CC BY
183
УДК 579.835:62(577.152.1)
Петров С.В.1, Купряшина М.А. 2, Глинская Е.В.1, Никитина В.Е. 2
1Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского 2Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук, Саратов E-mail: [email protected]
ЛИГНИН-ПЕРОКСИДАЗА ФЕНОЛОКСИДАЗНОГО КОМПЛЕКСА АССОЦИАТИВНЫХ БАКТЕРИЙ AZOSPIRILLUM BRASILENSE
Впервые установлена способность бактерий A. brasilense к росту на лигнинсодержащих субстратах, обнаружена лигнинолитическая активность, которая в большей степени выражена у эн-дофитного штамма. Впервые обнаружена способность бактерий A. brasilense к деградации лигнина. Впервые получен чистый препарат бактериальной внеклеточной лигнин-пероксидазы. Высказано предположение об участии данного фермента в лигниндеградирующей способности азоспирилл.
Ключевые слова: лигнин-пероксидаза, Azospirillum brasilense, лигниндеградация.
На сегодняшний день по-прежнему актуальна проблема молекулярных механизмов симбиотических взаимодействий микроорганизмов с растением в ризосфере. Одними из наиболее исследуемых почвенных ассоциативных бактерий являются Альфа-протеобакте-рии рода АгощпИит [1]. Некоторые штаммы данного рода способны к исключительно тесному взаимодействию с растением-хозяином, в том числе, и к колонизации внутренних структур корня [2]. Однако механизмы проникновения эндофитных штаммов до конца не ясны. Наряду с протеолитическими и пектолитичес-кими ферментами, обнаруженными у азоспи-рилл, бактериям, вероятнее всего, нужна внеклеточная неспецифическая окислительная система, позволяющая деградировать и лигнино-подобные соединения.
Некоторыми исследователями предполагается возможность использования бактериями, способными к разрушению полифенольных соединений, ферментной лигниндеградирующей системы, аналогичной таковой у грибов [3]. Одним из ключевых ферментов лигнинолити-ческих комплексов грибов, является лигнин-пероксидаза - фермент, относящийся к классу ок-сидоредуктаз, и играющий центральную роль в биодеградации лигниноподобных соединений, являющихся компонентами растительной клеточной стенки [4]. В научной литературе крайне фрагментарны сведения о способности бактерий к продукции данного фермента.
Относительно недавно, нами впервые в культуральной жидкости Агозрт11ит Ьтазйете обнаружена активность лигнин-пероксидазы [5]. Мы предположили, что продукция данного
фермента азоспириллами может опосредовать способность бактерий к деградации лигнино-подобных соединений и, как следствие, проникающую способность эндофитных штаммов. Целью данной работы явилось обнаружение способности бактерий А. ЬтазИете к деградации лигнина, а также выделение и очистка внеклеточной лигнин-пероксидазы.
Материалы и методы
В качестве объекта исследования в работе использовались: эпифитный штамм А. Ьгазйете Sp7 и эндофитный штамм А. ЬтазИете Sp245 из коллекции микроорганизмов ИБФРМ РАН. Культивирование бактерий осуществлялось при 30°С на жидкой и агаризованной (2%) ма-латно-солевой среде [6].
Для выявления способности азоспирилл к деградации лигнина, исследуемые штаммы выращивали на среде с добавлением 0,1% танина [7]. Для подтверждения способности азоспирилл к росту на лигнинсодержащих субстратах, оценивался бактериальный рост на плотной агаризованной среде содержащей 0,5% модельного соединения лигнина Классона [8].
Активность лигнин-пероксидазы определяли по скорости окисления вератрилового спирта до вератрового альдегида при длине волны 310 нм [9].
Результаты и обсуждение
На первые сутки роста на среде содержащей танин ни одна из исследуемых культур не давала коричневого окрашивания, что свидетельствовало об отсутствии процесса окисления. Спустя двое суток культивирования отме-
Естественные науки
чалось появление коричневой окраски субстрата вблизи растущего края колоний только у A. brasilense Sp245. Данная цветная реакция имеет название реакции Бавендамма и обнаруживает ферменты, выделяемые деструкторами лигнина и окисляющие танин [7]. Способность к разложению лигнина A. brasilense Sp7 наблюдалась лишь на 5-е сутки роста.
При оценке способности азоспирилл к росту на плотной агаризованной среде, содержащей 0,5% лигнина, установлено, что A. brasilense Sp7 проявлял умеренный рост на среде с добавлением лигнина Классона, полученного из метано-лизных опилок, тогда как на среде с модельным соединением - из нативных опилок, для данного штамма характерен слабый рост. По данным литературы, использование метанолизных лиг-нинсодержащих субстратов стимулирует развитие и накопление биомассы ксилотрофных ба-зидиомицетов в большей степени, по сравнению с нативным лигнином, что согласуется с полученными нами данными для штамма A. brasilense Sp7. Напротив, рост колоний A. brasilense Sp245 был активнее на среде с лигнином, выделенным из нативных опилок. Следует отметить, что эн-дофитный штамм был способен расти на лиг-нинсодержащих средах без добавления, в качестве затравки, малата натрия, тогда как эпифит-ный штамм даже с внесением дополнительного источника углерода в среду культивирования проявлял рост лишь в начале штриха.
Установлено, что оба штамма в зоне роста обесцвечивают агаризованную среду, содержащую 0,5% лигнин Классона (независимо от метода получения модельного соединения). В среднем, зоны лизиса проявляются как у A. brasilense Sp245, так и у Sp7 на 4-5 сутки выращивания. Полученные данные согласуются с работами по разложению модельных соединений лигнина P. aeruginosa, S. marcescens, Pandoraea norimbergensis LD001, Pseudomonas sp. LD002 и Bacillus sp. LD003; при культивировании данных микроорганизмов деградация лигнинсодержащих субстратов, аналогично азоспириллам, приходится на 4-6 сутки [8].
Таким образом, в ходе исследования нами впервые показано, что представители рода Azospirillum проявляют способность к росту на
лигнинсодержащих субстратах и обладают лигнинолитической активностью, в большей степени выраженной у эндофитного штамма A. brasilense Зр245, по сравнению с эпифитным.
Для выделения внеклеточной лигнин-пе-роксидазы использовали 24- часовую культуру бактерий A. brasilense Sp245, выращенных на жидкой малатно-солевой среде. Клетки осаждали центрифугированием, супернатант использовали для дальнейшей очистки, которая состояла из ряда стадий: дробное осаждение белков культуральной жидкости сульфатом аммония; селективная сорбция примесей на геле CaF2 (за основу взят метод, предложенный Новаковс-ким с соавторами [10]); гель-фильтрация на колонке PD10 (Sigma-Aldrich, Швеция), уравновешенной 0,05 М Тпз-НС1-буфером, рН 7,5, а также ионообменная хроматография на колонке с носителем Тоуореаг1 DEAE-650M (ТозоЬ, Япония), уравновешенной тем же буфером, с проведением элюции в ступенчатом градиенте №С1.
Разработанная схема очистки позволила получить электрофоретически гомогенный препарат со степенью очистки 12,5 раз и белковым выходом 40%. Установлено, что выделенный фермент окисляет вератриловый спирт, специфический тестовый субстрат лигнин-перокси-даз, только в присутствии Н202, при этом увеличение концентрации Н202 приводит к снижению ферментативной активности. Удельная активность фермента составила 537,6 ед/мг. рН-оптимум реакции окисления вератрилового спирта, до вератрилового альдегида при 30°С находился при рН 3,5. Температурный оптимум 28°С. По данным электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях молекулярная масса лигнин-пероксидазы A. brasilense Sp245 ~ 35 кДа.
Таким образом, впервые выделена и очищена до электрофоретически гомогенного состояния бактериальная внеклеточная лигнин-пе-роксидаза. Дальнейшее исследование фермента позволит подтвердить или опровергнуть ранее высказанное предположение о возможном участии лигинин-пероксидазы в проникновении эндофитных штаммов азоспирилл внутрь корня, и нахождения там в метаболически активном состоянии.
18.09.2014
Список литературы:
1. Bashan Y., Holguin G., de-Bashan L.E. Azospirillum-plant relationships: physiological, molecular, agricultural, and environmental advances (1997-2003) // Can. J. Microbiol. - 2004. - V. 50. - P. 521-577.
Петров С.В. и др.
Лигнин-пероксидаза фенолоксидазного комплекса..
2. Saikia S.P., Bora D., Goswami A. et al. A review on the role of Azospirillum in the yield improvement of non-leguminous crops / / African J. Microbiol. Res. - 2012. - V. 6. - P. 1085-1102.
3. Bugg T.D.H., Ahmad M., Hardiman E.M. et al. The emerging role for bacteria in lignin degradation and bio-product formation // Curr. Opin. Biotech. - 2011. - V. 22. - P. 394-400.
4. Banci L., Bartalesi I., Ciofi-baffoni S. et al. Ufolding and pH studies on manganese peroxidase: role of heme and calcium on secondary structure stability // Biopolym. (Biospectroscopy). - 2003. - V. 72. - P. 38-47.
5. Никитина В.Е., Купряшина М.А., Петров С.В., и др. Влияние условий культивирования на лигнин-пероксидазную активность эндофитного и эпифитного штаммов Azospirillum brasilense // Известия СГУ. Серия «Химия. Биология. Экология». - 2012. - V. 12. - №4. - P. 52-56.
6. Sadasivan L., Neyra C.A. Flocculation in Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum: exopolysaccharides and cyst formation // J. Bacteriol. - 1985. - V. 163. - №2. - P. 716-723.
7. Мокрушина Н.С., Тарасова Т.С., Дармов И.В. Выделение микромицетов, перспективных для разработки на их основе препарата для ускоренной переработки древесных отходов в удобрение // Вестник Нижегород. университета. - 2010. -V. 2. - P. 430-434.
8. Bholay A.D., Borkhataria Bhavna V., Jadhav Priyanka U. et al. Bacterial lignin peroxidase: A tool for biobleaching and biodegradation of industrial effluents // Univ. J. Environ. Res. Technol. - 2012. - V. 2. - №1. - P. 58-64.
9. Orth A.B., Royse D.J., Tien M. Ubiquity of lignin-degrading peroxidases among various wood-degrading fungi // Appl. Envir. Microb. - 1993. - V. 59. - №12. - P. 4017-4023.
10. Новаковский М.Е., Дрожденюк А.П., Эпштейн Т.В., и др. Новый нехроматографический метод выделения стрептавидина из культуральной жидкости Streptomyces avidinii: сравнение с аффинной хроматографией на иминобиотин-сефарозе // Биотехнология. - 2006. - V. 42. - №1. - P. 68-75.
Сведения об авторах:
Петров Сергей Викторович, аспирант кафедры микробиологии и физиологии растений биологического факультета Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского,
е-шаП: [email protected]
Глинская Елена Владимировна, доцент кафедры микробиологии и физиологии растений биологического факультета Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского, кандидат биологических наук, е-таП: [email protected]
410012, г. Саратов, ул. Астраханская, 83
Купряшина Мария Александровна, младший научный сотрудник лаборатории микробиологии Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук, е-таП: [email protected]
Никитина Валентина Евгеньевна, профессор, заведующий лабораторией микробиологии Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук, доктор биологических наук, е-mail: [email protected]
410049, г. Саратов, пр-т Энтузиастов, 13
