CC BY
38
https://doi.org/10.33647/2074-5982-16-4-34-43
(«О
BY 4.0
ЛЕИТРАГИН ПОДАВЛЯЕТ ЭКСПРЕССИЮ ЦИТОКИНОВ, ВКЛЮЧАЯ ИНТЕРЛЕЙКИН-6, В МОДЕЛИ «ЦИТОКИНОВОГО ШТОРМА» У МЫШЕЙ ЛИНИИ C57BL/6Y С ИНДУЦИРОВАННЫМ ОСТРЫМ РЕСПИРАТОРНЫМ ДИСТРЕСС-СИНДРОМОМ
В.Н. Каркищенко1, И.А. Помыткин1*, Н.В. Петрова1, М.С. Нестеров1, Р.А. Агельдинов1, Л.В. Зотова1, Е.М. Колоскова1, В.В. Слободенюк1, В.И. Скворцова2
1 ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства России» 143442, Российская Федерация, Московская обл., Красногорский р-н, п. Светлые горы, владение 1
2 Федеральное медико-биологическое агентство России 123182, Российская Федерация, Москва, Волоколамское шоссе, д. 30
Настоящая работа посвящена изучению эффектов лейтрагина, аналога эндогенного гексапептида динорфина 1-6, на экспрессию провоспалительных цитокинов и интерферонов I типа в экспериментальной фатальной модели острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС) у мышей C57BL/6Y Экспрессию интерлейкина-lß (IL-1ß), интерлейкина-6 (IL-6), фактора некроза опухоли (TNF-a), интерферонов a (IFN-a) и ß (IFN-ß) в легких оценивали методом ПЦР в реальном времени. Индукция ОРДС a-галактозилцерамидом и липополисахаридом E. coli приводила к многократному повышению экспрессии цитокинов в легких. Введение лейтрагина в сочетанном режиме, внутримышечная инъекция плюс ингаляция, приводило к статистически значимому снижению уровней мРНК цитокинов в легких уже через 3 ч после начала введения. При этом средний уровень мРНК IL-6, ключевого цитокина в развитии тяжелого ОРДС, снижался в 4,7 раза (p<0,01) до значений, близких к наблюдаемым у интактных животных. С учетом особой роли повышенных концентраций IL-6 в развитии тяжелых форм COVID-19 использование лейтрагина для подавления «цитокинового шторма» может быть эффективным подходом к лечению коронавирусной инфекции.
Ключевые слова: лейтрагин, острый респираторный дистресс-синдром, «цитокиновый шторм»,
мыши C57BL/6Y, цитокины, интерлейкин-6, COVID-19
Конфликт интересов: авторы заявили об отсутствии конфликта интересов.
Для цитирования: Каркищенко В.Н., Помыткин И.А., Петрова Н.В., Нестеров М.С., Агельдинов Р.А., Зотова Л.В., Колоскова Е.М., Слободенюк В.В., Скворцова В.И. Лейтрагин подавляет экспрессию цитокинов, включая интерлейкин-6, в модели «цитокинового шторма» у мышей линии C57BL/6Y с индуцированным острым респираторным дистресс-синдромом. Биомедицина. 2020;16(4):34-43. https://doi.org/10.33647/2074-5982-16-4-34-43
Поступила 29.07.2020
Принята после доработки 05.08.2020
Опубликована 26.10.2020
В.Н. Каркищенко, И.А. Помыткин, Н.В. Петрова, М.С. Нестеров, РА. Агельдинов, Л.В. Зотова,
Е.М. Колоскова, В.В. Слободенюк, В.И. Скворцова «Лейтрагин подавляет экспрессию цитокинов, включая интерлейкин-6, в модели «цитокинового шторма» у мышей линии C57BL/6Y с индуцированным острым респираторным дистресс-синдромом»
LEUTRAGIN INHIBITS EXPRESSION OF CYTOKINES, INCLUDING INTERLEUKIN-6, IN A "CYTOKINE STORM" MODEL IN C57BL/6Y MICE WITH INDUCED ACUTE RESPIRATORY DISTRESS SYNDROME
Vladislav N. Karkischenko1, Igor A. Pomytkin1*, Nataliya V. Petrova1, Maxim S. Nesterov1, Ruslan A. Ageldinov1, Lyudmila V. Zotova1, Elena M. Koloskova1, Vladimir V. Slobodenyuk1, Veronika I. Skvortsova2
1 Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia 143442, Russian Federation, Moscow region, Krasnogorsk district, Svetlye gory village, building 1
2 Federal Medical and Biological Agency of Russia 123182, Moscow, Volokolamskoye highway, 30
This study aims to investigate effects of leutragin, an analogue of endogenous hexapeptide dynorphin 1-6, on the expression of pro-inflammatory cytokines and type I interferons in an experimental model of fatal acute respiratory distress syndrome (ARDS) in C57BL/6Y mice. The expression of interleukin-1p (IL-1P), interleukin-6 (IL-6), tumour necrosis factor (TNF-a), interferons a (IFN-a) and p (IFN-P) in the lungs was assessed by real-time PCR. The induction of ARDS using a-galactosylceramide and E. coli lipopolysac-charide led to a multifold increase in the expression of the cytokines in the lungs. The administration of leutragin in a combined mode — intramuscular injection plus inhalation — led to a statistically significant decrease in the mRNA levels of cytokines within three hours after the start of administration. The average mRNA levels of IL-6, a key cytokine in the development of severe acute respiratory syndrome, decreased by 4.7 times (p<0.01) to reach values close to those observed in intact animals. Given the crucial role of elevated IL-6 concentrations in the development of severe forms of COVID-19, the use of leutragine for suppressing "cytokine storm" syndromes may be an effective approach to the treatment of this coronavirus infection.
Keywords: leutragin, acute respiratory distress syndrome, "cytokine storm", C57BL/6Y mice, cytokines, interleukin-6, COVID-19
Conflict of interest: the authors declare no conflict of interest.
For citation: Karkischenko V.N., Pomytkin I.A., Petrova N.V., Nesterov M.S., Ageldinov R.A., Zotova L.V., Koloskova E.M., Slobodenyuk V.V., Skvortsova V.I. Leutragin Inhibits Expression of Cytokines, Including Interleukin-6, in a "Cytokine Storm" Model in C57BL/6Y Mice with Induced Acute Respiratory Distress Syndrome. JournalBiomed. 2020;16(4):34-43. https://doi.org/10.33647/2074-5982-16-4-34-43
Submitted 29.07.2020 Revised 05.08.2020 Published 26.10.2020
Введение цитокинов, в т. ч. интерлейкина-lß (IL-1ß),
Синдром высвобождения цитокинов, интерлейкина-6 (IL-6), интерлейкина-10
или «цитокиновый шторм», наряду (IL-10), фактора некроза опухоли (TNF-a)
с острым респираторным дистресс-син- и фактора роста эндотелия сосудов (VEGF),
дромом (ОРДС), лимфопенией и наруше- ведет к формированию клинической кар-
ниями свертываемости крови, является тины системного воспалительного ответа,
одним из ключевых факторов тяжелого особую роль в котором играет IL-6 [14, 16].
течения новой коронавирусной инфекции Среди всех цитокинов, уровень которых
COVID-19, вызываемой вирусом SARS- повышается при COVID-19, особую роль
CoV-2 [7]. Аномальное повышение уровней играет IL-6. Существуют доказательства
связи между повышенными уровнями IL-6 и тяжелым течением заболевания, связанным с необходимостью интенсивной терапии у пациентов с COVID-19 [9, 13]. Повышение уровней IL-6 на фоне снижения Т-клеточного иммунитета увеличивает риск летального исхода у этих пациентов [12, 18]. Недавний метаанализ 18-ти исследований COVID-19, включающих в совокупности 2984-х пациентов, показал, что существует пороговый уровень IL-6 в крови, равный 1,7 пг/мл, который является дискриминатором (от лат. discrimino — «различаю») легкого и тяжелого течения болезни [10]. При уровне IL-6 в крови менее 1,7 пг/мл заболевание протекало легко, тогда как превышение этого уровня приводило к тяжелому течению болезни. В том же анализе было отмечено, что у невыжив-ших пациентов уровень IL-6 в крови был выше 4,6 пг/мл [10].
Пока существует только ограниченное понимание того, какую роль играет «ци-токиновый шторм» в тяжелом течении заболевания у пациентов с COVID-19. По одной из версий [5], высокие концентрации цитокинов, и особенно IL-6, негативно влияют на выживание и пролиферацию Т-клеток, выполняющих основную работу по удалению инфицированных вирусом клеток и снижению вирусной нагрузки. Высокие концентрации IL-6, TNF-a и IL-10 в сыворотке достоверно коррелируют с пониженным количеством CD4+ и CD8+ Т-клеток [5, 17], а снижение концентраций IL-6, IL-10 и TNF-a у выздоравливающих пациентов сопровождается восстановлением пула CD4+ и CD8+ Т-клеток [5]. Предположительно, высокие концентрации IL-6 играют роль триггера апоптоза Т-клеток в селезенке и лимфатических узлах, что объясняет связь между «цитокиновым штормом» и снижением пула Т-клеток пациентов с COVID-19 [4]. В поддержку этой гипотезы свидетельствует тот факт, что тоцилизумаб, антаго-
нист рецептора IL-6, повышал абсолютное число циркулирующих лимфоцитов у пациентов с COVID-19 в течение первых 24 ч после введения [8].
С учетом вклада «цитокинового шторма» в тяжелое течение и неблагоприятный прогноз при COVID-19 блокирование сигнальных систем цитокинов рассматривается как потенциально эффективный подход к снижению тяжести и летальности COVID-19. На стадии клинических испытаний находятся специфические мо-ноклональные антитела к интерферону-у (эмапалумаб), TNF-a (адалимумаб), интер-лейкину-6 (силтуксимаб) и рецептору ин-терлейкина-6 (тоцилизумаб и сарилумаб). Однако в синдром высвобождения цитокинов вовлечено множество сигнальных путей и широкий спектр цитокинов. Поэтому, несмотря на высокую эффективность мо-ноклональных антител в блокировании отдельных сигнальных путей, существует необходимость в разработке универсальных средств, способных подавлять или модулировать несколько, а в идеальном случае — большинство сигнальных путей, приводящих к «цитокиновому шторму» при COVID-19.
Активация транскрипционного ядерного фактора каппа B (NF-kB) является общим сигнальным событием, следующим за активацией рецепторов, распознающих патоген-ассоциированные молекулярные паттерны, в т. ч. toll-подобных рецепторов TLR3, TLR8, TLR9 и RIG-I-подобных рецепторов, распознающих вирусную одноцепочечную РНК (ssRNA) и двухцепочечную РНК (dsRNA) [11]. NF-kB запускает транскрипцию генов, кодирующих цитокины, хемокины и дополнительные медиаторы воспаления в различных типах врожденных иммунных клеток. Поэтому NF-kB представляет собой фармакологическую мишень в контексте подавления «цитокинового шторма» при COVID-19.
В.Н. Каркищенко, И.А. Помыткин, Н.В. Петрова, М.С. Нестеров, РА. Агельдинов, Л.В. Зотова,
Е.М. Колоскова, В.В. Слободенюк, В.И. Скворцова «Лейтрагин подавляет экспрессию цитокинов, включая интерлейкин-6, в модели «цитокинового шторма» у мышей линии C57BL/6Y с индуцированным острым респираторным дистресс-синдромом»
Динорфин 1-17 — это гептадекапептид из класса эндогенных опиоидных пептидов, который производится многими клетками, в т. ч. лейкоцитами. При высвобождении из лейкоцитов в месте воспаления динорфин 1-17 подвергается быстрой биотрансформации с образованием набора фрагментов. Фрагмент динорфи-на 1-6 обладает способностью ингибиро-вать активацию NF-kB и таким образом подавлять транскрипционную активацию NF-кВ-зависимых генов, как было показано для цитокинов IL-1ß и TNF-a [6]. Однако динорфин 1-6 живет менее одной минуты in vivo из-за действия пептидаз, что ограничивает возможность его использования в качестве средства лечения синдрома высвобождения цитокинов.
Лейтрагин представляет собой искусственный гексапептид, имеющий аминокислотную последовательность Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg, соответствующую структуре фрагмента динорфина 1-6, в котором остаток Gly во втором положении заменен на D-Ala для повышения устойчивости пептида к действию эндогенных пептидаз.
Целью работы было исследование эффективности лейтрагина в подавлении экспрессии цитокинов IL-1ß, TNF-a, IL-6, IFN-a и IFN-ß на экспериментальной модели фатального острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС) с выраженными признаками «цитокинового шторма», подобными тем, что наблюдаются при COVID-19.
Материалы и методы
Животные
Исследования проводились в Научном центре биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства (ФГБУН НЦБМТ ФМБА России) на мышах линии C57BL/6Y, самках в возрасте около 2,5 мес., начальной средней
массой 20±2,0 г (и=80). Животные были получены из филиала «Столбовая» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России и отобраны в эксперимент методом рандомизации. Мышей содержали в микроизоляторной системе Rair IsoSystem по 5 особей. Животные соответствовали категории конвенциональных. Животные получали стандартный комбикорм гранулированный полнорационный для лабораторных животных (экс-трудированный) ПК-120 ГОСТ Р 518492001 Р.5. Водопроводная очищенная вода всем животным давалась ad libitum в стандартных поилках. Животные содержались в контролируемых условиях окружающей среды при температуре воздуха 18-22°С, относительной влажности 60-70% и естественно-искусственном освещении с циклом 12/12. Вновь прибывшие животные находились на карантине 7 дней в клетках. Все эксперименты проводились в соответствии с этическими принципами и нормативными документами, рекомендованными Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов [1, 3], а также в соответствии с Приказом Минздрава России от 01.04.2016 г. № 199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики».
Модель острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС)
Животные были разделены на 4 группы по 6 особей в каждой. Интактные животные не подвергались какому-либо вмешательству. В остальных группах животным вводили а-галактозилцерамид в дозе 1 мкг/мышь и через 24 ч под общим наркозом вводили интратрахеально липополисахарид стенки E. coli в количестве 300 мкг/мышь с добавлением 100 мкг/мышь мурамилпептида, 10 мкл/мышь полного адъюванта Фрейнда и G2 (ЛПС-микс), чтобы индуцировать острый респираторный дистресс-синдром [2].
Режим дозирования
Через 3 ч после введения ЛПС-микс животные получили однократно лейтрагин внутримышечно в дозе 10 мкг/кг (группа «LPS+L1»), лейтрагин внутримышечно в дозе 10 мкг/кг и внутрилегочно ин-галяционно в дозе 100 мкг/кг (группа «LPS+L2») или не получали ничего (группа «LPS»). Через 3 ч после введения лей-трагина животных декапитировали, легкие извлекали и гомогенизировали с использованием прибора для автоматической гомогенизации клеток и тканей MagNa Lyser («Roche») [16].
Выделение РНК из биоматериала
Из полученного материала легких выделяли тотальную РНК с помощью набора для выделения РНК-экстран («Синтол», Россия) в соответствии с инструкциями производителя.
Проведение ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)
Анализ ПЦР производили на матрице ДНК, полученной в результате обратной транскрипции одноцепочечной РНК в кДНК. Синтез первой цепи кДНК про-
водили согласно инструкции «Комплект реагентов для получения кДНК на матрице РНК. РЕВЕРТА-L» («ИнтерЛабСервис», Москва) при 37°С — 30 мин в течение одного цикла.
Проведение ПЦР в реальном времени
Исследование экспрессии генов IL1B, IL6, TNFA, IFNA и IFNB, кодирующих ци-токины IL-1ß, IL-6, TNF-a, IFN-a и IFN-ß соответственно, в исследуемых пробах производилось с помощью детектирующего амплификатора CFX-96 («Bio-Rad», США) при использовании специфических праймеров и флуоресцентных зондов, указанных в таблице. В качестве референсного гена был выбран ген «домашнего хозяйства» GAPDH. Результаты измерений выражались как кратность изменения экспрессии гена относительно экспрессии этого же гена у интактных животных.
Статистическая обработка
Статистический анализ проводили с помощью однофакторного дисперсионного анализа (one-way ANOVA) с последующим тестом Тьюки (Tukey's test) для множественного сравнения различий между
Таблица. Олигонуклеотидные праймеры и зонды ПЦР-системы для детекции генов IL1B, IL6, TNFA, IFNA и IFNB
Table. Oligonucleotide primers and PCR probes used for detecting IL1B, IL6, TNFA, IFNA and IFNB genes
Ген Праймер/зонд Нуклеотидная последовательность
F 5'-GAGAACCAAGCAACGACAAA-3'
IL1B R 5'-CTTGTTGAAGACAAACCGTT-3'
Z ROX-TAATGAAAGACGGCACACCCACCCT-BHQ2
F 5'-ATGAAGTTCCTCTCTGCAAG-3'
IL6 R 5'-GTGTAATTAAGCCTCCGACT-3'
Z ROX-CTTCTTGGGACTGATGCTGGTGACA-BHQ-2
F 5'-TCTGTCTCTCACCTGCTCTG-3'
TNFA R 5'-GGTTCTCAGATGTGTCACGA-3'
Z ROX-GAATGGATGGGCTACATAAGTTACG-BHQ2
F 5'-ATCAAACAGCCCAGAAGACC-3'
IFNA R 5'-GGCTTTCTTGTTCCTGAGGT-3'
Z ROX-GGCTCTGTGCTTTCCTGATGGTTTT-BHQ2
F 5'-CACCACAGCCCTCTCCATCA-3'
IFNB R 5'-GCATCTTCTCCGTCATCTCC-3'
Z ROX-GGCTCTGTGCTTTCCTGATGGTTTT-BHQ2
Примечание: F — прямой праймер, R — обратный праймер, Z — зонд ПЦР-системы. Note: F — direct primer, R — reverse primer, Z — PCR probe.
В.Н. Каркищенко, И.А. Помыткин, Н.В. Петрова, М.С. Нестеров, Р.А. Агельдинов, Л.В. Зотова,
Е.М. Колоскова, В.В. Слободенюк, В.И. Скворцова «Лейтрагин подавляет экспрессию цитокинов, включая интерлейкин-6, в модели «цитокинового шторма» у мышей линии C57BL/6Y с индуцированным острым респираторным дистресс-синдромом»
группами с использованием программного обеспечения GraphPad Prism. Различия между группами считались статистически значимыми при р<0,05.
Результаты исследований
Для того чтобы оценить эффекты лейтраги-на на экспрессию цитокинов в легких, мышам C57BL/6Y с индуцированным ОРДС вводили лейтрагин одним из двух способов: толь-
ко внутримышечной инъекцией (LPS+L1) или сочетанным введением, внутримышечной инъекцией и ингаляцией (LPS+L2). Экспрессию IL-ip, TNF-a, IL-6, IFN-a и IFN-P в легких измеряли методом ПЦР в реальном времени. Результаты представлены на рисунке как среднее значение ± ошибка среднего кратного изменения уровней мРНК отдельных цитокинов относительно наблюдаемого у интактных животных (n=6).
Рис. Эффекты лейтрагина на экспрессию цитокинов в легких мышей линии C57BL/6Y с индуцированным острым респираторным дистресс-синдромом (ОРДС): (a) — кратное изменение уровней мРНК (mRNA) цитокинов IL-ip, TNF-a, IL-6, IFN-a и IFN-в в легких животных с ОРДС («LPS»), а также получивших лейтрагин внутримышечной инъекцией («LPS+L1»), сочетанно лейтрагин внутримышечной инъекцией и ингаляционно («LPS+L2»), относительно уровней мРНК у интактных животных; (b), (c), (d), (e) и (f) — кратное изменение уровней мРНК (mRNA) отдельных цитокинов IL-ip, TNF-a, IL-6, IFN-a и IFN-в в легких животных с ОРДС («LPS»), а также получивших лейтрагин внутримышечной инъекцией («LPS+L1»), сочетанно лейтрагин внутримышечной инъекцией и ингаляционно («LPS+L2»), относительно уровней мРНК у интактных животных («Int»). **—p<0,01; ***—p<0,001 и****—p<0,0001 по сравнению с группой «Int»; ** — p<0,01 и ****—p<0,0001 по сравнению с группой «LPS» (однофакторный дисперсионный анализ, тест Тьюки).
Fig. Effects of leutragine on cytokine expression in the lungs of C57BL/6Y mice with induced acute respiratory distress syndrome (ARDS): (a) — multifold changes in the mRNA levels of IL-1P, TNF-a, IL-6, IFN-a and IFN-в in the lungs of animals with ARDS (LPS), as well as in the lungs of mice having received leutragine by both intramuscularly injection ("LPS+L1") and in a combined mode (intramuscularly injection and inhalation) ("LPS+L2"), relative to the corresponding mRNA levels in intact animals; (b), (c), (d), (e) and (f) — multifold changes in the mRNA levels of individual cytokines — IL-1P, TNF-a, IL-6, IFN-a and IFN-в — in the lungs of animals with ARDS ("LPS"), as well as in the lungs of mice having received leutragine by both intramuscularly injection ("LPS+L1") and in a combined mode (intramuscularly injection and inhalation) ("LPS+L2"), relative to the corresponding mRNA levels in intact animals ("Int"). ##—p<0.01; ™—p<0.001 and ****—p<0.0001 compared to the "Int" group; **—p<0.01 and ****—p<0.0001 compared to the "LPS" group (single factor dispersion, Tukey' test).
Внутрилегочное введение a-галакто-зилцерамида с последующим интратрахе-альным введением липополисахарида вызвало статистически значимое увеличение экспрессии IL-6 в 6,3 раза (p<0,01), IFN-a — в 10,0 раза (p<0,0001) и IFN-ß — в 2,6 раза (p<0,001) в легких животных с ОРДС (группа «LPS») по сравнению с интактным контролем (группа «Int»). Экспрессия IL-1ß повышалась в 1,9 раза (p=0,14), а TNF-a — в 2,2 раза (p=0,07), но недостоверно при размере выборки n=6. Следует отметить, что наблюдаемое в данной экспериментальной модели статистически значимое многократное повышение экспрессии IL-6 воспроизводит основной характерный признак «цитокинового шторма» у пациентов с тяжелым течением коронавирусной инфекции COVID-19.
Однофакторный дисперсионный анализ (one-way ANOVA) результатов показал, что введение лейтрагина существенно изменило профили экспрессии всех исследованных цитокинов. Статистически значимые различия между группами были найдены в отношении экспрессии IL-1ß (рис. 1b; F320=4,968; p<0,01), TNF-a (рис. 1c; F3 20=3,280;'f)<0,05), IL-6 (рис. 1d; F3 20=6,877; p<0,01), IFN-a (рис. 1e; F3'20=52,14; p<0,0001) и IFN-ß (рис. 1f; F3'20=8,648; p<0,001). Сравнение между группами с помощью теста Тьюки показало, что сочетан-ный режим введения лейтрагина, инъекция плюс ингаляция, наиболее эффективно снижал экспрессию цитокинов, в т. ч. IL-1ß — в 4,3 раза (p<0,01), TNF-a — в 1,9 раза (p=0,15), IL-6 — в 4,7 раза (p<0,01), IFN-a — в 11,2 раза (p<0,0001) и IFN-ß — в 2,1 раза (p<0,01) у животных с ОРДС («LPS+L2») по сравнению с контролем («LPS»). Лейтрагин при инъекционном способе введения («LPS+L1») был менее эффективен, чем при комбинированном введении, и также снижал экспрессию цитокинов, но статистически значимый результат был получен только для снижения IFN-a.
В целом полученные результаты показывают, что лейтрагин при сочетанном инъекционном и ингаляционном введении эффективно подавляет экспрессию как про-воспалительных цитокинов, так и интерфе-ронов I типа в легких животных с «цитоки-новым штормом», и поэтому может быть использован как средство, блокирующее синдром выделения цитокинов.
Особенно важно, что лейтрагин подавляет экспрессию IL-6, ключевого цитоки-на в развитии тяжелого ОРДС у пациентов с коронавирусной инфекцией COVID-19.
Обсуждение результатов
В настоящей работе показано, что лей-трагин, представляющий собой стабилизированный аналог динорфина 1-6, подавляет экспрессию цитокинов в условиях «цитоки-нового шторма», причем ингибиторный эффект реализуется на уровне транскрипции, о чем свидетельствуют результаты ПЦР в реальном времени. Ингибирование транскрипции цитокинов IL-1ß, TNF-a, IL-6, IFN-a и IFN-ß в легких происходило уже через 3 ч после введения лейтрагина, причем эффективность сочетанного введения лейтрагина (внутримышечной инъекцией и ингаляцией) превышала эффективность инъекционного моновведения. Более высокая эффективность сочетанного введения, по-видимому, связана с тем, что «цитокино-вый шторм» в данной модели развивается в первую очередь именно в легких, и ингаляционное введение обеспечивает прямую доставку пептида к очагу поражения.
Главный результат настоящей работы состоит в том, что лейтрагин снижал уровни мРНК IL-6, ключевого цитокина в развитии респираторных заболеваний, в т. ч. тяжелого ОРДС при COVID-19. Сочетанное введение лейтрагина снижало экспрессию IL-6 в легких у животных с «цитокиновым штормом» в 4,7 раза (p<0,01), до уровня, незначительно превышающего наблюдаемый у интактных животных.
В.Н. Каркищенко, И.А. Помыткин, Н.В. Петрова, М.С. Нестеров, Р.А. Агельдинов, Л.В. Зотова,
Е.М. Колоскова, В.В. Слободенюк, В.И. Скворцова «Лейтрагин подавляет экспрессию цитокинов, включая интерлейкин-6, в модели «цитокинового шторма» у мышей линии C57BL/6Y с индуцированным острым респираторным дистресс-синдромом»
Молекулярные механизмы ингибиро-вания лейтрагином транскрипции прово-спалительных цитокинов ГЬ-1р, ТМБ-а и ГЬ-6, а также интерферонов I типа №N-01 и Ш^р не изучались в настоящей работе. Этот механизм известен для динорфина 1-6, эндогенного аналога лейтрагина, который ингибирует транслокацию фактора NF-кB в ядро и так препятствует транскрипции генов, кодирующих провоспа-лительные цитокины [6]. По аналогии с динорфином 1-6 эффекты лейтрагина также, по-видимому, связаны с подавлением активности №-кВ. Однако ингиби-рование NF-кB не объясняет подавления лейтрагином транскрипции интерферонов I типа. В данной модели «цитокиновый шторм» вызывался активацией рецептора ТЬЯ4 липополисахаридом. Известно, что ТЬЯ4 трансдуцирует сигналы по двум различным внутриклеточным путям [15]. Сигнальный путь ТЬК4/МуБ88/ОТ'-кВ ведет к экспрессии 1Ь-1р, ТОТ-а и 1Ь-6, а сигнальный путь TLR4/TRIF/IRF3,7 ведет к транскрипции и
Поэтому универсальный ингибирующий эффект лейтрагина в отношении транскрипции цитокинов затрагивает не только транскрипционный фактор №-кВ и требует дополнительного изучения.
Согласно текущим представлениям, «ци-токиновый шторм» начинается с активации рецепторов, распознающих патоген-ас-социированные молекулярные паттерны (РАМР), к числу которых принадлежат TLR-рецепторы. Рецепторы TLR3, TLR8 и TLR9 распознают вирусную одноцепочечную РНК (ssRNA) и двухцепочечную РНК (dsRNA). Рецептор TLR4 распознает ли-пополисахарид стенки грамотрицательных бактерий. Хотя TLR-рецепторы имеют различные структурные свойства и распознают разные паттерны, все они активируют канонический путь активации №-кВ, что является общим сигнальным событием, который отвечает за транскрипционную
индукцию провоспалительных цитокинов, хемокинов и дополнительных медиаторов воспаления в различных типах врожденных иммунных клеток [11]. Опираясь на эту общность механизмов генерации «цитокинового шторма», можно полагать, что результаты, полученные в настоящем исследовании на экспериментальной модели ОРДС, индуцированной активацией рецептора TLR4 липополисахаридом, могут транслироваться на случаи активации «ци-токинового шторма» при вирусных заболеваниях, в т. ч. при COVID-19.
Заключение
В настоящей работе впервые показано, что лейтрагин, представляющий собой стабилизированный аналог динорфина 1-6, подавляет экспрессию цитокинов IL-1ß, TNF-a, IL-6, IFN-a и IFN-ß в условиях «ци-токинового шторма», вызванного интратра-хеальным введением липополисахарида. Ингибирующий эффект лейтрагина реализуется на уровне активации транскрипции, о чем свидетельствуют результаты ПЦР в реальном времени. Сочетанное введение лейтрагина, внутримышечной инъекцией и ингаляцией, позволяет достичь большего эффекта ингибирования, чем только инъекцией. Главный результат настоящей работы состоит в том, что лейтрагин снижал уровни мРНК IL-6, ключевого цитокина в развитии респираторных заболеваний, в т. ч. тяжелого острого респираторного синдрома при COVID-19. Опираясь на общность механизмов генерации «цитокинового шторма», можно полагать, что результаты, полученные в настоящем исследовании на экспериментальной модели, особенно относящиеся к подавлению экспрессии IL-6, могут быть основанием для клинической проверки эффективности лейтраги-на в подавлении «цитокинового шторма» при многих заболеваниях респираторной системы человека, в т. ч. при коронавирус-ной инфекции COVID-19.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ | REFERENCES
1. Каркищенко Н.Н., Каркищенко В.Н., Фокин Ю.В., Харитонов С.Ю. Нейровизуализация эффектов психоактивных средств посредством нормализации электрограмм головного мозга. Биомедицина. 2019;15(1):12-34. [Karkischenko N.N., Karki-schenko V.N., Fokin Yu.V., Kharitonov S.Yu. Nejrovizualizaciya effektov psihoaktivnyh sredstv posredstvom normalizacii elektrogramm golovnogo mozga [Neuroimaging of the Effects of Psychoactive Substances by Means of Normalization of Brain Electrograms]. Biomedicina [Journal Biomed]. 2019;15(1):12-34. (In Russian)]. DOI: 10.33647/20745982-15-1-12-34.
2. Помыткин И.А., Каркищенко В.Н., Фокин Ю.В., Нестеров М.С., Петрова Н.В. Модель фатального острого поражения легких и острого респираторного дистресс-синдрома. Биомедицина. 2020;16(4):24-33. [Pomytkin I.A., Karkischenko V.N., Fokin Yu.V., Nesterov M.S., Petrova N.V. Model' fatal'nogo ostrogo porazheni-ya legkih i ostrogo respiratornogo distress-sindroma [A fatal model of acute lung injury and acute respiratory distress syndrome]. Biomedicina [Journal Biomed]. 2020;16(4):24-33. (In Russian)]. DOI: 10.33647/2074-5982-16-4-24-33.
3. Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских исследованиях / Под ред. Н.Н. Каркищенко и др. М.: Профиль-2С, 2010. 358 p. [Rukovodstvo po labo-ratornym zhivotnym i al'ternativnym modelyam v biomedicinskih issledovaniyah [Manual on laboratory animals and alternative models in biomedical research]. Ed. by N.N. Karkischenko, et al. Moscow: Profil'-2S Publ., 2010. 358 p. (In Russian)].
4. Chen Y., Feng Z., Diao B., Wang R., Wang G., Wang C., et al. The Novel Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) Directly Decimates Human Spleens and Lymph Nodes. MedRxiv. 2020. DOI: 10.1101/2020.03.27.20045427.
5. Diao B., Wang C., Tan Y., Chen X., Liu Y., Ning L., et al. Reduction and Functional Exhaustion of T Cells in Patients With Coronavirus Disease 2019 (COVID-19). Front. Immunol. 2020;1(11):827. DOI: 10.3389/ fimmu.2020.00827.
6. Fazalul Rahiman S.S., Morgan M., Gray P., Shaw P.N., Cabot P.J. Dynorphin 1-17 and Its N-Terminal Biotransformation Fragments Modulate Lipopolysaccharide-Stimulated Nuclear Factor-kappa B Nuclear Translocation, Interleukin-1beta and Tumor Necrosis Factor-alpha in Differentiated THP-1 Cells. PLoS One. 2016;11(4):e0153005. DOI: 10.1371/jour-nal.pone.0153005.
7. Gao Y.M., Xu G., Wang B., Liu B.C. Cytokine storm syndrome in coronavirus disease 2019: A narrative review. J. Intern. Med. 2020. DOI: 10.1111/joim.13144.
42
8. Giamarellos-Bourboulis E.J., Netea M.G., Rovina N.. Akinosoglou K., Antoniadou A., Antonakos N., et al. Complex Immune Dysregulation in COVID-19 Patients with Severe Respiratory Failure. Cell Host Microbe. 2020;27(6):992-1000.e3. DOI: 10.1016/j. chom.2020.04.009.
9. Gubernatorova E.O., Gorshkova E.A., Polinova A.I., Drutskaya M.S. IL-6: Relevance for immunopatho-logy of SARS-CoV-2. Cytokine Growth Factor Rev. 2020;53:13-24. DOI: 10.1016/j.cytogfr.2020.05.009.
10. Henry B.M., de Oliveira M.H.S., Benoit S., Plebani M., Lippi G. Hematologic, biochemical and immune biomarker abnormalities associated with severe illness and mortality in coronavirus disease 2019 (COVID-19): a meta-analysis. Clin. Chem. Lab. Med. 2020;58(7): 1021-1028. DOI: 10.1515/cclm-2020-0369.
11. Liu T., Zhang L., Joo D., Sun S.C. NF-kB signaling in inflammation. Signal Transduct. Target. Ther. 2017;2:17023. DOI: 10.1038/sigtrans.2017.23.
12. Luo M., Liu J., Jiang W., Yue S., Liu H., Wei S. IL-6 and CD8+ T cell counts combined are an early predictor of in-hospital mortality of patients with COVID-19. JCI Insight. 2020;5(13): 139024. DOI: 10.1172/jci. insight.139024.
13. McGonagle D., Sharif K., O'Regan A., Bridgewood C. The Role of Cytokines including Interleukin-6 in COVID-19 induced Pneumonia and Macrophage Activation Syndrome-Like Disease. Autoimmun. Rev. 2020; 19(6): 102537. DOI: 10.1016/j. autrev.2020.102537.
14. Perricone C., Triggianese P., Bartoloni E., Cafaro G., Bonifacio A.F., Bursi R., et al. The anti-viral facet of anti-rheumatic drugs: Lessons from COVID-19. J. Autoimmun. 2020; 111:102468. DOI: 10.1016/j. jaut.2020.102468.
15. Sin W.X., Yeong J.P., Lim T.J.F., Su I.H., Connolly J.E., Chin K.C. IRF-7 Mediates Type I IFN Responses in Endotoxin-Challenged Mice. Front. Immunol. 2020;11:640. DOI: 10.3389/fimmu.2020.00640.
16. Vabret N., Britton G.J., Gruber C., Hegde S., Kim J., Kuksin M., et al. Sinai Immunology Review Project. Immunology of COVID-19: Current State of the Science. Immunity. 2020;52(6):910-941. DOI: 10.1016/j.immuni.2020.05.002.
17. Wang F., Nie J., Wang H., Zhao Q., Xiong Y., Deng L., et al. Characteristics of Peripheral Lymphocyte Subset Alteration in COVID-19 Pneumonia. J. Infect. Dis. 2020;221(11): 1762-1769. DOI: 10.1093/infdis/ jiaa150.
18. Xu B., Fan C.Y., Wang A.L., Zou Y.L., Yu Y.H., He C., et al. Suppressed T cell-mediated immunity in patients with COVID-19: A clinical retrospective study in Wuhan, China. J. Infect. 2020;81(1):e51-e60. DOI: 10.1016/j.jinf.2020.04.012.
В.Н. Каркищенко, И.А. Помыткин, Н.В. Петрова, М.С. Нестеров, РА. Агельдинов, Л.В. Зотова,
Е.М. Колоскова, В.В. Слободенюк, В.И. Скворцова «Лейтрагин подавляет экспрессию цитокинов, включая интерлейкин-6, в модели «цитокинового шторма» у мышей линии С57В1./6У с индуцированным острым респираторным дистресс-синдромом»
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ | INFORMATION ABOUT THE AUTHORS
Каркищенко Владислав Николаевич, д.м.н., проф., ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства России»; e-mail: scbmt@yandex.ru
Помыткин Игорь Анатольевич*, к.х.н., ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства России»; e-mail: ipomytkin@mail.ru
Петрова Наталья Владимировна, ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства России»;
e-mail: m-sklad@yandex.ru
Нестеров Максим Сергеевич, ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства России»; e-mail: mdulya@gmail.com
Агельдинов Руслан Андреевич, ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства России»;
e-mail: ageldinov@gmail.com
Зотова Людмила Вадимовна, ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства России»; e-mail: vcentre4udes@gmail.com
Колоскова Елена Михайловна, к.б.н., ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства России»;
e-mail: heleko3@yandex.ru
Слободенюк Владимир Владимирович, к.б.н., ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства России»; e-mail: prof-v-iprim@mail.ru
Скворцова Вероника Игоревна, д.м.н., проф., чл.-корр. РАН, Федеральное медико-биологическое агентство России; e-mail: priemnaya@fmba.gov.ru
Vladislav N. Karkischenko, Dr. Sci. (Med.), Prof., Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: scbmt@yandex.ru
Igor A. Pomytkin*, Cand. Sci. (Chem.), Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: ipomytkin@mail.ru
Nataliya V. Petrova, Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: m-sklad@yandex.ru
Maxim S. Nesterov, Scientific Center ofBiomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: mdulya@gmail.com
Ruslan A. Ageldinov, Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: ageldinov@gmail.com
Lyudmila V. Zotova, Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: vcentre4udes@gmail.com
Elena M. Koloskova, Cand. Sci. (Biol.), Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: heleko3@yandex.ru
Vladimir V. Slobodenyuk, Cand. Sci. (Biol ), Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: prof-v-iprim@mail.ru
Veronika I Skvortsova, Dr. Sci. (Med.), Prof., Corresponding Member of the Russian Academy of Sciences, Federal Medical and Biological Agency of Russia;
e-mail: priemnaya@fmba.gov.ru
* Автор, ответственный за переписку / Corresponding author
