CC BY
22
УДК:612.42:543.85:616-099
Т.А. Асташова, Ю.А. Анцырева, О.В. Казаков, С.В. Морозов
ЛИМФАТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА В МЕХАНИЗМЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ГОМЕОСТАЗА ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ЦИРКУЛЯТОРНЫХ НАРУШЕНИЙ И ИХ КОРРЕКЦИИ НИЗКОЭНЕРГЕТИЧЕСКИМ ЛАЗЕРНЫМ ИЗЛУЧЕНИЕМ
ГУ НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, Новосибирск
Изучена роль лимфатической системы в поддержании окислительного гомеостаза в нормальных условиях, при моделировании ишемии-реперфузии задних конечностей крыс-самцов и коррекции облучением ишемизированной конечности низкоэнергетическим лазерным излучением. Исследованы закономерности накопления и распределения свободных жирных кислот (СЖК) как маркеров патогенной активации перекисного окисления липи-дов (ПОЛ) в центральной лимфе, крови, подколенном и подвздошном лимфатических узлах и икроножной мышце. В условиях ишемии-реперфузии выявлены развитие токсико-лимфии и эндотоксикоза, показано усиление сброса лимфы в кровеносное русло. Регуляция окислительного гомеостаза выражается в стабилизации относительного пула ненасыщенных СЖК — основных субстратов ПОЛ. Показано сохранение дренажно-детоксикацион-ной функции и способность к регуляции окислительного гомеостаза регионарными к ише-мизированной конечности лимфатическими узлами — подколенным и подвздошным. Выявлено ослабление патогенной активации ПОЛ с приближением к стационарным, характерным для нормальных условий, величинам пула СЖК и долевого вклада в нем ненасыщенных представителей при воздействии низкоэнергетического лазерного излучения.
Ключевые слова: лимфа, лимфатические узлы, свободные жирные кислоты
Известно, что одним из наиболее ранних и легко регистрируемых ишемических и реперфузион-ных повреждений органа является нарушение барьерной функции клеточных мембран для воды и потеря способности клетки регулировать водный баланс [1]. Достижение физиологического оптимума для клеток и тканей зависит от нормального гомеостаза жидкостей, обеспечиваемого лимфатической системой [2, 6]. Нарушение функций лимфообращения, наряду с аутоинтоксикацией, часто является основным патогенетическим механизмом развития необратимых патологических процессов. В качестве существенной причины изменения физико-химических свойств липидного бислоя мембран рассматривают активацию сво-боднорадикального процесса перекисного окисления липидов (ПОЛ) — важнейшего механизма окислительного гомеостаза [1, 4, 7].
Морфологическим исходом активации ПОЛ в патогенезе мембранных повреждений при ишемии является формирование полярных перекисных каналов повышенной проницаемости, способствующих нарушению водно-ионного гомеостаза. Степень декомпенсированности активации ПОЛ характеризует переход от нормы к патологии и,
следовательно, ПОЛ можно рассматривать как неспецифическое патогенетическое звено в развитии ишемии с реперфузией.
Наиболее адекватным субстратом ПОЛ являются свободные жирные кислоты (СЖК), находящиеся в положении мембранных фосфолипидов. Взаимодействие с активными формами кислорода приводит по ферментативному или неферментативному пути к появлению в составе фосфоли-пидов жирнокислотных радикалов. Субстратом действия ферментов являются исключительно полиненасыщенные жирные кислоты, тогда как в процесс автолипопероксидации вовлекаются и моноеновые кислоты. Образующиеся жирно-кислотные радикалы могут инактивироваться до СЖК антиоксидантами, находящимися как в гидрофобной мембранной (а-токоферол), так и в гидрофильной внутриклеточной среде (аскорбиновая кислота, селеновые производные, тиоловые соединения, ионы металлов с переменной валентностью) [7].
Таким образом, увеличение пула С^КК и особенно их ненасыщенных представителей, изменение профилей их накопления и распределения в биологическом материале по сравнению с конт-
рольными образцами может служить указанием на усиление окислительных процессов и, как следствие, нарушение окислительного гомеостаза.
Долевые вклады насыщенных и способных выступать субстратами ПОЛ ненасыщенных С^КК, формирующих профили пула СЖК, могут быть охарактеризованы такой величиной, как индекс насыщенности 1п, определяемый отношением суммарного пула насыщенных СЖК к суммарному пулу ненасыщенных СЖК. Следовательно, уменьшение величины индекса насыщенности в динамике эксперимента служит указанием на возрастание доли ненасыщенных СЖК и, следовательно, активацию процесса ПОЛ.
Цель работы заключалась в изучении роли лимфатической системы в поддержании окислительного гомеостаза в нормальных условиях, при моделировании ишемии-реперфузии задних конечностей крыс и коррекции низкоэнергетическим лазерным излучением.
Методика. В работе использовали здоровых половозрелых крыс-самцов линии Вистар с исходной массой тела 180-250 г. Контрольные и опытные животные были одного возраста и получены одновременно из питомника «Рассвет» (г. Томск). Животные содержались в виварии в одинаковых условиях на стандартном рационе. Все эксперименты выполнены в соответствии с Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных, утвержденными приказом Минздрава СССР № 577 от 12.08.77 г. Моделирование ишемии-реперфузии обеих задних конечностей выполнялось наложением жгутов на верхнюю треть бедра («турникетная модель» [1]) на срок 3 часа , предусматривающий 100% выживаемость животных, под эфирным наркозом. Лазерное воздействие осуществляли гелий-неоновым лазерным излучением с длиной волны 0,63 мкм, плотностью потока мощности 25 мВт/см2 , временем экспозиции 10 минут на одну конечность в течение 7 дней, начиная со вторых суток реперфузии. Последовательно проводили облучение сначала правой, затем левой части задней конечности животного, расположенной дистальнее места наложения жгута. В качестве объектов исследования были выбраны центральная лимфа, периферическая кровь, подколенный и подвздошный лимфатические узлы (регионарные к зоне ишемии) и икроножная мышца. Материал забирали в раннем — 1 сутки — и позднем — 7 суток — реперфузионных периодах с момента циркуляторной гипоксии. Под этаминаловым наркозом осуществляли прижизненный забор крови из хвостовой вены и центральной лимфы из грудного протока по методике [3, 5], забор остального материала производили после декапитации
животного. К пробам всех образцов добавляли 1 каплю 10-5 М раствора 2,6-дитрет-бутил-4-метил-фенола в метаноле для предотвращения процессов автоокисления. Кровь центрифугировали в течение 20 минут при 1500 об/мин. Затем с помощью пипетки с переменным объемом собирали сыворотку в эпиндорфы. Пробы всех образцов замораживали и хранили при температуре —20°С. При подготовке к анализу пробы трижды экстрагировали смесью хлороформ-метанол-вода в соотношении 8:4:3 по объему (3*3 мл), собирали и объединяли хлороформные фракции, затем отгоняли растворитель на ротационном испарителе в вакууме водоструйного насоса при температуре водяной бани 20°С .
Анализ полученных проб осуществляли методом высокоэффективной капиллярной газожидкостной хроматографии на хроматографе НР-5890А фирмы «Хьюлетт Паккард» с плаз-менно-ионизационным детектором, высокоэффективной капиллярной колонкой с фазой SE-30 (толщина фазы 0,25 мкм). Температуру колонки программировали от 50°С до 300°С при скорости нагрева 10°С в минуту, температура узла ввода пробы и детектора — 300°С. Идентификацию полученных методом диазотирования метиловых эфиров жирных кислот в пробах выполняли методом хромато-масс-спектрометрии и добавок заведомых образцов.
Хромато-масс-спектрометрический анализ проводили на газовом хроматографе НР-6890А с капиллярной колонкой НР-5МС и масс-се-лективным детектором НР-5972А, снабженным библиотекой масс-спектров «NIST CSD» (62000 соединений) и системой обработки данных ChemStation фирмы «Хьюлетт Паккард», температуру колонки программировали от 40°С до 300°С при скорости нагрева 10°С в минуту, температура узла ввода пробы — 280°С.
Статистическую и математическую обработку данных проводили с помощью методов вариационной статистики с применением метода дисперсионного анализа. Вероятность различий между группами данных считали достоверной при значениях Р<0,05. Компьютерную обработку данных проводили в среде Windows (Microsoft Excel).
Результаты. В настоящем исследовании в качестве основных определены следующие представители СЖК: миристиновая (14:0), пальмитооле-иновая (16:1), пальмитиновая (16:0), линолевая (18:2), олеиновая (18:1), стеариновая (18:0) и ара-хидоновая кислоты (20:4) (первая цифра означает количество атомов углерода в молекуле кислоты, вторая — количество ненасыщенных двойных связей в молекуле). Выявлено накопление и распределение СЖК во всех объектах исследования в дина-
Таблица 1
Распределение и накопление свободных жирных кислот в центральной лимфе в нормальных условиях, при моделировании ишемии-реперфузии и при воздействии низкоэнергетическим гелий-неоновым лазерным излучением (% на 1 г) (M±Atm)
Свободные жирные кислоты Интактные Реперфузия 1 сутки Реперфузия 7 суток Интактные+ лазер Реперфузия 7 суток + лазер
14:0 —миристиновая кислота 0,3±0,02 *1,01±0,13 *0,92±0,06 *0,59±0,04 * **0,56±0,04
16:1 — пальмитоолеиновая кислота 1,12±0,04 *4,16±0,18 *3,71±0,11 *2,03±0,05 * **2,1±0,08
16:0 — пальмитиноваякислота 10,71±0,06 *9,75±0,12 *9,45±0,12 *10,17±0,11 * **10,58±0,06
18:2 — линолевая кислота 23,44±0,8 23,27±0,27 23,72±0,32 *22,23±0,22 ** 22,87±0,28
18:1 — олеиновая кислота 16,32±0,91 *19,37±0,34 *19,54±0,42 17,35±0,28 ** 16,73±0,37
18:0 — стеариновая кислота 0,85±0,04 *1,87±0,13 *2,45±0,08 *1,56±0,05 *, **2,24±0,09
20:4 — арахидоновая кислота 0,4±0,02 *3,08±0,09 *4,1±0,12 *0,57±0,02 *, **1,08±0,04
£ СЖК 53,14±0,47 *62,51±0,61 *63,89±0,5 *54,5±0,32 *, **56,16±0,57
£ насыщенных СЖК 11,86±0,12 *12,63±0,14 *12,82±0,16 *12,32±0,16 *, **13,38±0,18
£ ненасыщенных СЖК 41,28±0,47 *49,88±0,31 *50,98±0,34 *42,18±0,38 *, **42,78±0,23
1п=£ СЖК насыщ./£ СЖК ненасыщ. 0,29 0,25 0,25 0,29 0,31
Примечание: £ — суммарный пул, СЖК — свободные жирные кислоты, 1п — индекс насыщенности, * — отличия достоверны в сравнении с интактными животными при Р<0,05, ** — отличия достоверны при сравнении 7 сутокреперфузии с воздействием лазерным излучением и группой (7 суток) без коррекции при Р<0,05.
Таблица 2
Распределение и накопление свободных жирных кмслот в сыворотке крови в нормальных условиях, при моделировании ишемии-реперфузии и при воздействии низкоэнергетическим гелий-неоновым лазерным излучением (% на 1 г) (М±№т)
Свободные жирные кислоты Интактные Реперфузия 1 сутки Реперфузия 7 суток Интактные+ лазер Реперфузия 7 суток + лазер
14:0 — миристиновая кислота 1,06±0,13 *0,33±0,01 *0,45±0,03 0,98±0,02 *0,42±0,02
16:1 — пальмитоолеиновая кислота 1,24±0,02 *2,94±0,08 *3,09±0,11 *2,31±0,07 *, **1,83±0,09
16:0 — пальмитиновая кислота 9,49±0,03 *10,35±0,25 *11,59±0,21 *10,31±0,07 *, **9,93±0,08
18:2 — линолевая кислота 12,98±0,13 *17,79±0,15 *17,03±0,36 *13,45±0,15 *, **14,13±0,17
18:1 — олеиновая кислота 16,2±0,08 *18,35±0,38 *18,42±0,21 *17,01±0,08 *, **16,62±0,1
18:0 — стеариновая кислота 0,31±0,02 *4,87±0,16 *3,75±0,11 *0,82±0,09 *, **2,74±0,08
20:4 — арахидоновая кислота 0,98±0,06 *4,39±0,21 *4,87±0,15 *1,23±0,08 *, **2,71±0,11
£ СЖК 42,26±0,29 *59,02±0,56 *59,2±0,6 *46,11±0,18 *, **48,38±0,21
£ насыщенных СЖК 10,86±0,18 *15,55±0,11 *15,79±0,18 *12,11±0,09 *, **13,09±0,12
£ ненасыщенных СЖК 31,4±0,23 *43,47±0,41 *43,41±0,43 *34,0±0,1 *, **35,29±0,31
1п=£ СЖК насыщ./£ СЖК ненасыщ. 0,35 0,36 0,36 0,35 0,37
Примечание: £ — суммарный пул, СЖК — свободные жирные кислоты, 1п — индекс насыщенности,* — отличия достоверны в сравнении с интактными животными при Р<0,05, ** — отличия достоверны при сравнении 7 суток реперфузии с воздействием лазерным излучением и группой (7 суток) без коррекции при Р<0,05.
мике эксперимента. Показано, что величина пула СЖК во всех объектах исследования находилась в интервале 42,3—65,4%. Изменение величины пула СЖК в динамике эксперимента определяли по разнице суммы СЖК в условиях ишемии-реперфузии и нормальных условиях гемолимфодинамики.
Анализ данных таблицы 1 выявляет увеличение пула СЖК в центральной лимфе, достигающее 10,75% к 7-м суткам реперфузии, а также возрастание доли арахидоновой кислоты — основного субстрата ПОЛ в этом периоде — в 10 раз, что свидетельствует об активации процесса ПОЛ
Таблица 3
Распределение и накопление свободных жирных кислот в подвздошном лимфатическом узле в нормальных условиях, при моделировании ишемии-реперфузии и при воздействии низкоэнергетическим гелий-неоновым лазерным излучением (% на 1 г) (М±№т)
Свободные жирные кислоты Интактные Реперфузия 1 сутки Реперфузия 7 суток Интактные+ лазер Реперфузия 7 суток + лазер
14:0 — миристиновая кислота 0,96±0,04 *0,64±0,03 *0,87±0,04 *0,33±0,02 0,96±0,05
16:1 — пальмитоолеиновая кислота 3,96±0,08 *4,48±0,16 *5,22±0,14 *3,42±0,05 **3,94±0,07
16:0 — пальмитиновая кислота 12,82±0,13 *12,46±0,04 *12,45±0,05 *11,94±0,12 * **10,71±0,3
18:2 — линолевая кислота 9,25±0,11 *8,35±0,21 *8,09±0,24 *10,75±0,11 * **9,44±0,09
18:1 — олеиновая кислота 18,69±0,14 *20,29±0,64 *19,87±0,27 *18,25±0,14 * **19,26±0,12
18:0 — стеариновая кислота 2,28±0,07 *4,03±0,14 *3,99±0,12 *3,74±0,08 * **4,28±0,11
20:4 — арахидоновая кислота 0,11±0,03 *1,21±0,09 *1,57±0,06 *0,32±0,02 * **0,24±0,03
£ СЖК 48,06±0,15 *51,46±0,41 *52,06±0,4 *48,75±0,14 * **47,83±0,11
£ насыщенных СЖК 16,06±0,12 *17,13±0,14 *17,31±0,14 10,01±0,11 **15,95±0,12
£ ненасыщенных СЖК 32,01±0,18 *34,32±0,28 *34,75±0,25 *32,74±0,15 * **32,88±0,13
1п=£ СЖК насыщ./£ СЖК ненасыщ. 0,5 0,5 0,5 0,49 0,49
Примечание: £ — суммарный пул, СЖК — свободные жирные кислоты, 1п — индекс насыщенности, * — отличия достоверны в сравнении с интактными животными при Р<0,05, ** — отличия достоверны при сравнении 7 сутокреперфузии с воздействием лазерным излучением и группой (7 суток) без коррекции при Р<0,05.
и указывает на развитие токсиколимфии. Усилению эндотоксикоза и активации ПОЛ соответствует и аналогичное увеличение по сравнению с нормой пула СЖК и доли арахидоновой кислоты в крови соответственно на 16,94% и в 6 раз, что представлено в таблице 2.
Показано, что в нормальных условиях пул СЖК в центральной лимфе превышает таковой в крови на 10,9%. Однако, в динамике постишеми-ческой рециркуляции указанная разница уменьшается до 3,5 и 4,7% к 1-м и 7-м суткам соответственно, тем самым свидетельствуя об усилении сброса лимфы в кровеносное русло.
Именно этим механизмом, очевидно, регулируется важное для достижения окислительного гомеостаза постоянство долевых вкладов насыщенных и способных выступать субстратами ПОЛ ненасыщенных СЖК в крови, о чем позволяет судить величина индекса насыщенности. Механизмом регуляции окислительного гомеостаза за счет усиления сброса лимфы в кровеносное русло можно объяснить практически неизменную величину 1п в крови в динамике эксперимента: 1п=0,35 — нормальные условия и 1п=0,36 — ишемия-реперфузия 1-х и 7-х суток (Таблица 1). Обратной стороной этого процесса является активация ПОЛ в центральной лимфе, на что указывает возрастание долевых вкладов ненасыщенных СЖК и, следовательно, уменьшение величины индекса насыщенности: 1п=0,29 — нормальные условия и 1п=0,25 в обоих периодах
реперфузии (Таблица 2). Аналогичная тенденция выявлена и для ишемизированной икроножной мышцы: 1п=0,72 — нормальные условия и 1п=0,60 для условий реперфузии.
Обращает на себя внимание факт постоянства долевых вкладов насыщенных и ненасыщенных СЖК, что находит выражение в практически неизменных в динамике эксперимента индексах насыщенности, рассчитанных для регионарных к зоне ишемии лимфатических узлов. Представленные в таблице 3 данные о распределении и накоплении СЖК в пробах подвздошного лимфатического узла выявляют постоянство величины 1п=0,50 в динамике всего эксперимента. Анализ долевых вкладов насыщенных и ненасыщенных СЖК, выполненный для ишемизированно-го подколенного лимфатического узла, выявил аналогичную тенденцию: 1п=0,48 — нормальные условия, 1п=0,47 и 1п=0,48 для 1-х и 7-х суток реперфузии. Полученные данные не только указывают на сохранение лимфатическими узлами дренажно-детоксикационной функции, но выявляют присущую лимфатическим узлам функцию регуляции окислительного гомеостаза.
Подтверждением сказанному является и обнаруженное в условиях эксперимента наименьшее по сравнению с нормой возрастание пула СЖК для проб подвздошного и подколенного лимфатических узлов соответственно на 4 и 4,5% в позднем (7 суток) реперфузионном периоде.
Выявлено корригирующее воздействие на
органы и ткани низкоэнергетического лазерного излучения в условиях ишемии-реперфузии с позиций влияния на процессы ПОЛ. Так, для всех объектов исследования показано ослабление патогенной активации ПОЛ с приближением к стационарным, характерным для нормальных условий, величин пула СЖК, тем самым прекращаются процессы развития токсиколимфии и эн-дотоксикоза (Таблицы 1-3). Выявлена тенденция приближения к норме разницы между величинами пулов СЖК в центральной лимфе и крови
— 7,8%, что указывает на ослабление процесса сброса лимфы в кровеносное русло. Низкоэнергетическое лазерное излучение приводит к существенному перераспределению долевых вкладов насыщенных и ненасыщенных СЖК во всех изучаемых объектах: совокупная величина пула ненасыщенных СЖК по сравнению с условиями ишемии-реперфузии существенно уменьшается, практически соответствуя норме. Это находит выражение в возрастании величины индексов насыщенности: 1п=0,31 — центральная лимфа, 1п=0,37
— кровь, 1п=0,74 — икроножная мышца. Изменения в соотношении долевых вкладов насыщенных и ненасыщенных СЖК в пробах изучаемых лимфатических узлов обеспечивают одинаковую величину 1п=0,49.
Выводы. Анализ и обобщение выявленных в настоящей работе данных позволили сделать следующие выводы:
1. Показано развитие токсиколимфии в условиях циркуляторной гипоксии с последующей постишемической рециркуляцией.
2. В динамике эксперимента выявлено усиление сброса лимфы в кровеносное русло. Регуляция окислительного гомеостаза выражается в стабилизации относительного пула ненасыщенных СЖК — основных субстратов ПОЛ.
3. Показано сохранение дренажно-детокси-кационной функции регионарными к ишемизи-рованной конечности лимфатическими узлами
— подколенным и подвздошным.
4. Выявлена способность к регуляции окислительного гомеостаза как для находящегося в зоне ишемии подколенного лимфатического узла, так и для регионарного к ней подвздошного лимфатического узла.
5. Выявлено ослабление патогенной активации ПОЛ с приближением к стационарным, характерным для нормальных условий, величинам пула СЖК и долевого вклада в нем ненасыщенных представителей при воздействии низкоэнергетического лазерного излучения.
Lymphatic system at oxidative homeostasis when creating model of circulatory disturbances and under its correction by way of low-intensive laser radiation
T.A. Astashova, Y.A. Antsyreva, O.V. Kazakov, S.V. Morozov
A role of lymphatic system in maintenance of oxidative homeostasis has been investigated in normal conditions, when creating model of ischemia-reperfusion of hind extremities of male rats and under correction by way of low-intensive laser radiation on ischemized extremities. Regularities of accumulation and distribution of free fatty acids as markers of pathogenic activation of lipid peroxidation in central lymph, blood, popliteal and ileal lymph nodes, gastrocnemius muscle have been investigated.The research revealed development of toxicolymphia and endotoxicosis, increase of throw of lymph into blood circulation in condition of ischemia-reperfusion. Regulation of oxidative ho-meostasis was expressed in stabilization of relative pool of non-estheric acids - basic POL substrata. The investigation showed maintenance of drainage-detoxication function and capacity for regulation of oxidative homeostasis by regional to ischemized extremity lymph nodes (popliteal and ileal).The research revealed weakening of pathogenic lipid peroxidation with approaching to stationary typical for normal conditions figures of free fatty acids pool and share of non-estheric representatives in it under impact of low-intensive laser radiation.
Литература
1. Биленко М.В. Ишемические и реперфузион-ные повреждения органов / М.В. Биленко. — М., 1989. — 368 с.
2. Бородин Ю.И. Проблемы лимфодеток-сикации и лимфосанации / Ю.И. Бородин // Проблемы экспериментальной, клинической и профилактической лимфологии: Материалы международного симпозиума. — Новосибирск, 2000. — С. 5-9.
3. Исследование крови и лимфы при экспериментальной ишемии миокарда и артериальной гипертензии / Ю.И. Бородин, В.В. Асташов, И.А. Голубева и др. // Бюлл. экспер. биол., 1992. — Т. 100. — № 6. — С. 349-352.
4. Климов А.Н. Обмен липидов и липопротеи-дов и его нарушения /А.Н. Климов, Н.Г. Никуль-чева. — СПб., 1999. — 505 с.
5. Кузнецов А.В. Новый способ забора лимфы у животных / А.В. Кузнецов // Бюлл. экспер. биол., 1992. — Т. 116. — № 9. — С. 329-331.
6. Левин Ю.М. Лечение, оздоровление, профилактика в условиях кризиса экологии организма / Ю.М. Левин. — М., 1998. — 231 с.
7. Перекисное окисление и стресс /В.А. Бара-бой, И.И. Брехман, В.Г. Гологин, Ю.Б. Кудряшов. — СПб., 1992. — 148 с.
