CC BY
67
№ 4 - 2014 г.
14.00.00 медицинские и фармацевтические науки
УДК 616.361-092
ЛИТОЛИЗ ЖЕЛЧНЫХ КОНКРЕМЕНТОВ В ЭКСПЕРИМЕНТАХ
IN VITRO И IN VIVO
Е. В. РазмахнинL. Б. С. ХышиктуевL. Т. А. Орлова2
1ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Минздрава России
(г. Чита)
2ГУЗ «Городская клиническая больница № 1» (г. Чита)
С целью возможности использования камнерастворяющей смеси октановая кислота-глицерин для литолиза желчных конкрементов проведен ряд экспериментальных исследований in vitro и in vivo. Время растворения камней при использовании октановой кислоты 5,63 ± 2,10 мин в пересчете на 1 мг массы камня, при использовании смеси с глицерином — 5,76 ± 2,23. Время литолиза прямо пропорционально степени минерализации конкрементов. При литолизе in vivo на модели желчнокаменной болезни у кроликов методика эффективна через 4 суток лечения, при этом не выявлено местного и общетоксического действий.
Ключевые слова: желчнокаменная болезнь, литолиз, октановая кислота, камнерастворяющая смесь.
Размахнин Евгений Владимирович — кандидат медицинских наук, доцент кафедры факультетской хирургии ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия», рабочий телефон: 8 (3022) 41-11-05, e-mail: e.razmakhnin@mail.ru
Хышиктуев Баир Сергеевич — доктор медицинских наук, профессор кафедры химии и биохимии ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия», рабочий телефон: 8 (3022) 41-11-05, e-mail: bair-k@yandex.ru
Орлова Татьяна Альбертовна — врач клинико-диагностической лаборатории ГУЗ «Городская клиническая больница № 1», г. Чита, рабочий телефон: 8 (3022) 41-11-15, e-mail: deva1973@mail.ru
Введение. Желчнокаменная болезнь — одна из наиболее часто встречающихся в практике врача нозологических форм. Считают, что ею страдает более 10 % населения мира, причем число больных продолжает возрастать, увеличиваясь за каждое последующее десятилетие примерно в 2 раза. Несмотря на достигнутые успехи в желчной хирургии, применение традиционного хирургического и эндоскопического лечения сопровождается относительно высоким процентом осложнений и летальных исходов, особенно у пациентов пожилого и старческого возраста. Если в случаях изолированного
холецистолитиаза травматичность вмешательства значительно снижена использованием лапароскопических методик, то при наличии холедохолитиаза часто требуется выполнение обширной лапаротомии с ревизией желчных путей. Имеющиеся методики лапароскопической ревизии холедоха достаточно трудоемки и не всегда успешны. Использование эндоскопической папиллосфинктеротомии ведет в последующем к нарушению замыкательной функции сфинктера и развитию недостаточности большого дуоденального сосочка, к тому же не гарантирует удаление крупных конкрементов [2]. По данным разных авторов, осложнения после этой манипуляции возникают в 7,5-10,6 % случаев [1].
Следовательно, очевидна необходимость и актуальность поиска решений по малотравматичному удалению камней из общего желчного протока и желчного пузыря у лиц, имеющих высокий риск оперативного вмешательства.
Химическим растворением желчных камней занимались исследователи с начала прошлого столетия. Для контактного литолиза использовались различные препараты: диэтиловый эфир, гепарин, метил-трет-бутиловый эфир, этил-трет-бутиловый эфир, хлороформ, препараты желчных кислот, монооктаноин, клофибрат, цитрат и т. д. Обобщая предшествующий опыт, следует отметить невысокую эффективность использовавшихся растворителей, в основном действующих на холестериновые желчные конкременты и достаточно выраженные побочные эффекты, которые проявлялись в виде ульцерогенного, гепато- и нефротоксического эффектов, что не давало возможности широко использовать данный метод в клинике [4-6]. В связи с этим представляется перспективным поиск новых литолитических агентов, безопасных для пациента, использование которых позволит повысить эффективность лечения холедохолитиаза и калькулезного холецистита у пациентов с высоким риском оперативного лечения и сократить сроки реабилитации данных пациентов.
Материалы и методы. В качестве средства, используемого для производства контактного литолиза желчных конкрементов, нами предлагается смесь октановой кислоты с глицерином в соотношении 1:1.
Октановая кислота (н-Октановая кислота, каприловая кислота) C7H15COOH — одноосновная предельная карбоновая кислота (насыщенная жирная кислота), бесцветная маслянистая жидкость. Содержится в виде глицерида в коровьем масле, кокосовом жире, найдена в лимбургском сыре. Кристаллизуется на холоде, tra. 16,5 °C, ^ип. 237,5 °C [3]. Октановая кислота находит свое применение в медицине: комплекс с каприловой кислотой нормализует микробиоценоз и работу пищеварительной системы, участвует в профилактике развития заболеваний воспалительного характера, укрепляет иммунную систему. Является продуктом для синтеза а-липоевой кислоты в митохондриях. Входит в состав плазмозамещающего препарата «человеческий альбумин» в качестве вспомогательного вещества.
В эксперименте in vitro было обработано 107 конкрементов, извлеченных из желчного пузыря пациентов, оперированных по поводу желчнокаменной болезни лапароскопически. С помощью атомно-эмиссионного метода был определен минеральный состав камней. По преимущественному содержанию Са2+ отобранные конкременты были условно разделены на 3 группы: низко-, средне- и высокоминерализованные. Низкоминерализованные в основном представлены холестериновыми конкрементами. Средне- и высокоминерализованные конкременты являлись по составу смешанными и пигментными камнями.
Начиная с конкрементов низкой минерализации и предварительно взвешивая каждый камень, мы помещали их в пробирки и заливали соответствующим реактивом. При этом в течение нескольких часов поддерживалась постоянная температура, равная температуре тела человека. С целью повышения вязкости раствора (для более длительного поддержания концентрации растворяющего вещества в желчном пузыре) и снижения возможной токсичности октановой кислоты использовали её раствор в глицерине в соотношении 1:1. Вязкость раствора увеличивается за счет того, что вязкость глицерина в 254 раза превышает вязкость октановой кислоты.
В 1-й серии экспериментов (n = 56) использовалась чистая октановая кислота, во 2-й — смесь октановой кислоты с глицерином в соотношении 1:1 (n = 51).
В экспериментах in vivo соблюдались правила этичного и гуманного обращения с животными, используемыми в учебных или научных целях, согласно приказу Минвуза СССР № 742 от 13.11.1984, а также приказу Министерства здравоохранения Российской Федерации от 19.06.2003 № 267 «Правила лабораторной практики» в Российской Федерации (GLP), в которых содержатся основные правила обращения с животными.
В эксперименте in vivo использовано 35 половозрелых кроликов-самцов весом 2,8-3,4 кг. Под наркозом с добавлением местной анестезии выполнялась минилапаротомия в проекции дна желчного пузыря 3,0-4,0 см. Вскрывался желчный пузырь, подсаживался конкремент, извлеченный из желчного пузыря пациентов, оперированных по поводу желчнокаменной болезни, после чего накладывалась холецистостома. Лапаротомная рана ушивалась послойно, наглухо. В 5-ти случаях были подсажены среднеминерализованные конкременты, в 25-ти — высокоминерализованные.
Во время операции всем кроликам производился забор крови для биохимического исследования. В крови исследовалось содержание билирубина, активность аминотрансфераз, содержание мочевины, креатинина и активность амилазы. На третьи сутки после операции через холецистостому начинали вводить камнерастворяющую смесь, состоящую из октановой кислоты с глицерином в соотношении 1:1 в объеме 0,5 мл 1 раз в день, из расчета 0,2 мл/кг массы, что примерно соответствует объему желчного пузыря, после чего дренаж пережимали. В начале эксперимента введение продолжали до 5-ти дней, после чего кроликов забивали, производилось вскрытие грудной и брюшной полостей с морфологическим исследованием органов и тканей. Так как растворение камней происходило полное, постепенно уменьшали количество дней введения до двух. Для гистологического исследования забирали стенку желчного пузыря, желудка, тонкой кишки, ткань печени, сердца, почек, головного мозга, а также забирали кровь для контрольного биохимического анализа. Обзорные препараты, окрашенные гематоксилином и эозином, использовали для общей оценки состояния исследуемых тканей. Окрашивание препаратов пикрофусином по Ван Гизон использовали для выявления и дифференцировки соединительно-тканных структур. С помощью ШИК-реакции выявляли мукополисахаридные компоненты.
Для контроля было использовано 5 кроликов с подсаживанием конкрементов в просвет желчного пузыря без наложения холецистостомы и соответственно без введения растворителя.
Для статистической обработки результатов применяли непараметрические методы: сравнение независимых выборок с помощью U-критерия Манна-Уитни и Вилкоксона для парных признаков.
Результаты и обсуждение. В экспериментах in vitro для более удобной оценки
результатов нами был введен условный коэффициент (К'), отражающий время растворения конкремента в минутах в пересчете на 1 мг массы камня. В 1-й серии экспериментов с использованием чистой октановой кислоты выяснилось, что в среднем К' = 5,63 ± 2,10 (n = 56). Отмечено, что К' в группе конкрементов с низкой степенью минерализации при использовании октановой кислоты равен 4,40 ± 2,04 (n = 19), в группе со средней степенью минерализации К' = 5,87 ± 1,76 (n = 17), в группе с высокой степенью минерализации К' = 6,70 ± 1,87 (n = 20).
При использовании раствора октановой кислоты в глицерине в соотношении 1 : 1 время растворения конкрементов осталось прежним: К' = 5,76 ± 2,23 (n = 51) и соответственно при низкой степени минерализации К' = 4,26 ± 1,18 (n = 15), при средней К' = 6,04 ± 2,41 (n = 17), при высокой К' = 6,97 ± 2,36 (n = 19). Оптимальное соотношение октановая кислота : глицерин — 1 : 1 выведено экспериментально, это максимально возможная доля глицерина, при которой скорость растворения конкрементов осталась прежней. При увеличении доли глицерина литолитический эффект не наступает.
В эксперименте in vivo низкоминерализованные конкременты растворились во всех случаях введения раствора октановой кислоты в глицерине, среднеминерализованные при введении в течение 3-х дней и более, высокоминерализованные — на 4-е сутки лечения. Биохимические показатели, отражающие общетоксическую реакцию, значимо не изменились.
Во всех случаях успешного литолиза при морфологическом исследовании желчного пузыря отмечались стереотипные изменения в виде незначительного и умеренно выраженного острого экссудативного воспаления и умеренные дистрофические изменения покровного эпителия. В мышечной оболочке не отмечалось значимых особенностей. Лишь на серозе фиксировались изменения, отражающие постоперационный спаечный процесс. Гистоархитектоника всех исследованных органов (желудка, тонкой кишки, сердца, почек, головного мозга) была сохранена, их ткани и клетки не имели значимых патологических изменений. Только в паренхиме печени отмечались явления белковой дистрофии части гепатоцитов.
Таким образом, токсическое воздействие камнерастворяющей смеси октановая кислота-глицерин незначительное и не ведет к выраженным макро- и микроскопическим патологическим изменениям, также не наблюдается общетоксического воздействия.
Уменьшение токсичности октановой кислоты при смешивании её с глицерином обусловлено образованием значительного количества водородных связей, возникающих между ОН-группой кислоты и кислородом одного из гидроксилов глицерина, а также между ОН-группой глицерина и кислородом карбоксильной группы кислоты. Эти взаимодействия снижают реакционную способность октаноата и, следовательно, его токсичность [3].
В клинике подобную методику можно использовать при высоком риске оперативного лечения калькулезного холецистита, у пациентов пожилого и старческого возраста с тяжелой сопутствующей патологией сердечно-сосудистой и дыхательной систем. Особенно актуально подобное лечение будет при острых формах холецистита. Возможно наложение микрохолецистостомы под ультразвуковым наведением, промывание просвета желчного пузыря, купирование острого воспалительного процесса с последующим введением растворителя и контролем за растворимостью камней при помощи УЗИ, либо используя фистулохолангиографию. Учитывая то, что лечение желчнокаменной болезни в этом случае не радикальное, в последующем требуется длительный прием препаратов
желчных кислот для профилактики рецидивов.
При холедохолитиазе, особенно при резидуальных камнях холедоха при стремлении к сохранению сфинктерного аппарата фатерова сосочка, возможно введение камнерастворяющей смеси через гепатикохоледохостому, установленную чрескожно, чреспеченочно под ультразвуковым наведением, либо через назобилиарный дренаж, установленный эндоскопически через фатеров сосок. Контроль над растворением конкрементов также можно осуществлять при помощи фистулохолангиографии либо эндоскопической ретроградной панкреатохолангиографии.
Список литературы
1. Андриенко А. Д. Пути улучшения результатов лечения острого холецистита, осложненного холедохолитиазом, у больных пожилого и старческого возраста : автореф. дис. ... канд. мед. наук / А. Д. Андриенко. — Хабаровск : ДГМУ, 2009. — 23 с.
2. Канищев Ю. В. Диагностическая и оперативная эндоскопия желчнокаменной болезни и ее осложнений : автореф. дис. ... д-ра мед. наук / Ю. В. Канищев. — Курск : КГМУ, 2008. — 36 с.
3. Курц А. Л. Органическая химия / А. Л. Курц, О. А. Реутов. — М. : «Бином. Лаборатория знаний», 2010. — 544 с.
4. Лечение больных в пожилом и старческом возрасте с резидуальными камнями холедоха / В. Н. Николаев [и др.] // Материалы II съезда хирургов Южного Федерального округа, 2009. — Пятигорск, 2009. — С. 189-190.
5. Размахнин Е. В. Использование медикаментозного литолиза для лечения желчнокаменной болезни / Е. В. Размахнин // Забайкальский мед. вестн. — 2010. — № 1. — С. 29-34.
6. Ташкинов Н. В. Пути оптимизации лечения острого холецистита, осложненного холедохолитиазом, у пациентов пожилого и старческого возраста / Н. В. Ташкинов, Е. В. Николаев, Н. И. Бояринцев // Дальневосточный мед. журн. — 2009. — № 1. — С. 44-46.
LITHOLYSIS OF CHOLIC CONCREMENTS IN EXPERIMENTS IN VITRO AND
IN VIVO
E. V. Razmakhnin1. B. S. Hyshiktuyev'. T. A. Orlova2
1SBEIHPE «Chita State Medical Academy» Ministry of Health (Chita) 2SHE «City Clinical
Hospital № 1» (Chita)
A series of pilot studies in vitro and in vivo is performed for the purpose of possibility of use of saxifragant admixture, octane glycerinum acid for a litholysis of cholic concrements. Time of dissolution of stones at using octane acid 5,63 ± 2,10 min in terms of 1 mg of mass of a stone, at using the admixture with Glycerinum — 5,76 ± 2,23. Time of litholysis is in direct proportion to degrees of mineralization of concrements. At in vivo litholysis on cloelithiasis model at rabbits the technique is effective in 4 days of treatment, thus local and all-toxic actions were not revealed.
Keywords: cloelithiasis, litholysis, octane acid, saxifragant admixture.
About authors:
Razmakhnin Evgeny Vladimirovich — candidate of medical science, assistant professor of faculty surgery chair at SBEI HPE «Chita State Medical Academy» Ministry of Health, office phone: 8 (3022) 41-11-05, e-mail: e.razmakhnin@mail.ru
Khyshiktuyev Bair Sergeyevich — doctor of medical science, professor of chemistry and biochemistry chair at SBEI HPE «Chita State Medical Academy» Ministry of Health, office phone: 8 (3022) 41-11-05, e-mail: bair-k@yandex.ru
Orlova Tatyana Albertovna — doctor of clinicodiagnostic laboratory at SHE «City Clinical Hospital № 1», office phone: 8 (3022) 41-11-15, e-mail: deva1973@mail.ru
List of the Literature:
1. Andriyenko A. D. Ways of improvement of results of treatment of acute cholecystitis complicated with choledocholithiasis at patients of advanced and senile age: theses.... cand. of medical science / A. D. Andriyenko. — Khabarovsk: DSMU, 2009. — 23 P.
2. Kanishchev Y. V. Diagnostic and operational endoscopy of cloelithiasis and its complications: theses.... Dr. of medical science / Y. V. Kanishchev. — Kursk: KSMU, 2008. — 36 P.
3. Kurts A. L. Organic chemistry / A. L. Kurts, O. A. Reutov. — M.: «Binomial. Laboratory of knowledge», 2010. — 544 P.
4. Treatment of patients at advanced and senile age with residual stones of the choledochus / V. N. Nikolaev [etc.] // Materials II of congress of surgeons of the Southern Federal District, 2009. — Pyatigorsk, 2009. — P. 189-190.
5. Razmakhnin E. V. Use of medicamental litholysis for treatment of cloelithiasis / E. V. Razmakhnin // Transbaikal medical bulletin. — 2010. — № 1. — P. 29-34.
6. Tashkinov N. V. Ways of optimization of treatment of the acute cholecystitis complicated by a choledocholithiasis at patients of advanced and senile age / N. V. Tashkinov,
E. V. Nikolaev, N. I. Boyarintsev//Far East medical журн. — 2009. — № 1. — P. 44-46.
