CC BY
0
УДК 577.19
Липополисахарид-индуцированное острое повреждение легких: анализ особенностей развития и возможность подавления аптамером к TNF-a
А. В. Сенькова*, И. А. Савин, Е. Л. Черноловская, А. С. Давыдова, М. И. Мещанинова, А. Бишани, М. А. Воробьева, М. А. Зенкова
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, 630090 Россия
*E-mail: alsenko@mail.ru Поступила в редакцию 22.03.2024 Принята к печати 15.04.2024 DOI: 10.32607/actanaturae.27393
РЕФЕРАТ Острое повреждение легких (ОПЛ) является специфической формой воспаления, которое характеризуется диффузным повреждением альвеол, некардиогенным отеком легких, а также легочным и системным воспалением. Патогенез ОПЛ включает развитие каскадной воспалительной реакции, сопровождающейся подъемом уровней провоспалительных цитокинов и хемокинов на локальном и системном уровне. Разработка молекулярно-генетических инструментов, направленных на ключевые компоненты цитокинового сигналинга в качестве мишени, представляется перспективным подходом к терапии ОПЛ. В работе проанализированы особенности развития липополисахарид (ЛПС)-индуцированного ОПЛ у мышей, а также возможность его подавления аптамером к провоспа-лительному цитокину TNF-a. Показано, что уровень TNF-a резко повышается и остается стабильно высоким при развитии ОПЛ, а морфологические признаки воспаления в дыхательной системе мышей, вызванные ЛПС, наиболее выражены через 24 ч после индукции. Интраназальное введение мышам с ОПЛ аптамера к TNF-a, конъюгированного с полиэтиленгликолем 40 кДа (PEG-aptTNF-a), вызывало уменьшение интенсивности воспалительных изменений в ткани легких. Оценка уровней потенциальных генов-мишеней TNF-a (Usp18, Trafl, Tnfaip3) показала повышение их экспрессии в легких при развитии ОПЛ и снижение - при введении PEG-aptTNF-a. Таким образом, топическое использование аптамеров, направленных к TNF-a, может служить эффективным инструментом терапии ОПЛ и других воспалительных заболеваний легких.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА острое повреждение легких, провоспалительные цитокины, аптамерные конструкции, гены-мишени.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ОПЛ - острое повреждение легких; ОРДС - острый респираторный дистресс-синдром; TNF-a - фактор некроза опухоли альфа; aptTNF-a - аптамер к TNF-a; PEG - полиэтиленгли-коль; ЛПС - липополисахарид; БАЛЖ - бронхоальвеолярная жидкость.
ВВЕДЕНИЕ
Острое повреждение легких (ОПЛ), а также его последствие - острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) - являются специфической формой воспаления легких, которое характеризуется диффузным повреждением альвеол, некардиоген-ным отеком легких, а также легочным и системным нейтрофил-ассоциированным воспалением [1, 2]. Этиологическими факторами ОПЛ и ОРДС могут быть различные стимулы и заболевания, такие, как бактериальные и вирусные пневмонии [3, 4], механическая вентиляция [5, 6], воздействие хи-
микатов [7, 8], острая травма головного мозга [9], сепсис [10, 11], острый панкреатит [12] и многие другие патологии. В последние годы рост показателей заболеваемости и смертности от ОПЛ/ОРДС связан с пандемией новой коронавирусной инфекции (COVID-19), вызванной коронавирусом, ассоциированным с тяжелым острым респираторным дистресс-синдромом (SARS-CoV-2) [13, 14]. Патогенез ОПЛ/ОРДС включает развитие местной и системной каскадной воспалительной реакции, сопровождающейся подъемом уровней провоспалительных цитокинов (ТОТ-а, №N-7, ^-6, аМ^Ц G-CSF)
и хемокинов (СХ^10ДР10, М1Р-1а, CCL2), вплоть до критических значений, приводящих к развитию полиорганной недостаточности [14-16].
В настоящее время терапия ОРДС и сопутствующих ему иммунных нарушений в основном симптоматическая, направлена на облегчение симптомов и часто включает механическую вентиляцию легких и введение кортикостероидных гормонов. Перспективным подходом к лечению указанной патологии может быть использование молеку-лярно-генетических инструментов, направленных на ключевые цитокины в качестве мишени. Одним из таких инструментов являются моноклональ-ные антитела к TNF-a, ^-6, ^-1Р, №N-7 и другим компонентам цитокинового сигналинга [17, 18]. Олигонуклеотидные аптамеры представляют собой другой класс биомолекул, селективно узнающих мишень, которые в настоящее время рассматриваются в качестве потенциальной альтернативы антителам для создания таргетных терапевтических средств. От антител аптамеры выгодно отличают воспроизводимый химический синтез и стабильность ключевых характеристик, возможность введения в их состав дополнительных химических модификаций для регуляции времени жизни аптамера в организме с сохранением его сродства к молекуле-мишени [19, 20]. Важно отметить, что по своей природе аптамеры являются нуклеиновыми кислотами, что позволяет дополнительно регулировать их функциональную активность, используя комплементарный олигонуклеотид-антидот [21, 22]. Такой набор свойств вызывает интерес к использованию аптамеров для подавления активности растворимых сывороточных белков, в том числе ассоциированных с воспалением [23, 24].
В настоящей работе проанализированы особенности развития ЛПС-индуцированного ОПЛ у мышей, а также возможность его подавления аптамером к провоспалительному цитокину TNF-a. Показано, что TNF-a является ключевым игроком в развитии ОПЛ, а интраназальное введение мышам с ОПЛ
аптамера к TNF-a, конъюгированного с полиэти-ленгликолем 40 кДа (PEG-aptTNF-a), подавляет развитие воспаления в дыхательной системе экспериментальных животных.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Синтез ДНК-аптамера к TNF-a и контрольного олигонуклеотида
Нуклеотидные последовательности олигодезокси-рибонуклеотидов, использованных в работе, представлены в табл. 1. Контрольный неаптамерный олигонуклеотид со случайной последовательностью был сгенерирован на основе ДНК-аптамера aptTNF-a с использованием сервиса (https://www. gensm/tools/create-scrambled-sequence).
Олигонуклеотиды были синтезированы твердофазным фосфитамидным методом в масштабе 0.4 мкмоль на автоматическом ДНК/ РНК-синтезаторе ASM-800 («Биоссет», Россия) по протоколу, оптимизированному для данного прибора, с использованием Р-цианэтил-^^ диизопропилфосфитамидов 5'-^защищенных 2'-дезоксирибонуклеозидов (Glen Research, США). В качестве полимерного носителя использовали стеклянные частицы CPG (controlled pore glass) с диаметром пор 500 А с присоединенным через 5'-гидроксильную группу З'-О-диметокситритилтимидином (Glen Research). Олигонуклеотиды, содержащие на 5'-конце остаток аминогексанола, синтезировали с использованием коммерчески доступного модификатора 6-(трифторацетиламино)-гексил-(2-цианоэтил)-^Д-диизопропил)-фосфитамида (Glen Research). После синтеза олигонуклеотиды отделяли от носителя и удаляли защитные группы обработкой 40% водным раствором метиламина (300 мкл) в течение 15 мин при 65°C. Полностью деблокированные олигонуклеотиды очищали методом препаративного электрофореза в денатурирующем 15% полиакриламидном геле (ПААГ).
Таблица 1. ДНК-аптамер к TNF-a, неаптамерный скрамблированный олигодезоксирибонуклеотид и их конъюгаты с PEG
Аптамер Нуклеотидная последовательность, 5'-3'
PEG-aptTNF-a PEG-NH,-(CH,)B-GCG CCA CTA CAG GGG AGC TGC CAT TCG AAT AGG TGG GCC GCT 2 4 2'6 inv
aptTNF-a NH,-(CH,)B-GCG CCA CTA CAG GGG AGC TGC CAT TCG AAT AGG TGG GCC GCT 2 4 2'6 inv
PEG-Scr PEG-NH,-(CH,)B-AGA GGC GGT ATG ACC AGG CTA ATC GGC CGA GCC TCC GTG CGT 2 4 2'6 inv
Scr NH,-(CH,)B-AGA GGC GGT ATG ACC AGG CTA ATC GGC CGA GCC TCC GTG CGT 2 4 2'6 inv
PEG - остаток полиэтиленгликоля 40 кДа; T.nv - З'-концевой остаток тимидина, соединенного с соседним нуклео-тидом З'-З'-фосфодиэфирной связью.
Синтез конъюгатов с полиэтиленгликолем 40 кДа
Для синтеза пегилированных конъюгатов к раствору 5'-аминомодифицированного олигонукле-отида (0.1 мкмоль) в 0.1 М тетраборатном буфере (рН 9.5) добавляли раствор 1 мкмоль N-гидроксисукцинимидного эфира линейного по-лиэтиленгликоля (PEG) с молекулярной массой 40 кДа (Sigma-Aldrich, США) в диметилформами-де (Sigma-Aldrich). Реакционную смесь инкубировали при перемешивании при 25°С в течение 16 ч. Полученные конъюгаты очищали от избытка реагентов с помощью электрофореза в денатурирующем 12% ПААГ с последующей элюцией водой и концентрированием с использованием ультрацентрифужных модулей Amicon 10K (Merck, США). Очищенные конъюгаты перед введением животным стерилизовали фильтрованием через фильтр с диаметром пор 0.22 мкм.
Лабораторные животные
В работе использовали 6-8-недельных мышей-самок линии Balb/C разведения вивария Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск, Россия). Животных содержали по шесть особей в клетке в хорошо освещенном помещении. Мыши имели свободный доступ к еде и воде. Все процедуры с животными проводили в соответствии с рекомендациями по правильному использованию и уходу за лабораторными животными (Директива ЕС 2010/63/ЕС). Эксперименты на животных одобрены межинститутской Комиссией по биоэтике Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск, Россия) (протокол № 56 от 10.08.2019 г.).
ЛПС-индуцированное острое повреждение легких
Острое повреждение легких (ОПЛ) у мышей индуцировали путем интраназального (и/н) введения ЛПС (055:B5, Sigma-Aldrich) в дозе 10 мкг/мышь под изофлюрановой анестезией. В эксперименте по исследованию динамики воспалительных изменений в дыхательной системе мышей выводили из эксперимента через 6, 16 и 24 ч после индукции и производили забор бронхоальвеолярной жидкости (БАЛЖ), сыворотки крови и ткани легких для последующего анализа. В эксперименте по исследованию противовоспалительной активности аптамеров к TNF-a мышам через 1 ч после индукции ОПЛ и/н вводили аптамер aptTNF-a в дозе 1 мг/кг или его конъюгат PEG-aptTNF-a в дозах 1 и 5 мг/кг. Мышей с ОПЛ без лечения и получавших соответствующие скрамблированные олигонуклеотиды (Scr в дозе 1 мг/кг и PEG-Scr в дозах 1 и 5 мг/кг) использова-
ли в качестве контроля. Все препараты вводили и/н в 50 мкл физиологического раствора под изофлю-рановой анестезией. Мышей выводили из эксперимента через 24 ч после индукции и производили забор материала (БАЛЖ и ткань легких) для последующего анализа. Всего было по шесть мышей в каждой группе.
Анализ бронхоальвеолярной жидкости
Легкие мышей из контрольных и экспериментальных групп промывали 1 мл холодного физиологического раствора. Собранную БАЛЖ центрифугировали на 1500 об/мин в течение 10 мин при 4°C, супернатант собирали для иммуноферментного анализа (ИФА). Осадок клеток ресуспендировали в 50 мкл физиологического раствора и определяли общее число лейкоцитов (*105 клеток/мл) в камере Горяева после разбавления раствором Тюрка в соотношении 1 : 20.
Оценка уровня провоспалительных цитокинов методом ИФА
Уровни провоспалительных цитокинов TNF-a и IL-6 определяли в образцах БАЛЖ с помощью наборов для проведения ИФА (#BMS607-3 и #KMC0061, Thermo Fisher Scientific, США) в соответствии с инструкциями производителя. Абсорбцию измеряли на длине волны 450 нм с помощью спектрофотометра Multiscan RC (Thermo Labsystems, Финляндия).
Оценка профиля цитокинов
Для оценки уровня провоспалительных ци-токинов и хемокинов в БАЛЖ использовали LEGENDplexTM Mouse Inflammation Panel (13-plex) (Biolegend, США) в соответствии с инструкцией производителя и проточный цитометр NovoCyte 3000 (ACEA Bioscience, США). Данные анализировали с помощью программного обеспечения Legendplex online software.
Гистология
Ткань легких фиксировали в 10% забуференном формалине, дегидратировали в растворах этанола и ксилола восходящей концентрации и заключали в парафин HISTOMIX. Парафиновые срезы толщиной до 5 мкм нарезали на микротоме Microm HM 355S и окрашивали гематоксилином и эозином. Все гистологические препараты были исследованы и отсканированы с помощью микроскопа Axiostar Plus с цифровой камерой AxioCam MRc5 на увеличении х200.
Оценку интенсивности воспалительных изменений в легких проводили полуколичественным методом с использованием следующей шкалы: 0 - патологические изменения отсутствуют, 1 - воспаление вы-
ражено слабо, 2 - воспаление выражено умеренно, 3 - выраженные воспалительные изменения. Всего проанализировано по пять полей зрения в каждом образце (по 30 полей зрения в каждой группе).
Определение уровней экспрессии генов методом ОТ-ПЦР в реальном времени
Уровни мРНК генов Usp18, Traf1, Tnfaip3 и Hprt в ткани легких определяли методом количественной обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) в реальном времени. Суммарную РНК выделяли из легких экспериментальных животных с помощью реагента TRIzol согласно инструкции производителя с предварительной гомогенизацией (гомогенизатор FastPrep-24TM 5G с адаптером QuickPrep 24, MP Biomedicals, США). кДНК синтезировали с использованием RT-буфера и ревертазы M-MuLV-RH («Биолабмикс», Россия) согласно инструкции производителя. ОТ-ПЦР в реальном времени проводили с использованием ма-стер-микса HS-qPCR (х2) («Биолабмикс») согласно инструкции производителя. Амплификацию проводили с использованием температурных условий: (1) - 94°С, 5 мин; (2) 94°С, 10 с; (3) 60°С, 30 с (50 циклов) на амплификаторе C1000 Touch с модулем CFX96 (Bio-Rad, США). Данные обрабатывали с помощью программного обеспечения BioRad CFX Manager. Последовательности олигонуклеотидов, использованных в качестве праймеров, приведены в табл. 2. Относительный уровень экспрессии генов нормализовали на уровень экспрессии Hprt по методу AACt.
Статистический анализ
Статистический анализ проводили с помощью двухстороннего непарного i-теста по Стьюденту в программном обеспечении Microsoft Excel. Значения p < 0.05 считали статистически значимыми. Данные
представлены как среднее значение ± стандартное отклонение.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Цитокиновый профиль и динамика воспалительных изменений в дыхательной системе мышей с ЛПС-индуцированным острым повреждением легких
Для оценки уровня цитокинов и интенсивности воспаления в дыхательной системе мышей в динамике индуцировали острое повреждение легких (ОПЛ) путем интраназального (и/н) введения ЛПС (10 мкг/мышь) с последующим забором материала через 6, 16 и 24 ч после индукции (рис. 1А). Установлено, что уже через 6 ч после введения ЛПС уровень TNF-a в бронхоальвеолярной жидкости (БАЛЖ) повышался в 21 раз по сравнению со здоровыми животными и составлял 3.4 нг/мл, оставаясь приблизительно на том же уровне вплоть до 24 ч после индукции. Уровень IL-6 также повышался через 6 ч после введения ЛПС до 2 нг/мл, а затем постепенно снижался до 1.3 нг/мл к 24 ч после индукции, что многократно превышает уровень IL-6 у здоровых животных (рис. 1Б, левая панель). Оценка общего числа лейкоцитов в БАЛЖ показала, что максимальное значение данного показателя приходилось на 24 ч после индукции: введение ЛПС вызывало повышение числа лейкоцитов в 8.6 раза по сравнению со здоровыми животными (рис. 1Б, средняя панель). В сыворотке крови мышей с ОПЛ TNF-a и IL-6 детектировались во всех временных точках на крайне низком уровне, сопоставимом с уровнями у здоровых животных (рис. 1Б, правая панель).
Определение цитокинового профиля БАЛЖ мышей с ОПЛ в динамике с помощью мультиплексного ИФА показало, что и/н введение ЛПС вызывает
Таблица 2. Специфические праймеры для проведения ОТ-ПЦР в реальном времени
Ген Тип праймера Нуклеотидная последовательность
Usp18 Forward 5'- GCCCTCATGGTCTGGTTG-3'
Probe 5'-((5,6)-FAM)-ACGTGTTGCCTTAACTCCTTGCTTCA-BHQ1-3'
Reverse 5'- CACTTCTCTTCCTCTCTTCTGC-3'
Traf1 Forward 5'- AGATCACCAATGTCACCAAGC-3'
Probe 5'-((5,6)-FAM)-ACTGTCAGCCTCTTCTCTCCAGCTT-BHQ1-3'
Reverse 5'- CATCCCCGTTCAGGTACAAG-3'
Tnfaip3 Forward 5'- AGCCAGCACTTTGTACCC-3'
Probe 5'-((5,6)-FAM)-AGTCTTCAAACCTACCCCGGTCTCT-BHQ1-3'
Reverse 5'- GCTTTTCCTTCATCTCATTCTCAG-3'
Hprt Forward 5'-CCCCAAAATGGTTAAGGTTGC-3'
Probe 5'- ((5,6)-ROX)-CTTGCTGGTGAAAAGGACCT-3'-BHQ2
Reverse 5'-AACAAAGTCTGGCCTGTATCC-3'
л
Balb/C
0 ч ▲
ЛПС 10 мкг/мышь и/н
6 ч 16 ч 24 ч
т т т
Бронхоальвеолярная жидкость Сыворотка крови Гистология легких
Бронхоальвеолярная жидкость
ы н и к о т и ZI
3.5 3 2.5 2 1.5 1
0.5 0
В
IL-23-IL-1a IFN-y TNF-a MCP-1 IL-12p70 IL-1 ß IL-10 IL-6 IL-27 IL-17A IFN-ß GM-CSF
TNF-a j IL-6
6 ч
16 ч 24 ч
л м
и zS о к
е Л
1
m
6 ч 16 ч 24 ч
мл г/
н
^ 0.2 ы ин
токи
n os
10000
8000
6000
4000
2000
Здоровые
Сыворотка крови
i+i
+1
du
TNF-a IL-6
а
К 6 ч 16 ч 24 ч 6 ч
штм-ш&т
6 ч
16 ч 24 ч К
Рис. 1. Цитокиновый профиль и воспалительные изменения в дыхательной системе мышей с ЛПС-индуцированным острым повреждением легких в динамике. А - схема эксперимента. У мышей линии Balb/C индуцировали острое повреждение легких (ОПЛ) путем интраназального (и/н) введения ЛПС (10 мкг/мышь). Забор материала проводили через 6, 16 и 24 ч после индукции. Б - уровни провоспалительных цитокинов (TNF-a и IL-6) и общее число лейкоцитов в БАЛЖ, а также уровни TNF-a и IL-6 в сыворотке крови мышей с ОПЛ через 6, 16 и 24 ч после индукции. В - цитокиновый профиль БАЛЖ мышей с ОПЛ в динамике, оцененный с помощью мультиплексного ИФА. Данные приведены в виде пг/мл. Г - гистологический анализ ткани легких мышей с ОПЛ через 6, 16 и 24 ч после индукции. Окр. гематоксилином и эозином, ув. Х200. Черными стрелками обозначена воспалительная инфильтрация. К - контроль (здоровые животные)
Б
К
К
0
значимое повышение только двух провоспалитель-ных цитокинов: TNF-a и IL-6. Причем уровень TNF-a оставался высоким на протяжении всего периода наблюдения, тогда как уровень IL-6 снижался уже через 16 ч после индукции (рис. 1В). Уровни остальных цитокинов (IL-23, IL-1a, IFN-y, MCP-1, IL-12p70, IL-1ß, IL-10, IL-27, IL-17A, IFN-ß, GM-CSF) не изменялись.
Гистологический анализ ткани легких мышей с ОПЛ показал, что введение ЛПС вызывает развитие патологических изменений в дыхательной
системе, представленных воспалительной гра-нулоцитарной инфильтрацией, деструктивными (десквамация альвеолярного эпителия) и дис-циркуляторными (венозное полнокровие, отек и кровоизлияния) нарушениями (рис. 1Г). Следует отметить, что на разных сроках наблюдения степень выраженности данных изменений была различной: через 6 ч после индукции преобладали изменения, связанные с нарушением кровообращения, через 16 ч появлялись начальные признаки миграции клеток к очагу воспаления, тогда как к 24 ч воспали-
тельная инфильтрация в ткани легких была полностью сформирована, локализуясь преимущественно вокруг сосудов и бронхов (рис. 1Г).
Таким образом, определение динамики воспалительных изменений и цитокинового профиля мышей с ОПЛ показало, что именно TNF-a остается на стабильно высоком уровне на протяжении всего периода наблюдения, свидетельствуя о важной роли данного цитокина в сигнальных путях воспалительного ответа. Морфологические признаки воспаления, вызванные ЛПС в дыхательной системе мышей, были наиболее выражены через 24 ч после индукции, делая данный временной интервал оптимальным для оценки противовоспалительной активности исследуемых конструкций.
Выбор и синтез ДНК-аптамера к TNF-a
На данный момент опубликовано несколько ну-клеотидных последовательностей РНК- и ДНК-аптамеров, способных специфично связывать TNF-a [25]. Большинство из них обладают сродством к белку-мишени в наномолярном диапазоне и способны ингибировать функциональную активность TNF-a in vitro. Для исследования был выбран ДНК-аптамер aptTNF-a, который, как показано ранее, обладает способностью подавлять развитие воспаления в in vivo моделях острого повреждения легких и печени при его внутривенном или интратрахеаль-ном введении [26]. Общая длина этого аптамерного олигонуклеотида составляет 41 нуклеотид, что делает его химический синтез достаточно быстрым и экономичным (последовательность aptTNF-a приведена в табл. 1). В качестве аналогичной неапта-мерной ДНК для контроля специфичности действия аптамера использовали скрамблированный олиго-нуклеотид той же длины и нуклеотидного состава. Противовоспалительная активность бивалентных аптамеров in vivo, в которых два аптамерных модуля ковалентно соединены остатком полиэтилен-гликоля 20 кДа, была показана ранее [26]. В нашей работе мы выбрали другую стратегию химической модификации аптамера для увеличения времени его жизни в организме животных и использовали модификации, которые в настоящее время являются практически «золотым стандартом» для аптаме-ров, предназначенных для экспериментов in vivo или клинических исследований [27, 28]. На 3'-ко-нец для защиты от экзонуклеазного гидролиза был введен дополнительный остаток тимидина, присоединенный 3'-3'-фосфодиэфирной связью, для чего при твердофазном синтезе олигонуклеотидов использовали коммерчески доступный полимерсвя-занный З'-О-диметокситритилтимидин, а на 5'-конец вводили полиэтиленгликоль (PEG) с молекулярной
массой 40 кДа для улучшения фармакокинетиче-ских характеристик аптамера при его топической доставке в дыхательную систему мышей.
Таким образом, предложенный нами вариант аптамерной конструкции обеспечивает более контролируемый синтез и выделение пегилированного конъюгата, поскольку при детектированных нами уровнях TNF-a в БАЛЖ (не более 4 нг/мл) этот белок с высокой вероятностью представлен мономерной, а не тримерной формой [29]. Аналогичный набор модификаций использован и для контрольного неаптамерного олигонуклеотида.
Противовоспалительная активность аптамера к TNF-a на модели ЛПС-индуцированного острого повреждения легких
Противовоспалительную активность аптамеров к TNF-a (aptTNF-a и PEG-aptTNF-a) изучали на модели ЛПС-индуцированного ОПЛ. Аптамеры вводили мышам интраназально, поскольку высокий уровень данного цитокина детектировался именно в БАЛЖ. В качестве контроля специфичности действия аптамера мышам вводили соответствующие скрамблированные олигонуклеотиды (Scr или PEG-Scr). Исследуемые конструкции вводили через 1 ч после индукции ОПЛ с последующим забором материала через 24 ч (рис. 2А), поскольку именно в эту временную точку морфологические изменения в дыхательной системе мышей были наиболее выражены и окончательно сформированы.
Введение ЛПС вызывало повышение общего числа лейкоцитов в БАЛЖ мышей с ОПЛ в 7.7 раза по сравнению со здоровыми животными (рис. 2Б). Введение aptTNF-a или соответствующего Scr не влияло на данный показатель, тогда как введение пегилированного аптамера PEG-aptTNF-a в дозе 5 мг/кг достоверно снижало общее число лейкоцитов в БАЛЖ в 1.8 раза по сравнению с контролем и в 2.7 раза по сравнению с PEG-Scr, введенным в той же дозе (рис. 2Б). PEG-aptTNF-a в дозе 1 мг/кг также вызывал снижение данного показателя в 1.5 и 1.8 раза по сравнению с контролем и Scr соответственно. Данные различия (для дозы 1 мг/кг) оказались статистически недостоверными, однако они показывают дозозависимый характер действия PEG-aptTNF-a. Уровень TNF-a в БАЛЖ мышей с ОПЛ был повышен в 85 раз по сравнению со здоровыми животными, а введение PEG-aptTNF-a не оказывало значительного влияния на этот показатель (рис. 2В). Уровень TNF-a после введения непегилированного аптамера не исследовали, поскольку данная конструкция не вызывала снижения общего числа лейкоцитов в БАЛЖ как одного из показателей противовоспалительного действия препарата.
А
Balb/C
Scr 1 мг/кг и/н aptTNF-a 1 мг/кг и/н PEG-Scr 1 мг/кг и/н PEG-aptTNF-a 1 мг/кг и/н PEG-Scr 5 мг/кг и/н PEG-aptTNF-a 5 мг/кг и/н;
с
1.5
0.5
0 ч 1 ч 24 ч
▲ ▼
ЛПС 10 мкг/мышь и/н Бронхоальвеолярная
Ткань легких
0
Л
Л
жидкость
Д
§ з
¡2 ' IS
ф 1
* а
й
в
i
#
о4? v v Ь V
¿s> A<T
* v V
*
A
Здоровые
Контроль
Scr 1 мг/кг
aptTNF-a 1 мг/кг
у», '.„a . ¡i.w/i.-;:
В
Б
Рис. 2. Влияние аптамеров к Т^-а на развитие ЛПС-индуцированного острого повреждения легких у мышей. Л - схема эксперимента. У мышей линии Ва1Ь/С индуцировали острое повреждение легких (ОПЛ) путем интра-назального (и/н) введения ЛПС (10 мкг/мышь). Через 1 ч после индукции мышам и/н вводили аптамеры к Т^-а: ар^^-а в дозе 1 мг/кг и PEG-aptTNF-а в дозах 1 и 5 мг/кг. Мышей с ОПЛ без лечения и получавших соответствующий скрамблированный олигонуклеотид ^сг и PEG-Scr) использовали в качестве контролей. Мышей выводили из эксперимента через 24 ч после индукции и производили забор материала для последующего анализа. Б, В - общее число лейкоцитов (Б) и уровень Т^-а (В) в БАЛЖ мышей с ЛПС-индуцированным ОПЛ без лечения и после введения аптамеров к Т^-а. Г, Д - гистологическое исследование (Г) и полуколичественная оценка интенсивности воспалительных изменений (Д) в легких мышей контрольных и экспериментальных групп. Окр. гематоксилином и эозином, ув. Х200. Черными стрелками обозначена воспалительная инфильтрация. Для оценки воспаления в легких использована следующая шкала: 0 - патологические изменения отсутствуют, 1 - воспаление выражено слабо, 2 - воспаление выражено умеренно, 3 - выраженные воспалительные изменения. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение; *р < 0.05, **р < 0.01
Согласно результатам гистологического исследования, введение исследуемых конструкций вызывает дозозависимое снижение интенсивности описанных ранее морфологических проявлений ЛПС-индуцированного ОПЛ. Применение aptTNF-a и PEG-aptTNF-a в дозе 1 мг/кг приводило к снижению интенсивности воспалительных изменений в ткани легких - в 1.5 и 1.8 раза по сравнению с контролем и в 1.4 и 1.6 раза по сравнению с соответствующим Scr (рис. 2Г,Д). Однако эти различия были статистически значимыми только при сравнении аптамеров и контроля. Введение PEG-aptTNF-a в дозе 5 мг/кг вызывало статистически значимое снижение воспаления в ткани легких как по сравнению с группой контроля (в 2.2 раза), так и по сравнению с группой, получавшей PEG-Scr (в 2 раза).
Таким образом, аптамер PEG-aptTNF-a, направленный к провоспалительному цитокину TNF-a, блокирует развитие воспалительных изменений в дыхательной системе мышей, вызванных введением ЛПС, однако не нормализует показатели до уровня здоровых животных. Следует отметить дозозависимый характер противовоспалительного действия aptTNF-a/PEG-aptTNF-a, что, скорее всего, связано с более эффективным связыванием TNF-a при увеличении дозы препарата, а противовоспалительное действие достоверно показано только для конъюгата с PEG за счет улучшенных фар-макокинетических характеристик препарата.
Анализ уровней экспрессии генов-мишеней TNF-a в ткани легких мышей с ЛПС-индуцированным острым повреждением легких без лечения и после введения аптамера к TNF-a
Следующим этапом нашего исследования были поиск и оценка уровней экспрессии генов - возможных мишеней TNF-a - при развитии ЛПС-индуцированного ОПЛ и при его коррекции ап-тамером к TNF-a для подтверждения влияния использованных конструкций на способность целевого секретируемого белка связываться со своим рецептором и активировать сигналинг. Выбор генов, а именно Usp18, Trafl и Tnfaip3, сделан на основе опубликованных данных, согласно которым уровни их экспрессии повышаются под действием TNF-a при широком спектре биологических и патологических процессов, таких, как ЛПС-индуцированный сепсис [30], повреждение миокарда по типу ишемия-реперфузия [31], церебральная ишемия [32], активация сигнальных путей NF-kB и интерферонов типа I [33-36], а также гемопоэз и регенерация миелоид-ного ростка кроветворения [37].
Уровни экспрессии Usp18, Trafl и Tnfaip3 были оценены в ткани легких мышей с помощью ОТ-ПЦР
(рис. 3). Легкие здоровых животных характеризовались низким уровнем экспрессии исследуемых генов (принятым за 1), в то время как введение ЛПС приводило к значительному увеличению уровней их экспрессии (контроль): Usp18 в 7 раз, Traf1 в 2 раза и Tnfaip3 в 61 раз по сравнению со здоровыми животными.
В ходе оценки влияния аптамеров на экспрессию исследуемых генов в ткани легких мышей с ОПЛ были выявлены следующие закономерности. Введение PEG-аptTNF-a в дозе 1 мг/кг приводило к статистически значимому снижению уровня экспрессии гена Usp18 до уровня у здоровых животных: в 5.9 раза по сравнению с контролем и в 2.6 раза по сравнению с РЕа^сг. PEG-аptTNF-a в дозе 5 мг/кг также приводил к снижению уровня экспрессии Usp18 в 2.6 и 3 раза по сравнению с контролем и РЕа^сг соответственно. Однако статистически значимые отличия выявлены только между аптамером и скамблированным олигонукле-отидом (рис. 3). Введение PEG-аptTNF-a в дозах 1 и 5 мг/кг приводило к снижению экспрессии гена Traf1 в 3.5 и 2.6 раза по сравнению с контролем и в 1.8 и 1.7 раза по сравнению с РЕа^сг соответственно. Однако статистически значимой разницы в эффектах PEG-аptTNF-a и РЕа^сг в дозе 5 мг/кг не наблюдали (рис. 3). В случае гена Tnfaip3 единственным статистически значимым было снижение в 1.6 раза уровня экспрессии под действием PEG-аptTNF-a в дозе 1 мг/кг по сравнению с группой РЕа^сг (рис. 3). Введение РЕа^сг в дозах 1 и 5 мг/кг не оказывало статистически значимого влияния на экспрессию всех исследуемых генов. Введение аptTNF-a дозе 1 мг/кг приводило к статистически недостоверному снижению уровней экспрессии Usp18 и Traf1 в 1.7-2.4 раза, а в случае Tnfaip3 - к повышению его экспрессии (в 1.3 раза) по сравнению с контролем (рис. 3).
Таким образом, наиболее эффективное снижение уровней экспрессии потенциальных генов-мишеней зафиксировано при введении PEG-аptTNF-a в дозе 1 мг/кг, тогда как значимые противовоспалительные эффекты выявлены при использовании данного аптамера в дозе 5 мг/кг, что может быть связано с выбором времени определения уровней экспрессии этих генов, когда максимальное действие более высокой дозы аптамера на экспрессию TNF-a ассоциированных генов уже прошло.
ОБСУЖДЕНИЕ
TNF-a - плейотропный цитокин, продуцируемый активированными макрофагами, Т-лимфоцитами и натуральными киллерами - является одним из важнейших регуляторов иммунного ответа, поэ-
Usp18
Trafl
Tnfaip3
i
<u
CQ
О
M
>x и
Í * 5 £1
с с
<u о
£ S
U
О
12-, 108 64 2 0-
o a о d
со
с
0 a
ь
1
О
О
ill
О
а. CL о. a
rv rv
Ó ш
CL
О
Ш CL
1
к
5 5 5 5 5 5
m m
(j e и e и e
1Л LL 1Л u_ 1Л LL
z 1— ó 11 1 Z i— Ó 111 z 1—
"a CL "a CL "a
nj nj
Ó ó
CL CL
Рис. 3. Уровни экспрессии генов - возможных мишеней TNF-a (Usp18, Trafl и Thfaip3) в ткани легких мышей с ЛПС-индуцированным острым повреждением легких без лечения и после введения аптамеров. Уровни экспрессии генов нормированы по уровню экспрессии Hprt, который использовали в качестве внутреннего стандарта. Три образца из каждой группы проанализированы в трех повторностях. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение; *p < 0.05, **p < 0.01
тому воздействие на уровень этого цитокина может быть эффективной стратегией коррекции иммунных нарушений, ассоциированных с опухолевыми, воспалительными, обменными и инфекционными заболеваниями [38, 39]. Учитывая многообразие заболеваний и биологических процессов, в которых TNF-a принимает участие, количество генов и сигнальных путей, регулирующих и регулируемых TNF-a, исчисляется десятками [40, 41].
В настоящее время основными анти-TNF-a-препаратами, одобренными к применению в клинике, являются моноклональные антитела, которые, однако, вызывают такие побочные эффекты, как повышение чувствительности к инфекциям, развитие демиелинизирующих заболеваний и злокачественных новообразований [41]. Использование анти-TNF-a-средств другой природы, таких, как ап-тамеры, возможно, позволит сократить количество и тяжесть осложнений.
В данной работе противовоспалительная активность аптамера к TNF-a, а также влияние химических модификаций на эффективность его действия изучены на мышиной модели ЛПС-индуцированного ОПЛ. Следует отметить, что выбор способа введения аптамера обоснован и аргументирован данными профилирования уровня цитокинов в БАЛЖ и сыворотке крови при развитии ОПЛ у мышей в динамике. Показано, что уровень TNF-a в БАЛЖ значительно выше, чем в сыворотке крови, что свидетельствует о перспективности топического ин-траназального введения аптамера по сравнению с системным. Что касается доз аптамера, исполь-
зованных в эксперименте, нами были выбраны концентрации, которые с высокой вероятностью должны обеспечивать целевой эффект, принимая во внимание, что концентрации пегилированных аптамеров в диапазоне 1-10 мг/кг являются оптимальными для in vivo экспериментов и клинических исследований [42].
Обнаружено, что PEG-aptTNF-a обладает более выраженным противовоспалительным действием, чем немодифицированный аналог, что может быть связано с его более длительным временем жизни в организме животных. PEG-aptTNF-a демонстрирует определенную дозозависимость: в дозе 5 мг/кг он был более эффективен, чем в дозе 1 мг/кг. Однако, несмотря на противовоспалительную активность, наблюдаемую в БАЛЖ и ткани легких, значимое снижение количества самого TNF-a в БАЛЖ не зафиксировано. Подобное расхождение может быть следствием того, что аптамер и анти-TNF-a-антитела, используемые в ИФА, могут связываться с разными пространственно удаленными эпитопа-ми TNF-a, при этом взаимодействие с аптамером не влияет на связывание антител. Однако в отсутствие данных структурных исследований или молекулярного моделирования, которые бы указали, с каким именно эпитопом TNF-a происходит связывание анти-TNF-a-аптамера, эта гипотеза нуждается в дальнейшем подтверждении.
Поскольку прямое измерение уровня TNF-a не привело к ожидаемым результатам, было решено оценить эффект аптамера к TNF-a с помощью анализа количества мРНК генов, которые участву-
ют в регуляции и передаче сигнала TNF-a. В качестве потенциальных генов-мишеней TNF-a были выбраны гены, которые напрямую задействованы в регуляторном каскаде TNF-a и уровень которых повышается при развитии ОПЛ.
В начале сигналинга растворимая форма TNF-a связывается с рецептором TNF1 типа (TNFR1), вызывая тримеризацию рецептора и вовлечение в процесс белка домена смерти (TRADD) и серин-трео-ниновой протеинкиназы 1 (RIPK1) (рис. 4). Далее TRADD взаимодействует с гетеродимером TRAF1/ TRAF2, образуя комплекс I, который активирует сигнальный путь NF-kB и запускает синтез про-воспалительных цитокинов, в том числе IFN-I [33]. В дальнейшем IFN-I воздействует через рецепторы IFNAR1/2 и сигнальный путь JAK/STAT на следующее важное звено в развитии воспалительного ответа - ось ISG15/USP18, которая регулирует активность иммунной системы [36] и снижает интенсивность воспалительного ответа, подавляя сигнальный путь JAK/STAT, что указывает на возможную петлю отрицательной обратной связи между USP18, IFN-I и, как следствие, TNF-a [43, 44].
Другая ключевая молекула механизма обратной регуляции - белок 3, индуцируемый TNF-a (TNFAIP3), также известный как А20. Базальный уровень экспрессии TNFAIP3 низок в большинстве клеток, однако быстро возрастает при развитии воспалительного ответа [45]. TNFAIP3 рекрутируется в сигнальный комплекс TNFR1, где деубиквитини-рует RIPK1, что приводит к потере стабильности комплекса I и блокированию дальнейшей активации NF-kB. Диссоциировавший из комплекса I TRADD образует комплексы с Fas-ассоциированным белком домена смерти (FADD) и каспазой-8 (комплекс 11а) или с RIPK1, FADD и каспазой-8 (комплекс IIb), которые в дальнейшем приводят к апоптозу или не-кроптозу [46].
Учитывая вовлечение описанных генов в сиг-налинг и регуляцию TNF-a, введение аптамера к TNF-a, как и ожидалось, приводило к снижению уровня экспрессии генов-мишеней, выбранных для валидации, а именно: Trafl как компонента гетеродимерного комплекса, непосредственно участвующего в передаче сигнала TNF-a; Tnfaip3, блокирующего активацию провоспалительного сигнального пути NF-kB; и Usp18, регулирующего интенсивность воспалительного ответа после активации NF-kB по механизму отрицательной обратной связи, что говорит о правомерности использования генов-мишеней TNF-a для оценки биологического действия анти-TNF-a-аптамера. Как и в случае морфологических изменений в дыхательной системе мышей, PEG-aptTNF-a обладал более выраженным
Аптамер к TNF-a
TNF-a
шшшшлшгашШШШЩ
in 'ЩШШШШШ
TNFR1/2
Комплекс I -TNFAIP31
RIPK+TRADD |
Комплекс IIa/b TRADD+FADD+Каспаза 8
TRAF1 +TRAF2 Апоптоз, некроптоз
I ,
NF-kB IUSP1^-— ISG15
I
Транскрипция IFN-I
Повышение уровней экспрессии генов-мишеней TNF-a
т t
IFNAR1/2-"" Сигнальный путь
JAK/STAT
В I.
— Воспалительный
процесс Развитие воспаления
в легких
Рис. 4. Общая схема сигналинга TNF-a
эффектом на уровень экспрессии генов, чем немо-дифицированные аптамеры.
Таким образом, проведенное исследование еще раз продемонстрировало важность TNF-a как терапевтической мишени при ОПЛ, а также преимущество использования химически модифицированных аптамеров для блокирования его функции. Секреторный белок является крайне привлекательной мишенью для аптамера, поскольку для связывания с ним не требуется доставка препарата в клетку, вместо этого терапевтический аптамер может вводиться системно или локально в те органы и ткани, где повышен уровень белка-мишени. Возможность введения аптамера после начала развития патологии и блокирование действия антидотом также представляются крайне привлекательными и делают терапевтические аптамеры практически «идеальными лекарствами».
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате проведенного исследования установлено, что TNF-a является одним из ключевых игроков цитокинового сигналинга при развитии ЛПС-индуцированного ОПЛ, а интраназальное введение
аптамеров к TNF-a эффективно снижает воспалительные изменения в дыхательной системе мышей, вызванные ЛПС, влияет на ассоциированные с TNF-a гены-мишени и может рассматриваться в качестве инструмента для терапии ОПЛ различной этиологии и других заболеваний легких, сопровождающихся иммунными нарушениями. •
Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 19-74-30011) и государственного задания ИХБФМ СО РАН № 121031300042-1.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Mowery N.T., Terzian W.T.H., Nelson A.C. // Curr. Probl. Surg. 2020. V. 57. № 5. P. 100777.
2. Chen X., Tang J., Shuai W., Meng J., Feng J., Han Z. // Inflamm. Res. 2020. V. 69. № 9. P. 883-895.
3. Lucas R., Hadizamani Y., Gonzales J., Gorshkov B., Bodmer T., Berthiaume Y., Moehrlen U., Lode H., Huwer H., Hudel M., et al. // Toxins (Basel). 2020. V. 12. № 4. P. 223.
4. Shah R.D., Wunderink R.G. // Clin. Chest Med. 2017. V. 38. № 1. P. 113.
5. Goligher E.C., Doufle G., Fan E. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2015. V. 191. № 12. P. 1367-1373.
6. Agrawal D.K., Smith B.J., Sottile P.D., Albers D.J. // Front. Physiol. 2021. V. 12.
7. Pauluhn J. // Toxicology. 2021. V. 450.
8. Laskin D.L., Malaviya R., Laskin J.D. // Toxicol. Sci. 2019. V. 168. № 2. P. 287-301.
9. Zhang C.N., Li F.J., Zhao Z.L., Zhang J.N. // Am. J. Physiol. -Lung Cell. Mol. Physiol. 2021. V. 321. № 5. P. 885-891.
10. Sever I.H., Ozkul B., Erisik Tanriover D., Ozkul O., Elgormus C.S., Gur S.G., Sogut I., Uyanikgil Y., Cetin E.O., Erbas O. // Exp. Lung Res. 2021. P. 1-10.
11. Jiao Y., Zhang T., Zhang C., Ji H., Tong X., Xia R., Wang W., Ma Z., Shi X. // Crit. Care. 2021. V. 25. № 1. P. 356.
12. Kong L., Deng J., Zhou X., Cai B., Zhang B., Chen X., Chen Z., Wang W. // Cell Death Dis. 2021. V. 12. № 10. P. 928.
13. Jamal M., Bangash H.I., Habiba M., Lei Y., Xie T., Sun J., Wei Z., Hong Z., Shao L., Zhang Q. // Virulence. 2021. V. 12. № 1. P. 918-936.
14. Ramasamy S., Subbian S. // Clin. Microbiol. Rev. 2021. V. 34. № 3. P. e0029920
15. Dharra R., Kumar Sharma A., Datta S. // Cytokine. 2023. V. 169. P. 156287.
16. Gao Y., Zhou A., Chen K., Zhou X., Xu Y., Wu S., Ning X. // Chem. Sci. 2024. V. 15. № 6. P. 2243.
17. Attiq A., Yao L.J., Afzal S., Khan M.A. // Int. Immunopharmacol. 2021. V. 101. P. 108255.
18. Patel S., Saxena B., Mehta P. // Heliyon. 2021. V. 7. № 2. P. e06158.
19. Adachi T., Nakamura Y. // Mol. 2019. V. 24. № 23. P. 4229.
20. Ji D., Feng H., Liew S.W., Kwok C.K. // Trends Biotechnol. 2023. V. 41. № 11. P. 1360-1384.
21. Stoll H., Steinle H., Wilhelm N., Hann L., Kunnakattu S.J., Narita M., Schlensak C., Wendel H.P., Avci-Adali M. // Molecules. 2017. V. 22. № 6. P. 954.
22. Yu H., Frederiksen J., Sullenger B.A. // RNA. 2023. V. 29. № 4. P. rna.079503.122.
23. Stephens M. // Pharmacol. Ther. 2022. V. 238. P. 108173.
24. Luo Z., Chen S., Zhou J., Wang C., Li K., Liu J., Tang Y., Wang L. // Front. Bioeng. Biotechnol. 2022. V. 10. P. 976960.
25. Shatunova E.A., Korolev M.A., Omelchenko V.O.,
Kurochkina Y.D., Davydova A.S., Venyaminova A.G., Vorobyeva M.A. // Biomedicines. 2020. V. 8. № 11. P. 1-44.
26. Lai W.Y., Wang J.W., Huang B.T., Lin E.P.Y., Yang P.C. // Theranostics. 2019. V. 9. № 6. P. 1741-1751.
27. Qi S., Duan N., Khan I.M., Dong X., Zhang Y., Wu S., Wang Z. // Biotechnol. Adv. 2022. V. 55. P. 107902.
28. Zhang Y., Zhang H., Chan D.W.H., Ma Y., Lu A., Yu S., Zhang
B., Zhang G. // Front. Cell Dev. Biol. 2022. V. 10. P. 104-108.
29. Daub H., Traxler L., Ismajli F., Groitl B., Itzen A., Rant U. // Sci. Rep. 2020. V. 10. № 1. P. 9265.
30. Hu B., Ge C., Zhu C. // Int. Immunol. 2021. V. 33. № 9. P. 461-468.
31. Xu W., Zhang L., Zhang Y., Zhang K., Wu Y., Jin D. // J. Am. Heart Assoc. 2019. V. 8. № 21. P. e012575.
32. Xiang J., Zhang X., Fu J., Wang H., Zhao Y. // Neuroscience. 2019. V. 419. P. 121-128.
33. Courtois G., Fauvarque M.O. // Biomed. 2018. V. 6. № 2. P. 43.
34. Catrysse L., Vereecke L., Beyaert R., van Loo G. // Trends Immunol. 2014. V. 35. № 1. P. 22-31.
35. MacParland S.A., Ma X.-Z., Chen L., Khattar R., Cherepanov V., Selzner M., Feld J.J., Selzner N., McGilvray I.D. // J. Virol. 2016. V. 90. № 12. P. 5549-5560.
36. Sarasin-Filipowicz M., Wang X., Yan M., Duong F.H.T., Poli V., Hilton D.J., Zhang D.-E., Heim M.H. // Mol. Cell. Biol. 2009. V. 29. № 17. P. 4841-4851.
37. Yamashita M., Passegué E. // Cell Stem Cell. 2019. V. 25. № 3. P. 357-372.
38. Savenkova D.A., Gudymo A.S., Korablev A.N., Taranov O.S., Bazovkina D.V., Danilchenko N.V., Perfilyeva O.N., Ivleva E.K., Moiseeva A.A., Bulanovich Y.A., et al. // Int. J. Mol. Sci. 2024. V. 25. № 2. P. 1156.
39. Wong M., Ziring D., Korin Y., Desai S., Kim S., Lin J., Gjertson D., Braun J., Reed E., Singh R.R. // Clin. Immunol. 2008. V. 126. № 2. P. 121-136.
40. Falvo J.V., Tsytsykova A.V., Goldfeld A.E. // Curr. Dir. Autoimmun. 2010. V. 11. № 1. P. 27-60.
41. Leone G.M., Mangano K., Petralia M.C., Nicoletti F., Fagone P. // J. Clin. Med. 2023. V. 12. № 4. P. 1630.
42. Kovacevic K.D., Gilbert J.C., Jilma B. // Adv. Drug Deliv. Rev. 2018. V. 134. P. 36-50.
43. Malakhova O.A., Kim K. Il, Luo J.K., Zou W., Kumar K.G.S., Fuchs S.Y., Shuai K., Zhang D.E. // EMBO J. 2006. V. 25. № 11. P. 2358-2367.
44. François-Newton V., de Freitas Almeida G.M., Payelle-Brogard B., Monneron D., Pichard-Garcia L., Piehler J., Pellegrini S., Uzé G. // PLoS One. 2011. V. 6. № 7. P. e22200.
45. Devos M., Mogilenko D.A., Fleury S., Gilbert B., Becquart
C., Quemener S., Dehondt H., Tougaard P., Staels B., Bachert C., et al. // J. Invest. Dermatol. 2019. V. 139. № 1. P. 135-145.
46. Martens A., van Loo G. // Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2020. V. 12. № 1. P. a036418.
