется со сниженным локальным уровнем цитокинов, по сравнению с таковым при кератитах (на примере офтальмогерпеса), что объясняется наличием в конъюнктиве глаза человека мукозо-ассоциированной лимфоидной ткани, связанной со слизистыми оболочками и формирующей полноценный гуморальный ответ [16].
Исследования Шевчук Н. Е. выявили важную роль цитокина ИЛ-6 в развитии воспалительного процесса при аденовирусной инфекции глаз, содержание которого в сыворотке крови и слезной жидкости увеличивается более чем в 3 раза, при незначительном повышении уровней ИЛ-1 и ФНО. По мере элиминации аденовируса из организма, и стихания воспалительного процесса наблюдается снижение уровня ИЛ-6 в сыворотке крови и слезной жидкости, при практически неизменном содержании ИЛ-1 и ФНО. Проведенные исследования показали, что инфицирование аденовирусами оболочек глаза сопровождается активными системными иммунными ре-
акциями (продукцией цитокинов в циркулирующей крови) [13].
Изменения в системе цитокинов при воспалительных заболеваниях глаз вирусной этиологии, по-видимому, обуславливают хроническое и рецидивирующее течение, тяжесть исходов и недостаточную эффективность терапии [8, 11, 13]. В этой связи, особое значение приобретает изучение локального цитокинового статуса, как у здоровых добровольцев, так и у пациентов с аденовирусной инфекцией глаз различного течения. Согласно многим публикациям, объектом исследования цитокинового статуса глаза, в основном, является слезная жидкость. Продукция цитокинов собственно клетками конъюнктивы в норме и при патологии не изучена, что сделано впервые в настоящем исследовании.
цель исследования
Изучить закономерности изменения локального цитокинового статуса при различных формах течения аденовирусной инфекции глаз.
материал и методы исследования
Под нашим наблюдением находилось 69 пациентов с аденовирусной инфекцией глаз в возрасте от 21 до 84 лет. Все пациенты приглашались на осмотр, в среднем, 1 раз в неделю, если не требовалось чаще. К третьему визиту (14 день заболевания) у всех пациентов наблюдалась существенная редукция клинической картины и отчетливая тенденция к выздоровлению. Принимая во внимание этот факт, а также большой массив иммунологических параметров, исследование ограничилось тремя точками забора материала для исследований — 1-м, 7-м и 14-м днями заболевания.
У всех пациентов диагноз подтвержден положительными результатами полимеразной цепной реакции (ПЦР) на наличие в конъюнктивальном соскобе ДНК АДВ. Для идентификации аденовируса применяли набор реагентов АмплиСенс Adenovirus-EP.
Локальный цитокиновый статус изучали путем исследования, как уровня экспрессии генов цито-кинов, так и содержания белков цитокинов в материале. Изучение вышеуказанных параметров проводили параллельно в группах пациентов и у здоровых добровольцев. Исследование экспрессии генов 11 цитокинов (ИФН-а, ИФН-у, RH-1ß, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-18, ФНО-а) путем определения их матричной РНК (мРНК) проводили методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Регистрацию результатов ПЦР осуществляли электрофоретически в 2,5 % агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. Для идентификации нуклеотидных последовательно-
стей использовали маркер для электрофореза фирмы Promega. Содержание 9-ти цитокинов в материале (ИФН-y, ИЛ-5, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-13, ФНО-а, ГМ-КСФ) оценивали методом проточной цитофлуометрии на двухлучевом лазерном автоматизированном анализаторе Bio-Plex Protein Assay System (пр-во «Bio-Rad», США) с использованием тест-систем в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Сущность метода заключается в использовании проточных систем измерения с одномоментным анализом связывания значительного числа цитокинов со специфическими моноклональными антителами на твердой фазе. Метод позволяет производить количественную оценку в режиме реального времени в малом объеме образца (50 мкл) до 100 цитокинов. Для отдельных цитокинов была возможность проследить как уровень продукции генов, так и непосредственное их количество.
Материалом для исследования во всех случаях служили клетки конъюнктивального соскоба. Забор материала проводился у всех пациентов трехкратно (при первичном обращении, на 7-й и 14-й день наблюдения), у здоровых добровольцев забор материала осуществлялся однократно. Манипуляцию осуществляли универсальным зондом после местной анестезии раствором проксиметакаина («Алкаин», Алкон, США) в пробирку с 0,1 мл физиологического раствора, перемешивали и отстаивали 4 часа при комнатной температуре. Надосадочную жидкость использовали для тестирования.
Статистическая обработка результатов была произведена при помощи пакета SPSS Statistics 19. Для сравнения частот экспрессии генов цитокинов между группами использовался критерий независимости %2 Пирсона, и Q-тест Кохрана для анализа различий по визитам внутри каждой из групп. Статистическая достоверность различий количества цитокинов подтверждалась использованием критерия %2 в модификации Краскела—Уолеса в исследуемых группах и критерия Манна—Уитни для попарного сравнения групп. Критерий Фридмана использовался для сравнения количественного содержания цитокинов в динамике (по визитам). Различия считались статистически достоверными при р<0,05.
При каждом визите всем пациентам проводились: стандартное офтальмологическое обследование, пальпация околоушных, подчелюстных и шейных лимфатических узлов, осмотр рта и зева. Диагноз аденовирусного поражения глаз устанавливался на основании характерной клинической картины, данных эпидемиологического анамнеза и верифицировался данными ПЦР.
Все пациенты были разделены на две группы в зависимости от характера течения заболевания, при
этом критерием хронического течения заболевания считали сохранение жалоб в течение трех и более месяцев при трехкратном положительном анализе на АДВ. Первую группу (А) составили пациенты с острой формой аденовирусной инфекции глаз (п=27), вторую (В) — пациенты с хронической и затяжной формой (п=42). Группу контроля составили 39 здоровых добровольцев, без признаков офталь-мопатологии, с отсутствием анамнестических данных о перенесенных инфекциях глаз и с отрицательными результатами анализа на наличие ДНК аденовируса методом ПЦР.
Все пациенты с острой формой заболевания (п=27) в первый день обращения предъявляли жалобы на покраснение глаз, слезотечение (100 %), светобоязнь (72,2 %), а также симптомы общей интоксикации (лихорадка (63,6 %), головная боль (81,8 %), лимфоаденопатия (72,7 %)). Симптомы заболевания появлялись за 1—4 дня до обращения к офтальмологу. Объективно у всех пациентов мы наблюдали выраженную гиперемию (100 %), отек век (81,8 %) и конъюнктивы (100 %), множественные фолликулы конъюнктивы нижнего свода (100 %), петехиальные кровоизлияния на слизистой оболочке (100 %). У большинства пациентов этой группы выявлялись мелкоточечные поверхностные инфильтраты по периферии роговицы (54,5 %). Всем пациентам группы назначалась общая и местная противовирусная, противовоспалительная и антибактериальная терапия согласно выраженности явлений острого воспаления, характера отделяемого из конъюн-ктивальной полости, общего состояния пациентов. К седьмому дню болезни явления острого воспаления существенно стихали, незначительные явления поверхностного везикулярного кератита оставались в 63,6 % случаев. К 14-му дню жалобы никем из пациентов почти не предъявлялись, но в половине случаев оставалась незначительная гиперемия слизистой оболочки (45,5 %), у ряда пациентов наблюдались поверхностные точечные инфильтраты (27,3 %).
У большинства пациентов второй группы с аденовирусной инфекцией хронического течения (п=42) отмечался перенесенный в анамнезе острый аденовирусный конъюнктивит (в сроки от 1,5 до 3-х месяцев до включения в настоящее исследование). Все пациенты этой группы при первичном обращении предъявляли жалобы на небольшой дискомфорт и незначительное чувство инородного тела в области пораженных глаз, а также на наличие скудного слизистого отделяемого (71,4 %). Само хроническое течение инфекции в этой группе было различным. Так, например, у 14 пациентов наблюдался хронический вялотекущий конъюнктивит (из симптомов воспаления конъюнктивы наблюдались: легкая гиперемия,
Таблица 1
Частоты клинических симптомов в группах исследуемых пациентов, выраженные в процентах (1 — первый день, 2 — седьмой день, 3 — четырнадцатый день)
Группа Визит Отек век Светобоязнь Слезотечение Отек конъюнктивы Гиперемия Петехии Фолликулы Отделяемое слизистое Отделяемое слизисто-гнойное Инфильтраты Лимфоузлы Нарушение сна Головная боль Субфибрилитет Ринит Фарингит
Острая форма (n=27) 1 81,8 72,7 100 100 100 100 100 45,5 54,5 54,5 72,7 45,5 81,8 63,6 45,5 18,2
2 81,8 36,0 72,7 81,8 81,8 81,8 81,8 54,5 27,3 63,6 45,5 45,5 45,5 36,4 36,4 9,1
3 18,2 18,2 9,1 27,3 45,5 36,4 27,3 45,5 18,2 27,3 45,5 18,2 36,4 9,1 18,2 9,1
Хроническая форма (n=42) 1 72,4 14,3 50 92,9 92,9 28,6 92,9 71,4 21,4 0 0 14,3 7,1 7,1 0 0
2 18,2 0 21,4 50 64,3 21,4 78,6 71,4 7,1 0 0 7,1 0 0 0 0
3 0 0 0 7,1 35,7 7,1 35,7 18,2 0 0 0 0 0 0 0 0
скудное слизистое отделяемое, фолликулы), еще у 17 пациентов мы наблюдали рецидивирующее течение конъюнктивита (с эпизодами выраженных обострений и ремиссий). И, наконец, оставшиеся 11 пациентов этой группы на момент осмотра предъявляли жалобы на стойкую умеренную гиперемию конъюнктивы, торпидную к антибактериальной терапии. Всем пациентам группы также была назначена местная и общая терапия в зависимости от длительности заболевания с учетом уже проведено го лечения, интенсивности жалоб и симптомов, сопутствующих и фоновых заболеваний. При повторном осмотре (7 день) наблюдалась выраженная положительная динамика, однако у 21,4 % сохранялись небольшое слезотечение, у 63,6 % гиперемия конъюнктивы и слизистое отделяемое небольшой дискомфорт в области глаз и чувство инородного тела у 71,4 %. При третьем визите у всех пациентов жалобы отсутствовали или были минимальны, объективно не наблюдались признаки воспаления конъюнктивы. Обобщенные данные о наличие тех или иных симптомов, характерных для каждой из групп пациентов, в разные визиты представлены в таблице 1. Обращают на себя внимание различия в клинической картине острой и хронической форм АВК.
В группе В практически полностью отсутствовали явления астенического синдрома (головная боль, повышение температуры, нарушение сна), симптомы поражения верхних дыхательных путей (ринит, фарингит), кроме того, региональные лимфатические узлы не пальпировались ни у одного из обследуемых. У пациентов данной группы отмечались следующие признаки воспаления конъюнктивы: отек (92,9 %) и гиперемия (92,9 %), скудное слизистое отделяемое (71,4 %) и фолликулы (92,9 %), в редких случаях светобоязнь (14,3 %) и петехиальные кровоизлияния (28,6 %).
результаты и обсуждение
Результаты проведенных исследований суммированы в таблицах 2 и 3. Частота экспрессии генов цитокинов приведена в процентах. Количество цито-кинов приведено в средних рангах, согласно статистическим методам, использованным при обработке результатов.
Известно, что основу противовирусной защиты обеспечивают механизмы клеточного иммунитета. Локально продуцируемые или циркулирующие с кровью антитела (гуморальный иммунитет) могут блокировать распространение вирусов, высвобождающихся из погибших инфицированных клеток и способных заражать другие клетки. Однако, как правило, одних лишь антител бывает недостаточно для полной нейтрализации вируса. В доступной литературе принято деление иммунного ответа на Т-хелпер 1 (Тх-1) и Т-хелпер 2 (Тх-2) типы ответов в зависимости от участия в нем Т-лимфоцитов хелперов первого или второго типа [3, 10]. Тх1-клетки, продуцируя ИЛ-2, ИФН-у, ФНО-а стимулируют развитие клеточного иммунитета и, в основном, цитотоксического ответа. Тх2-клетки, секретируя ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-13, активируют при этом В-лимфоциты и стимулируют продукцию ими антител, запуская иммунные механизмы по гуморальному типу. Известен также ряд цитокинов, посредством которых происходит запуск иммунного ответа по тому или иному пути (Тх1 или Тх2). Так, например, ИЛ-12 стимулирует продукцию ИФН-у НК-клетками и направляет дифференци-ровку на образование Тх1-клеток, ингибируя одновременно Тх2-ответ. Напротив, активация Т-клеток антигеном в присутствии ИЛ-4, ИЛ-10 приводит к запуску иммунных механизмов по Тх2-типу, ингибируя Тх1-клетки. Различные профили цитокинов, продуцируемые этими субпопуляциями Т-клеток,
Таблица 2
Частоты экспрессии генов цитокинов (выражены в процентах)
Цитокины Группа здоровых добровольцев (п=39) ( %) Острая форма(п=27) Хроническая форма(п=42)
1-й день ( %) 7-й день ( %) 14-й день ( %) 1-й день ( %) 7-й день ( %) 14-й день ( %)
ИФН-а 45,5 45,5" 54,5" 27,3" 69,2 30,8 30,8
ИФН-у 27,3 54,5" 63,6" 9,1" 53,8 30,8 7,7
ИЛ-lß 63,6 18,2* 18,2 18,2 30,8* 7,7 15,4
ИЛ-2 54,5 81,8*," 45,5" 36,3 92,3*," 46,2" 30,8
ИЛ-4 63,6 63,6 63,6 36,4 61,5 30,8 23,1
ИЛ-6 54,5 45,5* 36,4 18,2 76,9* 38,5 30,8
ИЛ-8 72,7 90,9*," 54,5" 18,2 69,2*," 46,2" 23,1
ИЛ-10 72,7 90,9 63,6 27,3 92,3 30,8 23,1
ИЛ-12 36,4 72,7 54,5 36,4 53,8 46,2 30,8
ИЛ-18 63,6 90,9 45,5 36,4 76,9 46,2 30,8
ФНО-а 63,6 63,6 54,5 18,2 53,8* 23,1 23,1
* — достоверные различия по сравнению со здоровыми добровольцами (р<0,05); « — достоверные различия между визитами внутри группы (р<0,05)
определяют роль Тх1- и Тх2-лимфоцитов в защите от микроорганизмов разных типов. Как правило, Тх1-клетки особенно эффективны в развитии иммунитета к вирусам и другим внутриклеточным паразитам, тогда как Тх2-ответ запускается против патогенов, которые уничтожаются, главным образом, с участием гуморального звена иммунитета. По данным литературы, в слизистых оболочках в норме реализуется Тх2-иммунный ответ, защитную функцию осуществляют, в основном секреторные антитела S-IgA [10]. В нашем исследовании мы попытались оценить не только роль тех или иных цитокинов в развитии иммунного ответа при острой и хронической формах аденовирусной инфекции глаз, но и определить направленность локального иммунитета (по гуморальному или клеточному пути). Поскольку экспрессия клетками мРНК цитокинов предшествует активному синтезу этих белков, данные по экспрессии анализируются в первую очередь
Суммируя полученные результаты (таблица 2), можно обратить внимание на наличие двух основных, на наш взгляд, закономерностей. Во-первых, имеется достаточно четкая тенденции к повышению частоты экспрессии генов некоторых цитокинов (ИФН-а, ИФН-у, ИЛ-2, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-18) в исследуемых группах (А и В) по сравнению с таковой у здоровых добровольцев, тогда как частота экспрессии мРНК ИЛ1р, напротив, снижена в обеих группах. Во-вторых, направление синтеза основных противовирусных цитокинов ИФН-а и ИФН-у происходит по-разному в группах с острой и хронической формами заболевания. Обращает на себя внимание увеличение количества пациентов с продукцией мРНК
ИФН-а и ИФН-у в динамике заболевания в группе А, и, затем, снижение активности транскрипции ин-терферонов к третьему визиту. В группе В наблюдается, напротив, уменьшение процента пациентов, у которых данные гены экспрессируются, от первого визита к последнему, а всплеска транскрипции этих цитокинов нет ни в одном из визитов.
В группе А частота экспрессии гена ИФН-а (интерферона первого типа), как уже было указано, меняется в динамике (таблица 2). Во втором визите у пациентов наблюдается некоторое повышение частоты экспрессии этого цитокина, а затем резкое снижение ее конце наблюдения. Доказано, что ИФН-а обладает выраженным иммунорегуляторным действием посредством повышения клеточной цитотоксичности Т-лимфоцитов и НК-клеток, способствуя дифферен-цировке Т-хелперов в Тх1-лимфоциты [3, 10, 15]. На ранней стадии развития вирусной инфекции, до возникновения первичного гуморального иммунного ответа, наиболее важным защитным противовирусным механизмом является как раз ИФН-а. Кроме того, ИФН-а защищает активированные Т-лимфоциты от апоптоза. ИФН-а может усиливать или уменьшать экспрессию ИЛ-12: в небольших концентрациях ИФН-а повышает уровень ИЛ-12 в макрофагах и активирует НК-клетки (натуральные киллерные клетки) к продукции ИФН-у, однако, высокие концентрации ИФН-а уменьшают экспрессию ИЛ-12 дендритными клетками и моноцитами. В нашем исследовании прослеживается тенденция повышения частоты экспрессии гена ИЛ-12 в обеих группах по сравнению со здоровыми добровольцами в первом визите, однако, в дальнейшем, происходит снижение
частоты его экспрессии в динамике как в группе А, так и в группе В. Динамика изменения уровня транскрипции ИФН-у в группе А схожа с таковой ИФН-а. Действуя как основной агент, активирующий макрофаги, ИФН-у играет роль «контролера» вирусной инфекции.
Следующий исследуемый нами цитокин ИЛ-1Р представляет собой секреторный цитокин, осуществляющий свое действие как на местном, так и на системном уровне. При ответе на внедрение патогена продукция ИЛ-1 начинается в зоне первого контакта клеток продуцентов с микроорганизмами, стимулируя специфическое звено иммунитета (воздействует на функциональную активность Т- и В-лимфоцитов, инфильтрирующих ткани и находящихся в региональных лимфоидных образованиях, таких, как субэпителиальные скопления лимфоидной ткани, имеющихся в том числе и в конъюнктиве) [10, 15]. В нашем исследовании происходит снижение частоты экспрессии гена ИЛ-1Р (р < 0,05) по сравнению с группой здоровых добровольцев как в группе А, так и в группе В, но в динамике вирусной инфекции статистически значимого различия не получено.
Изучение синтеза ИЛ-6 и ИЛ-8 на транскрипционном уровне выявило значимое ее отличие в группах А и В, по сравнению со здоровыми добровольцами (р < 0,05). При этом в группе пациентов с острой формой аденовирусной инфекции происходит снижение частоты экспрессии гена ИЛ-6, по сравнению со здоровыми, а в группе с хронической формой, наоборот, повышение. Обратная картина наблюдается в отношении ИЛ-8: в группе А выявлено повышение частоты экспрессии гена данного цитокина, а в группе В — снижение. Кроме того, в динамике развития воспалительного процесса в пределах каждой из групп наблюдается тенденция постепенного снижения уровня экспрессии ИЛ-8. Из литературных источников известно, что экспрессия гена ИЛ-6 происходит под влиянием попадающих в организм патогенов, в частности, вирусов [3, 10]. Основными проявлениями биологической активности ИЛ-6 (се-кретируемого Тх2-го типа) являются активация пролиферации В-лимфоцитов и стимуляция, тем самым, выработки антител. Также известно, что ИЛ-6 играет важную роль в дифференцировке Тх17, участвующих в антивирусном ответе. Полученные нами данные по экспрессии гена ИЛ-6, возможно, свидетельствуют о превалировании Тх2 звена иммунитета при хроническом течении инфекционного процесса.
Индукция синтеза ИЛ-8 клетками воспалительного очага, вызываемая структурными компонентами патогена, а также стимулирующим действием других цитокинов, приводит к активации и привлечению в очаг воспаления нейтрофилов. Повышение
экспрессии гена ИЛ-8 в группе А, по-видимому, связано с необходимостью сконцентрировать защитные иммунные факторы вокруг внедрившихся вирусов для более быстрого их уничтожения, а ее снижение в группе В, возможно, свидетельствует об истощении местных защитных механизмов в связи с длительной персистенцией аденовируса в клетках конъюнктивы.
Кроме того, в группе В происходит снижение частоты экспрессии гена ФНО-а (при уровне значимости р<0,05). При этом можно наблюдать тенденцию снижения частот его экспрессии внутри каждой группы при последующем визите. Эти данные коррелируют со снижением количественной продукции ФНО-а, что будет обсуждено ниже. Следует отметить, что т.к. ФНО-а и ИЛ-8 являются острофазовыми цитокина-ми, то подавление их синтеза при выздоровлении закономерно.
Оценивая частоту экспрессии ИЛ-2, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-18 в нашем исследовании, можно заметить ее повышение в обеих группах (р<0,05 для ИЛ-2, р > 0,05 для ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-18), но в дальнейшем происходит снижение частоты экспрессии внутри каждой группы в динамике заболевания. Известно, что ИЛ-2, ИЛ-12 и ИЛ-18 индуцируют продукцию Т-клетками ИФН-у и, кроме того, усиливает цитотоксическую активность НК-клеток, а ИЛ-10 подавляет продукцию Тх1-цитокинов и в частности — ИФН-у [3]. Тенденция к снижению частоты экспрессии вышеуказанных цитокинов в динамике заболевания, возможно, является отражением обычного процесса взаимодействия вирус-организм на местном уровне, т.е. при неослож-ненном течении аденовирусной инфекции глаз сроки экспрессии мРНК этих цитокинов не превышают 7 дней от начала инфекции.
Предваряя анализ данных количественного содержания цитокинов, следует отметить, что набор тест-системы для этого исследования не предусматривал определения количества ИФН-а, ИЛ-1 в, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-18.
Оценивая полученные нами результаты (таблица 3) можно заметить три последовательные тенденции. Во-первых, количественное содержание абсолютно всех исследуемых цитокинов изначально изменено по сравнению со здоровыми индивидуумами, однако, статистически значимые различия получены по пяти цитокинам (ИЛ-5, ИЛ-10, ИЛ-12, ФНО-а и ГМ-КСФ). Во-вторых, при проведении нами сравнительного анализа уровней цитокинов в группах А и В статистически значимых различий не выявлено, что может быть обусловлено воздействием общего этиологического фактора, который индуцирует один и тот же иммуннопатологический сценарий. И, наконец, в-третьих, количество большинства цитокинов снижается двукратно ко второму визиту
Таблица 3
Количественное содержание цитокинов (исследования в таблице приведены в средних рангах)
Цитокины Средние ранги у здоровых добровольцев Острая форма(п=27) Хроническая форма(п=42)
1 (1-й день) 2 (7-й день) 3(14-й день) 1 (1-й день) 2 (7-й день) 3(14-й день)
ИФН-у 16,55 13,44 8,21 3,75 20,86 6,79 4,33
ИЛ-5 22,95 11,94** 7,07 3,5 16,79* 7,93 4,67
ИЛ-2 17,95 15,56 6,79 3,5 18,39 8,21 4,67
ИЛ-4 21,36 15,83 7,5 3,5 15,54 7,5 4,67
ИЛ-10 21,73 14,33*," 7,79" 3,0" 16,21*," 7,21" 5,33"
ИЛ-12 23,82 11,89** 7,14 3,5 16,14* 7,86 4,67
ИЛ-13 20,82 15,83 7,57 3,5 15,96 7,43 4,67
ФНО-а 23,64 12,06** 6,57 2,5 16,18*," 8,43" 6,00"
ГМ-КСФ 24,00 11,72* 7,36 3,25 16,11*," 7,64" 5,00"
* — достоверные различия по сравнению со здоровыми добровольцами; « — достоверные различия между визитами внутри группы. * — р <0,05; ** — р < 0,01
по сравнению с первым, и затем имеет тенденцию к дальнейшему небольшому снижению к 14 дню заболевания. Возможно, при острой и хронической формах аденовирусной инфекции происходит глубокое подавление всех иммунных реакций, опосредованных цитокинами, что, безусловно, с одной стороны негативно отражается на борьбе глаза с внутриклеточной инфекцией, а с другой стороны предотвращает чрезмерное развитие воспалительного процесса.
ИФН-у и ИЛ-2 в нашем исследовании имеют тенденцию к снижению и по сравнению со здоровыми добровольцами и в динамике инфекционного процесса каждой из групп. Известно, что ИФНу и ИЛ-2 играют важную роль в защите против вирусов, привлекая макрофаги и моноциты в очаг воспаления [3, 10]. Возможно, в комплексное лечение аденовирусной инфекции глаз следует включать иммуномодули-рующие препараты, корректирующие направленно именно синтез этих цитокинов.
Обращает на себя внимание пониженные по сравнению со здоровыми уровни ФНО-а и ГМ-КСФ (р<0,05), также участвующих в антивирусном ответе, в обеих группах пациентов. В группе В мы наблюдали достоверное снижение обоих цитокинов в динамике заболевания. По данным литературы снижение уровня или отсутствие ФНО в очаге воспаления свидетельствует о том, что защита организма от патогенов является нарушенной. Под влиянием ФНО-а резко увеличивается образование макрофагами и нейтрофилами перекиси водорода и других свободных радикалов, а при хроническом воспалении ФНО-а активирует катаболические процессы. В нашем исследовании снижение количества данного цитокина, вероятно является следствием синтеза вирусных белков, которые способны блокировать ФНО-зависимый цитолиз инфицированных кле-
ток конъюнктивы [10, 15]. Данные по количеству ФНО-а не совпадают с таковыми у Шевчук Н. Е., что, возможно, связано с разными объектами и методами исследования. ГМ-КСФ обеспечивает диф-ференцировку моноцитов в зрелые тканевые макрофаги, угнетение синтеза этого цитокина, вероятно, приводит к блокировке данного процесса и ограничению количества активных макрофагов в очаге воспаления.
В нашем исследовании было получено достоверное снижение ИЛ-12 (р<0,05) в обеих группах в сравнении со здоровыми добровольцами. Из данных литературы известно, что главным свойством ИЛ-12 является детерминирование Тх1-ответа (повышает пролиферацию НК-клеток и Т-лимфоцитов и увеличивает цитолитическую активность цитотоксиче-ских Т-лимфоцитов), который защищает организм от внутриклеточных патогенов [3, 15]. При этом подчеркивается, что недостаток ИЛ-12 приводит к блокированию всего каскада Тх1-зависимого иммунного ответа против вирусов.
Возможно, снижение уровня цитокинов, координирующих иммунный ответ по Тх1-пути (ИФН-у, ИЛ-2, ФНО-а, ИЛ-12 и ГМ-КСФ), связано как с необходимостью избежать иммунной альтерации тканей глаза путем целенаправленного сдерживания цитотоксических клеточных реакций по Тх1 типу, так и являться следствием осуществления вирусной стратегии против иммунной системы.
Однако, как показал детальный анализ данных, наблюдается снижение количественного содержания и Тх2-цитокинов.
Одним из главных биологических свойств ИЛ-4 является его способность активировать пролиферацию и функциональную активность В-лимфоцитов. Он играет роль одного из основных негативных ре-
гуляторов развития реакций клеточного иммунитета, осуществляя это путем прямого подавления иммунологических реакций, вызываемых цитокинами Тх1 [3]. Свойства ИЛ-13 существенно не отличаются от таковых у ИЛ-4. В целом, ИЛ-13 усиливает проявления гуморального иммунного ответа, выступая в роли цитокина, дублирующего в этом плане действие ИЛ-4. Различия между двумя цитокинами заключаются в полном отсутствии у ИЛ-13 способности активировать Т-лимфоциты. В нашем исследовании количество ИЛ-4 и ИЛ-13 в обеих группах имеет тенденцию к снижению и по сравнению со здоровыми добровольцами, и внутри каждой из групп в динамике заболевания. Количественные показатели ИЛ-5 были также достоверно ниже по сравнению со здоровыми добровольцами в обеих группах. Известно, что ИЛ-5 синтезируется Тх2-клетками и регулирует функции В-лимфоцитов и других клеток, участвующих в реакциях гуморального иммунитета, и, кроме того, ИЛ-5 значительно усиливает продукцию иммуноглобулинов В-клетками, (в частности, синтез ^А) [3,10,15]. Снижение уровня данных ци-токинов, вероятно, является следствием подавления Тх2-иммунного ответа, что может наблюдаться при вирусных инфекциях.
Известно, что ИЛ-10 вырабатывается особым типом Т-лимфоцитов (регуляторные Т-лимфоциты) и усиливает дифференцировку Тх2-клеток путем ингибирования продукции ИФНу Т-лимфоцитами, особенно через супрессию синтеза ИЛ-12 [3]. Таким образом, он может изменять направленность иммунитета, переключая его из Тх1 в Тх2-зависимый иммунный ответ. В нашем исследовании наблюдается снижение количества ИЛ-10 в группе А по сравнению с группой контроля (р<0,05), статистически значимое снижение уровня данного цитокина происходит постепенно от первого к 14-му дню болезни.
заключение
Таким образом, наблюдаемый нами цитокиновый ответ при аденовирусной инфекции глаз имеет некоторые характерные особенности. ИФН-а и ИФН-у являются основными цитокинами, участвующими в противовирусном иммунитете, поэтому всплеск частоты экспрессии генов данных цитокинов при острой форме заболевания отражает адекватную реакцию тканей в ответ на аденовирусную инфекцию, что нельзя сказать о хроническом течении инфекционного процесса. Кроме того, в нашем исследовании наблюдается полное торможение активности как Тх1, так и Тх2- звена иммунитета, что проявляется в определении сниженного количественного содержания ИФН-у, ИЛ-2, ИЛ-12, ФНО-а, ГМ-КСФ (Тх1) и ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10 (Тх2). Происходящее
можно объяснить двумя причинами, действующими попеременно или вместе. По-видимому, аденовирус осуществляет направленное блокирование всех видов цитокинов, отвечающих как за развитие клеточного, так и за развитие гуморального ответа. Кроме того, ткани глаза подвержены законам ауторегуля-ции (закономерного подавления) на местном уровне активного цитотоксического киллинга инфицированных клеток во имя их минимального повреждения. Последнее обстоятельство, безусловно, создает условия для возможного затяжного, а в некоторых случаях и хронического течения аденовирусной инфекции глаз, что требует от офтальмологов своевременного выявления и адекватного лечения данного состояния, возможно, с применением иммуномоду-лирующих препаратов.
список литературы
1. Бикбов М. М., Шевчук Н. Е., Мальханов В. Б. Цитокины в клинической офтальмологии. — Уфа, ГУ Уфимский научно-исследовательский институт глазных болезней АН РБ, ГУП РБ «Уфимский полиграфкомбинат», 2008. — 152 с.
2. Казакбаев А. Г. Комплексная диагностика и лечение эпидемического кератоконъюнктивита: Автореф. дисс... канд.мед. наук. — М., 1989. —19 с.
3. Кетлинский С. А., Симбирцев А. С. Цитокины. — Санкт-Петербург, 2008. — С. 242-243, 286-287.
4. Краснов М. М., Каспаров А. А., Каспарова Е. А. Клинические особенности и иммунотерапия осложненных форм аденовирусного конъюнктивита // Вестн. офтальмол. — 1998. — № 5. — С. 23-28.
5. Майчук Ю. Ф. Оптимизация фармакотерапии воспалительных болезней глазной поверхности // Рос. Офтальм. Журнал. — 2008. — № 3. — С. 18-25.
6. Майчук Ю. Ф. Оптимизация фармакотерапии воспалительных болезней глазной поверхности. Издание второе. — Москва, 2010. — С. 114
7. Мальханов В. Б., Грипась И. А., Кудоярова Э. Г. Актуальные вопросы профилактики, диагностики и лечения вирусных заболеваний глаз. — Уфа, 1987. — С. 147
8. Мальханов В. Б., Марванова З. Р., Шевчук Н. Е. Цитокиновый статус больных офтальмогерпесом // Вопросы вирусологии. -2004. — № 1. — С. 28-30.
9. Никитин Н. А., Кузбеков Ш. Р. Роль TGFp в офтальмологии // Цитокины и воспаление. — 2009. — Т. 8, № 1. — С. 3-9.
10. Рабсон А., Ройт А., Делвз П. Основы медицинской иммунологии. — М.: Мир, 2006. — С. 168-169.
11. Слепова О. С. Влияние нарушений иммунитета на исход лечения при хирургических вмешательствах на глазах // II ЕвроАзиатская конф. по офтальмохирургии. — Екатеринбург, 2001. — С. 365-366.
12. Теплинская Л. Е., Филичкина Н. С., Матевосова К. С. Эффективность лечения увеитов препаратом суперлимф // Вестник офтальмологии. — 2005. — № 4. — С. 22.
13. Шевчук Н. Е. Роль цитокинов и иммуно-эндокринные взаимодействия при воспалительных и дистрофических процессах в оболочках глаза: Автореф.дис. ... д-ра мед. наук. — Уфа, 2009.—с. 17
14. Byrnes A. P., Wood M. J. A, Charlton H. M. Role of cells in inflammation caused by adenovirus vectors in the brain // Gene Therapy. — 1996. — № 3. — С. 644-651.
15. Khanna K. M., Lepisto A. J., Decman V, and Hendricks R. L. Immune control of herpes simplex virus during latency // Curr.Opin. Immunol. — 2003. — Vol. 3, № 16. — P. 463-469.
16. Mondai S. K. Mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma in conjunctiva // Ind. J. of Pathol. and Microbiol. — 2008. — Vol. 51, № 3. — P. 407-408.
17. Robbins P. D., Ghivizzani S. C. Viral vectors for gene therapy // Pharmacol.Ther. — 1998. — Т. 80, № 1. — С. 35-47.
18. Wadell G. Molecular epidemiology of human adenoviruses // Curr. Top. Microbiol. Immunol. — 1999. — Vol. 110. — P. 191-220.
LOCAL CYTOKINE STATE BY ADENOVIRAL EYE INFECTION
Kochergin S. A., Chernakova G. M., Klescheva E. A.,
ShapovalI. M., Mezenczeva M. V.
G Summary. 69 patients with adenoviral eye infection were followed up. 27 patients represented A group
(acute infection) and 42 — chronic infection (B group). The control group was represented by 39 healthy volunteers. In all cases, the diagnosis was confirmed by adenoviral DNA detection in polymerase chain reaction (PCR) (conjunctival scrape). mRNA cytokine expression was evaluated by reverse transcription and PCR. Cytokine quantity was estimated by the flow cytofluorometry method. We analyzed the quantity of 9 cytokines and the expression of 11 cytokine genes in conjunctival scrape on the 1st, 7th and 14th day. IFN-a, IFN-y, IL-2, IL-10, IL-12, IL-18 mRNAs rates were increased in A and B groups vs control group on the 1st day, besides, mRNA IL-1J3 rate was decreased in both groups vs control. We noted that IFN-a, and IFN-y gene expression rates changed in different ways with time in acute group in comparison to chronic one. In group A, IFN-a and IFN-y mRNA expression rates were increased by the 7th day, while in the group B, we observed cytokine gene rate decline from the 1st to the 14th day. The quantitative analysis showed the decrease in all cytokine quantities in groups A and B vs control group.
G Key words: adenovirus; acute and chronic adenoviral eye infection; local immune state; cytokines.
Сведения об авторах:
Кочергин Сергей Александрович — д. м. н., профессор, кафедра Kochergin Sergey Alexandrovich — doctor of medical science, офтальмологии. ГБОУ ДПО РМАПО Минздравсоцразвития professor. Department of Ophthalmology, State budget educa-России. 123995, г. Москва, ул. Баррикадная, д. 2/1. tional institution of further vocational education Russian Medical
E-mail: [email protected]. Academy of Post-Graduate Education. 123995, Moscow, Bar-
rikadnaya str., 2/1. E-mail: [email protected].
Чернакова Галина Мэлсовна — к. м. н., ассистент, кафедра офтальмологии. ГБОУ ДПО РМАПО Минздравсоцразвития России. 123995, г. Москва, ул. Баррикадная, д. 2/1. E-mail: [email protected].
Клещева Елена Александровна — аспирант, кафедра офтальмологии. ГБОУ ДПО РМАПО Минздравсоцразвития России. 123995, г. Москва, ул. Баррикадная, д. 2/1. E-mail: [email protected].
Шаповал Ирина Михайловна — к. вет. н., старший научный сотрудник, лаборатория микробиологии латентных инфекций, ФГБУ НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России. 123098, Москва, Гамалеи, 18. E-mail: [email protected].
Мезенцева Марина Владимировна — д. б. н.,
заведующая лабораторией, лаборатория микробиологии латентных инфекций. ФГБУ НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России. 123098, Москва, Гамалеи, 18. E-mail: [email protected].
Chernakova Galina Melsovna — candidate of medical science, assistant professor. Department of Ophthalmology, State budget educational institution of further vocational education Russian Medical Academy of Post-Graduate Education. 123995, Moscow, Barrikadnaya str., 2/1. E-mail: [email protected].
Klescheva Elena Alexandrovna — aspirant. Department of Ophthalmology, State budget educational institution of further vocational education Russian Medical Academy of Post-Graduate Education.123995, Moscow, Barrikadnaya str., 2/1. E-mail: [email protected].
Shapoval Irina Mihailovna — candidate of veterinary science, senior research scientist. Latent infections microbiology laboratory, Federal state budgetary institution Scientific-research Institute of epidemiology and microbiology n.a. N.F. Gamaleya. Moscow. 123098, Moscow, Gamalei st., 18. E-mail: [email protected].
Mezentseva Marina Vladimirovna — doctor of biological science, head of laboratory. Latent infections microbiology laboratory, Federal state budgetary institution Scientific-research Institute of epidemiology and microbiology n. a. N. F. Gamaleya. 123098, Moscow, Gamalei st., 18. E-mail: [email protected].
