CC BY
12УДК 612.017:616.594.171.2:616.155.392:616.411-006.441
ЛОКАЛЬНЫЙ СИНТЕЗ ЦИТОКИНОВ И МИКРОБНАЯ НАГРУЗКА ПРИ ОРОФАРИНГЕАЛЬНОМ КАНДИДОЗЕ У БОЛЬНЫх ГЕМОБЛАСТОЗАМИ
Данилова Е.Ю. (врач КДо)*, Шабашова н.В. (проф. кафедры), фролова Е.В. (зав. лаб.), учеваткина А.Е. (с.н.с.), филиппова л.В. (н.с.), Богомолова т.с. (зав. лаб.), Выборнова и.В. (н.с.)
НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
©Коллектив авторов, 2015
Орофарингеальный кандидоз часто наблюдают как острую и хроническую инфекции при системных врожденных, первичных и приобретенных дефектах иммунитета, а также при местных нарушениях противогрибковой резистентности. Однако это осложнение возникает далеко не у каждого индивидуума с известными факторами риска. Существует недостаток знаний об изменениях локального гомеостаза у больных гемобластозами при инфицировании грибами и молекулярных механизмов, лежащих в основе превращения этих комменсалов в патогены и развития инфекции. Лучшее понимание этих процессов может обеспечить адекватную и своевременную диагностику и оптимизацию лечения пациентов. Исследованы уровни цитокинов в слюне и контаминация ротовой полости грибами Candida spp. у больных гемо-бластозами. Установлено, что при разных видах гемобластозов снижен местный синтез интерферона-у (IFNy) с одновременным усилением продукции хемоаттрактанта моноцитарного хе-мотаксического фактора (МСР-1), хотя уровень его выработки ниже при развитии орофарингеального кандидоза. Высокая контаминация Candida spp. (более 500 КОЕ/мл) ротовой полости больных гемобластозами совпадала с увеличенным локальным синтезом ИЛ-6, ИЛ-8, G-CSF (Granulocyte-Colony Stimulating Factor). После химиотерапевтического лечения возрастание контаминации ротовой полости Candida spp. сопровождалось ослаблением синтеза MCP-1 и ИЛ-6 и повышением продукции ИЛ-8. Избыточное компенсаторное привлечение нейтрофилов в условиях супрессированного ответа Т-лимфоцитов может приводить к выраженному повреждению тканей и развитию орофарингеаль-ного кандидоза у больных гемобластозами.
Ключевые слова: гемобластозы, Candida spp., локальный иммунитет, орофарингеальный кандидоз
Контактное лицо: Данилова Евгения Юрьевна, тел.: (812) 303-51-41
LOCAL SYNTHESIS OF CYTOKINES AND MICROBIAL LOAD IN CASE
of oropharyngeal
CANDIDOSIS IN PATIENTS with HEMATOLOGICAL MALIGNANCIES
Danilova E.Y. (physician), shabashova N.v. (professor of the chair), Frolova E.v. (head of the laboratory), Uchevatkiva А. е. (senior scientific collaborator), filippova L.V. (scientific collaborator), Bogomolova T.s. (head of the laboratory), Vybornova I.V. (scientific collaborator)
Kashkin Research Institute of Medical Mycology of North-West State Medical University named after I.I. Mechnikov, St. Petersburg, Russia
©Collective of authors, 2015
Oropharyngeal candidosis often occurs as an acute and chronic infections with systemic congenital, primary and acquired immune defects, as well as violations of local antifungal resistance. However, this complication is not every individual with known risk factors. There is a lack of knowledge about the changes of local homeostasis in patients with hematological malignancies when infected with fungi and molecular mechanisms underlying the conversion of these pathogens and commensals in the development of infection. A better understanding of these processes can provide adequate and timely diagnosis and optimizing patient care. The levels of cytokines in oral fluid and mouth contamination by Candida spp. in patients with hematological malignancies have been investigated. It was found that the different types of leukemia reduced local IFNy synthesis with simultaneous amplification products chemoattractant MCP-1, although lower level of its production was following the development of oropharyngeal candidosis. High contamination by Candida spp. (more 500 CFU/ ml) of oral cavity from patient with haematological malignancies coincided with an increased local synthesis of IL-6, IL-8, G-CSF. After chemotherapy increase contamination of oral cavity by Candida spp. accompanied by a weakening of synthesis of MCP-1 and IL-6 and IL-8 increased production. Excessive compensatory involvement of neutrophils in a suppressed response of T-lymphocytes may lead pronounced tissue damage and the development of oropharyngeal candidosis in patients with hematological malignancies.
Key words: Candida spp., haematological malignancies, local immunity, oropharyngeal candidosis
введение
Орофарингеальный кандидоз (ОФК) - неоднозначное заболевание, хотя причиной его всегда являются грибы Candida spp., как правило, комменсалы, которые становятся агрессивными при условии нарушения физических или иммунологических механизмов резистентности [1]. Различают острый и хронический ОФК; тот и другой могут протекать в эритематозной, псевдомембранозной, гиперпластической формах, а также в виде ангулярного хейлита и срединного глоссита [2].
Как правило, ОФК является одним их характер-
ных признаков хронического кандидоза кожи и слизистых оболочек, или кожно-слизистого кандидоза (по международной номенклатуре - Chronic Mucocutaneous Candidiasis) [3]. Этот термин обобщает ряд синдромов с поверхностными персистирующими диффузными Candida-инфекциями кожи, ногтей и слизистых оболочек (СО), включая ротовую полость, причинами которых являются разнообразные врожденные дисфункции клеточно-опосредованного иммунитета [4]. С появлением и распространением ВИЧ-инфекции и СПИД, расширением иммуносу-прессивной терапии у реципиентов трансплантатов и больных онкогематологическими заболеваниями стали часто выявлять хронические формы псев-домембранозного ОФК, несмотря на применение антифунгальных препаратов. Псевдомембранозный кандидоз считают наиболее значимым в патологии новорожденных детей, у которых он также ассоциирован с повреждениями иммунной системы (ИС). Но он бывает и у взрослых людей при сахарном диабете и локальной иммуносупрессии, например, при использовании ингаляторных кортикостероидов для лечения бронхиальной астмы [5]. Хронический эритематозный ОФК (часто - асимптоматический) наблюдают у носителей зубных протезов (до 65%), хотя считают, что этому способствует недостаточная гигиена полости рта [2, 6]. Хронический гиперпластический ОФК проявляется билатерально на слизистой оболочке полости рта (СОПР) и может быть особенно важной проблемой, если ассоциирован с опухолями в поврежденных местах, хотя роль грибов в этом процессе остается не ясной. Острый эри-тематозный кандидоз - инфекция, проявляющаяся болезненными красными повреждениями на языке и деснах, ассоциирована с размножением C. albicans вследствие приема антибиотиков широкого спектра действия. Такие повреждения имеют тенденцию к спонтанному исчезновению после окончания этого лечения [7].
Таким образом, ОФК часто протекает как острая и хроническая инфекции при системных врожденных дефектах иммунитета, а также при возможных местных нарушениях противогрибковой резистентности. Однако ОФК возникает далеко не у каждого индивидуума с названными факторами риска [1-7]. Несмотря на последние достижения в области изучения микозов слизистой оболочки и системных грибковых заболеваний, существует недостаток знаний об изменениях гомеостаза после воздействия грибов и молекулярных механизмов, лежащих в основе превращения этих комменсалов в патогены, особенно - на локальном уровне. Лучшее понимание этих процессов может обеспечить адекватную и своевременную диагностику и оптимизацию лечения поверхностных микозов, особенно, если учесть возрастание их частоты, согласно материалам многочисленных современных публикаций и конференций [8].
Наибольшее число исследований в настоящее время посвящено изучению реакций локального
иммунитета в период комменсализма Candida spp. или системных реакций при ОФК у больных ВИЧ и СПИД [9-11]. Проблема развития и предупреждения ОФК у онкогематологических больных, существующая, несмотря на современную антимикотическую терапию, остается практически не разработанной, включая качественную статистику у отдельных групп больных, влияние вида заболевания и применяемой терапии, а также тяжести микробной нагрузки и состояния локального иммунитета.
С нашей точки зрения, основными причинами повышенной восприимчивости к Candida spp. у больных гемобластозами, в большей степени, могут быть местные изменения иммунитета, которые, в конечном итоге, определяют активизацию условно-патогенной микробиоты полости рта и развитие защитного воспаления в барьерных тканях. Однако нельзя исключить влияние особенностей микробоценоза ротовой полости, вирулентности возбудителя, характера фонового заболевания и схем химиотера-певтического лечения.
Цель работы - изучить ключевые иммунологические показатели в образцах слюны больных гемо-бластозами для оценки различий локальной защиты в отсутствии и при наличии осложнения в виде оро-фарингеального кандидоза, а также в зависимости от содержания Candida spp.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
С 2011 по 2014 гг. наблюдали 430 пациентов 1-го (зав. отд. - Шнейдер Т.В.) и 2-го отделений (зав. отд. - Зюзгин И.С.) гематологии Ленинградской областной клинической больницы, среди которых были выделены группы: больные гемобластозами, осложненными орофарингеальным кандидозом (20 чел.), и такие же больные без ОФК (53 чел.). Группу сравнения составили 16 соматически здоровых людей с санированной ротовой полостью.
Критериями диагностики орофарингеального кандидоза были клинические симптомы в сочетании с положительными результатами микологических исследований [2]: наличие почкующихся дрожжевых клеток, псевдомицелия и/или мицелия Candida spp. в мазках со слизистых оболочек ротовой полости и языка, окрашенных по Граму. Также из патологического материала выделяли и определяли культуру грибов Candida spp. с видовой идентификацией. Материалом для исследования микробной нагрузки служила нативная слюна, стандартное количество которой высевали на чашки Петри с 4%-ным агаром Сабуро и инкубировали при 37 оС. Через 24 часа подсчитывали количество КОЕ. Высокой микробной нагрузкой считали содержание КОЕ свыше 500/мл. Материалом для исследования местного иммунитета также была выбрана слюна, собранная в утренние часы натощак до чистки зубов, с помощью специальных стандартных систем для забора «Salivette sarstedt». После центрифугирования материала при 1200 об./мин. в течение 10 минут отделяли надоса-
дочную жидкость. В собранных биосубстратах методом твердофазного иммуноферментного анализа определяли уровни провоспалительных цитокинов - IFNy, ИЛ-17, ИЛ-8, ИЛ-6, TNFa, G-CSF и противовоспалительного цитокина ИЛ-10, а также моноци-тарного хемоаттрактантного протеина MCP-1.
Для статистического анализа полученных результатов была создана контрольная база данных в пакете Microsoft Office Excel 2007. Различия считали статистически значимыми при уровне значимости р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
ОФК выявили у больных острым миелоидным лейкозом (N=5), неходжкинской лимфомой (N=6), лимфогранулематозом (N=3), плазмоклеточной ми-еломой (N=5), хроническим лимфолейкозом (N=1). Чаще всего признаки кандидоза появлялись после применения химиотерапевтического комплекса на основе циклофосфана с винкристином (9 случаев ОФК из 20) при разной фоновой патологии. Но все больные острым миелоидным лейкозом, за исключением одного, имели осложнение в виде ОФК после 1 курса ПХТ на основе цитозара (5 из 6). Установлено, что в слюне больных гемобластозами как неослож-ненными, так и осложненными ОФК, имела место тенденция к снижению уровней спонтанно синтезируемых IFNy и ИЛ-10. Не обнаружили также существенного изменения уровней ИЛ-17, основного цитокина раннего инициативного воспаления, которое могло бы препятствовать инвазивному действию грибов на слизистую оболочку ротовой полости (Рис.1). Полученные данные могут быть показателем общей иммуносупрессии в результате основного заболевания.
Рис.1. Содержание цитокинов в слюне
При этом не отмечали достоверных различий (р>0,05) содержания цитокинов в зависимости от вида гемобластозов (Рис. 2, 3), а также от вида и длительности применяемой полихимиотерапии (Рис.4), хотя ОФК чаще возникал после 1-го и 2-го курсов ПХТ (у 13 человек из 20)
Рис.2. Концентрация !РЫу в зависимости от вида гемобла-
стоза. ОМЛ - острый миелоидный лейкоз; НХЛ - неход-жкинская лимфома; ЛГМ - лимфогранулематоз; ПМ - плаз-моклеточная миелома; ХЛЛ - хронический лимфолейкоз; ОЛЛ - острый лимфобластный лейкоз
un
(m)
1 t >
• Of Л0'
28' * , 28"
* * 26- I
24- •• • 2 V
22- * 22" ♦
: > ♦ . 20" * # M:
t lö; t 1 •
10" Î ! gi —1—1—>
ОМЛ НХЛ П M I ' I V1 I
им., их.! ДГм им 1.1 :
и ир jв ч j [ - j |и>еги в IL14
н abicitr ■ Ii IE.nil ; ¿ww.! j. I _ :.>p ; (]) <• i в 1*1 Ji' ' ir> t |.<..4iiiij|i| (111) I. i; ■
Рис.3. Концентрация ИЛ-10 в зависимости от вида гемобластоза
Рис.4. Концентрация !РЫу в зависимости от количества курсов ПХТ
Наряду с такими слабыми изменениями синтеза цитокинов, более синтезируемых Т-лимфоидными клетками, было обнаружено достоверное (р < 0,01) увеличение содержания МСР-1 в слюне у всех обследованных больных при более значительном увеличении показателя в случаях отсутствия осложнения (Рис. 5).
бов в слюне было ниже этого уровня (Рис. 6), причем минимальным содержание Candida spp. было у всех больных, страдающих неходжкинской лимфомой низкой степени злокачественности, независимо от пола и возраста (Рис. 7).
Рис.5. Концентрация MCP-1 в слюне
Возможно, менее выраженная продукция этого важного хемоаттрактанта и свидетеля воспалительной реакции могла быть причиной недостаточного поступления в СОПР клеток моноцитарно-макрофа-гального ряда, действующих в качестве фагоцитов, а также важнейших регуляторов Т-клеточных ответов в противодействии Candida spp. Не исключено, что снижение уровня IFNy, ключевого цитокина для развития адекватной реакции как врожденного, так и адаптивного иммунитета (Рис.1) в противогрибковой защите, было вторичным из-за ослабления этой регуляторной функции моноцитарно-макро-фагальных клеток. Эти отклонения, в целом, могли стать факторами, способствующими развитию ОФК на фоне снижения уровня противовоспалительного ИЛ-10. Последнее обстоятельство может быть свидетельством нарушения регуляторной функции на уровне взаимовлияний IFNy / ИЛ-10 в СОПР через синтез кинуренинов, что также могло увеличить вероятность развития ОФК [12]. Не следует исключать фактор нарушения синтеза антимикробных пептидов эпителиальными клетками СОПР, поскольку слюна является субстратом, содержащим, по-видимому, цитокины, выделяемые как эпителиоцитами, так и внутриэпителиальными иммунокомпетентными клетками [12, 13].
Известно, что развитие ОФК может зависеть от вирулентных свойств грибов, например, от их способности к пролиферации и адгезии к эпителию, а также свойству проникать между клеток эпителия и резистентности к антифунгальной терапии [14]. Поэтому для более глубокого понимания механизмов развития этого осложнения было исследовано количественное содержание Candida spp. в слюне больных гемобластозами без орофарингеального кан-дидоза при первичном поступлении до проведения химиотерапевтического лечения, что не освещено в доступной научной литературе.
Установлено, что высокая контаминация грибами (более 500 КОЕ/мл) была характерна только для 1/3 больных (15 из 33), у остальных - количество гри-
Рис. 6. Содержание Candida spp. в слюне
Рис.7. Контаминация ротовой полости Candida spp. в зависимости от вида гемобластоза
Поскольку не наблюдали существенного изменения уровней цитокина раннего ответа ИЛ-17 (Рис.1), изучили содержание в слюне ИЛ-6 - раннего участника защитного инициативного противогрибкового воспаления и ИЛ8 - известнейшего хемоаттрактан-та, ответственного за привлечение нейтрофилов в участки инфекции [15; Baggiolini M., et al.// J. Clin. Invest. - 1989. - Vol. 84, №4], и сопоставили результаты с обсемененностью ротовой полости больных Candida spp. Выявили, что в слюне всех больных гемобластозами повышено содержание ИЛ-6 по сравнению со здоровыми лицами (M=0). В группе больных гемобластозами, имеющих в ротовой полости микробную нагрузку менее 500 КОЕ/мл, достоверность отличий была <0,06 при M=8,2, в группе больных при КОЕ более 500/мл - < 0,04 при M=22,4 (Рис. 8). Следовательно, синтез ИЛ-6 был достаточно пропорционален контаминации ротовой полости
грибами.
При высокой микробной нагрузке грибами уровень ИЛ-8 - цитокина хронического воспаления и хемоаттрактанта в слюне также был достоверно выше, чем при низкой (р<0,05). Кроме того, отмечали положительную корреляцию между уровнями ИЛ-8 и количеством КОЕ (0,30). У пациентов с высокой микробной нагрузкой достоверно выше было и содержание G-CSF по сравнению со здоровыми людьми (<0,05). Как известно, G-CSF является естественным ростовым фактором для миелопоэза как на уровне кроветворных клеток предшественников, так и на уровне более дифференцированных потомков - нейтрофилов и моноцитов [12; Ziege S.U., et al. // Eur. J. Med. Res. - 2000. - Vol. 5]. У обследованных пациентов, имеющих высокую микробную нагрузку, были различные виды основного заболевания. По-видимому, увеличение выработки цитокинов, активирующих нейтрофилы и другие клетки врожденного иммунитета, может свидетельствовать о повышении противомикробной защиты в условиях дефицита других механизмов, но при этом быть причиной воспалительного повреждения СОПР, что, в свою очередь, может облегчать ее инвазию грибами [16].
Рис.8. Содержание цитокинов в слюне, в зависимости от микробной нагрузки
При повторном поступлении пациентов после курсов химиотерапевтического лечения микробная нагрузка возросла (Рис. 9), но содержание ИЛ-6 уменьшалось (Рис.10).
Рис. 9. Микробная нагрузка до и после ПХТ Возможно, этот факт может быть показателем снижения активности распознавания антигенов и инициативного воспаления. Но достаточно высокий уровень ИЛ-8 служит показателем реакции эпите-лиоцитов [15], которые могут таким путем дополнительно привлекать нейтрофильные гранулоциты. Чрезмерность воспаления иммунная система, возможно, сдерживает синтезом противовоспалительного ИЛ-10, что подтверждает наблюдаемая тенденция к повышению его продукции. Тем не менее, по результатам выявленных изменений показано, что контроль за ростом и размножением увеличивающегося количества Candida spp. на барьерных тканях может нарушаться, способствовать инвазии грибов через воспаленную слизистую с появлением клинических признаков Candida-инфекции.
Рис.10. Концентрация цитокинов в слюне, в зависимости от проведения ПХТ
Однако отсутствие данного осложнения в группе обследованных онкогематологических больных свидетельствует о том, что, даже в условиях высокой контаминации ротовой полости Candida spp., при изменении синтеза указанных цитокинов существует защитный барьер против ОФК, возможно, за счет увеличения синтеза антимикробных пептидов или других кандидацидных факторов [11-13; Edgerton M., et al. Antimicrob Agents Chemother. - 2000. - Vol. 44, №12], что составляет дальнейшую задачу в настоящем исследовании.
выводы
У больных гемобластозами снижен местный синтез IFNy - ключевого цитокина для развития адекватной реакции как врожденного, так и адаптивного иммунитета с одновременной активацией выработки одного из важнейших хемоаттрактантов и показателей функций моноцитарно-макрофагальных клеток МСР-1, но уровень выработки последнего ниже при развитии орофарингеального кандидоза.
Высокая контаминация Candida spp. (более 500 КОЕ/мл) в ротовой полости больных гемобластоза-
ми сопровождается увеличенным локальным синтезом ИЛ-6, ИЛ-8, G-CSF.
Возрастание контаминации ротовой полости грибами Candida spp. после курса химиотерапев-тического лечения в условиях ослабления синтеза MCP-1 и ИЛ-6, участников раннего инициативного воспаления, при повышенном содержании ИЛ-8 как фактора, способствующего компенсаторному избыточному привлечению нейтрофилов, соответственно, повреждению тканей, на фоне ингибированного ответа Т-лимфоцитов, может приводить к развитию ОФК у больных гемобластозами.
цитированная литература
1. Шабашова Н.В. Особенности локального иммунного ответа и его дефекты при орофарингеальном кандидозе (обзор)// Проблемы медицинской микологии - 2010. - Т. 12, №4. - С. 3-9.
2. Климко Н.Н. Микозы: диагностика и лечение, руководство для врачей. - М., 2007. - С. 129-130.
3. Glocker EO, Hennigs A, Nabavi M, A homozygous CARD9 mutation in a family with susceptibility to fungal infections //N. Engl. J. Med. - 2009. - Vol. 361, №18. - P. 1727-1735.
4. Шабашова Н.В. Грибы и иммунитет. Методическое пособие. - 2008. - C. 42-56.
5. Kaufman C.A., MarrK.A., Thorner A.R. Overview of Candida infections. - 2012 (UpToDate).
6. Михайлова Е.С., Шабашова Н.В., Фролова Е.В., Цимбалистов А.В. Роль Candida albicans в развитии непереносимости стоматологических конструкционных материалов// Проблемы медицинской микологии. - 2006. - Т. 8, №1.
- C. 25-30.
7. Guobis Z., Kareiviene V., Baseviciene N. Microflora of the oral cavity in patients with xerostomia // Medicina (Kaunas). -2011. - Vol. 47,№12. - P. 646-51.
8. Климко Н.Н., Козлова Я.И., Хостелиди С.Н. Распространенность тяжелых и хронических микотических заболеваний в Российской Федерации по модели Life Program // Проблемы медицинской микологии. - 2014. - Т.16, №1. - C. 3-8.
9. Fidel P.L. Candida-Host Interactions in HIV Disease: implications for oropharyngeal candidiasis // Advances in Dental Research. - 2011. - Vol. 23, №1. - P. 45-49.
10. Li X., Lei L., Tan D. Oropharyngeal Candida colonization in human immunodeficiency virus infected patients // APMIS.
- 2013. - Vol. 121, №5. - P. 375-402.
11. Chattopadhyay A. Salivary secretory leukocyte protease inhibitor and oral candidiasis in human immunodeficiency virus type 1-infected persons // Infect. Immun. - 2004. - Vol. 72, №4. - P. 1956-63.
12. Villar C.C, Dongari-Bagtzoglou A. Immune defence mechanisms and immunoenhancement strategies in oropharyngeal candidiasis// Expert Rev. in Molecular Med. - 2008. - Vol. 10. - P. 29.
13. Conti H.R., Baker О., Freeman A.F. New mechanism of oral immunity to mucosal candidiasis in hyper-IgE syndrome // Mucosal Immunol. - 2011. - Vol. 4, №4. - P. 448-455.
14. Naglik J.R., Moyes D.L., Wachtler B. Candida albicans interactions with epithelial cells and mucosal immunity // Microbes and Infection. - 2011. - Vol. 13, №12-13. - P. 963-976.
15. Dongari-Bagtzoglou A., Villar C.C., Kashleva H. Candida albicans-infected oral epithelial cells augment the anti-fungal activity of human neutrophils in vitro //Med Mycol. - 2005. - Vol. 43. - P. 545-549.
16. Romani L. Immunity to fungal infections // Nat. Rev. Immunol. - 2004. - Vol. 4, №1. - P. 1-23.
Поступила в редакцию журнала 03.02.2015 Рецензент: Е.В. Пронина
