CC BY
188
УДК:618.14-006.363.04-07-037
леиомиосаркома тела матки: некоторые молекулярно-биологические критерии прогноза
А.м. Авдалян1, и.п. Бобров1, Б.Б. Климачев2, Е.Б. мищенко2, А.Ф. лазарев1
Алтайский филиал РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, г. Барнаул1 Алтайский государственный медицинский университет, г. Барнаул2 656049, г. Барнаул, ул. Никитина, 77; e-mail: ashot_avdalyan@mail.ru1
Проведен ретроспективный анализ экспрессии молекулярно-биологических маркеров Ki-67, p53, BCL-2, Ag-ОЯОР-белков в клетках опухоли и прилежащем миометрии с определением прогностической значимости степени экспрессии каждого маркера. Относительно неизмененного миометрия лейомиосаркома характеризовалась значительным увеличением экспрессии белка Ki-67 в 71,1 ± 6,7 % случаев, со степенью до 24,8 ± 7,4 %; BCL-2 - в 71,1 % случаев, со степенью до 72,6 ± 6,1 %; гиперэкспрессией р53 до 14,5 ± 4,5 % и ростом числа Ag-ОЯОР-белков до 23,7 ± 2,9. Многофакторный регрессионный анализ прогностической значимости изученных маркеров по Коксу для 10-летней выживаемости показал, что экспрессия Ki-67 более 12,2 %, снижение степени или отсутствие экспрессии BCL-2, гиперэкспрессия p53, увеличение числа Ag-ОЯОР-белков более 23,6 являются показателями неблагоприятного прогноза. Однако лишь количество Ag-ОЯОР-белков при показателе х2=16,8 (р=0,00007) является независимым критерием прогноза у больных лейомиосаркомой тела матки.
Ключевые слова: лейомиосаркома тела матки, молекулярно-биологические маркеры, критерии прогноза.
UTERINE CORPUS LEIOMYOSARCOMA: SOME MOLECULAR AND BIOLOGICAL PROGNOSTIC CRITERIA A.M. Avdalyan1, I.P. Bobrov1, V.V. Klimachev2, E.V Mischenko2, A.F. Lazarev1 Altai Affiliation of N.N. Blokhin RCRC RAMS, Barnaul1,
Altai State Medical University, Barnaul2 77, Nikitina str., 656049-Barnaul, e-mail: ashot_avdalyan@mail.ru1
Retrospective analysis of Ki-67, p53, BCL-2, Ag-NOR-proteins expression in tumor cells and adjacent myometrium was carried out. With regard to unchanged myometrium, leiomyosarcoma was characterized by significant increase in Ki-67 expression to 24,8 ± 7,4 % in 71,1 ± 6,7 % of cases and BCL-2 expression to 72,6 ± 6,1 % in 71,1 % of cases as well as by p53 hyperexpression to 14,5 ± 4,5 % and increase in the level of Ag-NOR-proteins to 23,7 ± 2,9. Multi-factor regression analysis of prognostic significance of investigated markers by Cox for 10-year recurrence-free survival of patients having sarcoma demonstrated that Ki-67 expression of more than 12,2 %, decrease in or absence of BCL-2 expression, p53 hyperexpression and increase in the level of Ag-NOR proteins more than 23,6 were the factors of unfavorable prognosis. However, only the number of Ag-NOR-proteins at index of %2=16,8 (р=0,00007) was independent prognostic factor in patients with lemiosarcoma of the uterus.
Key words: uterine corpus leiomyosarcoma, molecular and biological markers, prognostic criteria.
Лейомиосаркома (ЛМС) тела матки является относительно редкой злокачественной опухолью, заболеваемость которой в США составляет 0,64 на 100000 населения [11]. В Алтайском крае за период с 1996 по 2006 г. было выявлено 266 первичных больных с данной патологией. До настоящего времени остается дискутабельным вопрос о критериях, определяющих прогноз при ЛМС, по данным различных авторов, 5-летняя выживаемость у данной категории больных колеблется от 18,8 до 65 % [3, 5, 9, 12]. Такой разброс в показателях выживаемости обусловлен различными причинами, ведущими из которых являются клинико-морфологические факторы [17]. Достаточно изученными морфологическими критериями, влияющими на отдаленную
выживаемость при ЛМС, являются глубина инвазии миометрия и сосудов, наличие некрозов опухолевых клеток, степень выраженности клеточной атипии, уровень митотической активности. Эти параметры легли в основу системы определения степени злокачественности мягкотканых сарком, предложенной французским центром борьбы с раком FNCLCC [10].
Вместе с тем остается много нерешенных вопросов о прогностической значимости целого ряда молекулярно-биологических характеристик клеток лейомиосаркомы тела матки, таких как состояние системы регуляции апоптоза по данным амплификации генов р53 и BCL-2, пролиферативная активность по уровню экспрессии белка Ю-67, активность аргирофильных бел-
ков области ядрышковых организаторов (Ag-ОЯОР), хотя эти маркеры являются достаточно изученными молекулярно-биологическими параметрами прогноза при злокачественных опухолях других локализаций, в том числе и неэпителиальных [6, 14, 15].
Исходя из вышеизложенного, целью исследования стало определение уровня экспрессии Ki-67, BCL-2, р53, Ag-ОЯОР с установлением их прогностической значимости.
Материал и методы
В исследование вошли 76 случаев ЛМС тела матки с известным исходом заболевания у больных, оперированных в Алтайском краевом онкологическом диспансере в период с 1996 по 2006 г. Во всех случаях исследовали прилежащий мио-метрий и опухоль. Степень злокачественности определяли по 3-степенной (G1-3) системе FNCLCC [7]. Уровень экспрессии молекулярнобиологических маркеров (в %) р53 (клон DO-7, «DAKO»), BCL-2 (клон 124, «DAKO») и Ki-67 (клон MIB-1, «DAKO») определяли при помощи иммуногистохимического метода по рекомендованным производителем протоколам. Степень экспрессии определяли полуколичественным способом по интенсивности окраски DAB (1+; 2+; 3+). Оценку активности аргирофильных белков ядра проводили на препаратах, окрашенных нитратом серебра по стандартизованной методике, предложенной «Международным комитетом по количественной оценке Ag-ЯОР-белков» [8, 16], в ручном режиме просчета с помощью программы Image Tool 3.0 [1]. Безрецидивную
10-летнюю выживаемость определяли методом Каплан-Мейера. Статистическую обработку проводили при помощи компьютерной программы STAПSTICA 6.0.
Результаты и обсуждение
В неизмененном миометрии экспрессия К>67 выявлена в 34,2 % случаев, при этом уровень экспрессии в среднем составил 0,2 ± 0,05 %, не превышая 1,1 % (таблица). В ткани ЛМС белок Ю-67 находили в 71,1 ± 6,7 % случаев. Средний уровень экспрессии составил 12,2 ± 2,9 %, однако этот показатель значительно варьировал в зависимости от степени злокачественности опухолевых клеток. Так, в ЛМС со степенью G1 он был статистически значимо ниже по отношению к G3 - 5,1 ± 1,3 % и 24,8 ±
7,4 % соответственно (рис. 1а, б).
При анализе зависимости 10-летней выживаемости от уровня экспрессии Ю-67 было отмечено, что при отсутствии экспрессии либо при ее средних значениях ниже 12,2 % 10 лет пережили 61,7 ± 9,7 % больных (рис. 2а.). При превышении данного уровня отдаленные результаты были значительно хуже: до 10 лет не дожила ни одна больная, 5-летняя выживаемость равнялась 15,9 ± 7,6 %, медиана - 2 года. Многофакторный анализ прогностической значимости критериев по Коксу определил показатель %2=10,7, при р=0,001.
Наличие белка супрессора-апоптоза (БСЬ-2) в слабой и умеренной степени выявляли практически в 95 % случаев в смежном неизмененном миометрии, а количество клеток, экспрессирую-
Таблица
Показатели молекулярно-биологических маркеров в неизмененном миометрии и при лейомиосаркоме различной степени злокачественности
Маркер Миометрий Лейомиосаркома
Средний показатель G1 G2 G3
Ki-67 0,2 ± 0,05 % (0,1-1,1) 12,2 ± 2,9 % (0,3-73,2) 5,1 ± 1,3 %* (0,5-20,6) 10,1 ± 4,2 % (0,5-24,2 24,8 ± 7,4 %* (0,5-73,2)
BCL-2 58,1 ± 7,1 % (5,9-99,2) 72,6 ± 6,1 % (5,6-99,2) 71,9 ± 7,9 % (7,7-99) 62,1 ± 15 % (12-92) 83,2 ± 12,9 % (5,6-98,3)
p53 0 14,5 ± 4,5 % (0,1-62,5) 7,8 ± 5,1 %* (0,1-62,5) 0,6 ± 0,08 % (0,4-0,7) 28,1 ± 8,1 %* (7,7-59,8)
Ag-NOR 3,7 ± 0,3 (1,7-12) 23,7 ± 2,9 (7,8-108) 17,8 ± 1,9* (7,8-38,3) 21,2 ± 2,3 (10,8-28,1) 34,3 ± 7,8* (12,1-108)
Примечание: * - различия между группами статистически значимы (р<0,05)
СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2010. №1 (37)
щих белок, составило 58,1 ± 7,1 % (таблица), что согласуется с мнением ряда авторов о конституциональном свойстве экспрессии белка в миометрии [13]. При ЛМС БСЬ-2 определяли значительно реже, чем в неизмененном миометрии, - в 71,1 % случаев находили экспрессию белка. Вместе с тем в ЛМС степень экспрессии БСЬ-2 была значимо выше смежного миометрия - 72,6 ± 6,1 % (рис. 1в.). Зависимости от степени злокачественности выявлено не было. Наличие экспрессии белка оказывало статистически значимое влияние на 10-летнюю выживаемость: при экспрессии белка прогноз был значительно лучше - 44,9 ± 11,2 %, медиана - 5,8 года (рис. 2б), в то время как при отсутствии экспрессии 10 лет пережило 29,6 ± 8,3 % больных, медиана - 1,5 года. Многофакторный анализ прогностической значимости критериев по Коксу определил показатель х2=5,4 (р=0,01).
Рис. 1. Микрофото. Экспрессия маркеров клетками лейомиосаркомы:
а) экспрессия Ki-67 в ЛМС G1 (ИГХ, хромоген DAB, х400);
б) экспрессия Ki-67 в ЛМС G3 (ИГХ, хромоген DAB, х400);
в) гиперэкспрессия (3+) BCL-2 в ЛМС, инвазия в сосуды
(ИГХ, хромоген DAB, х200); г) экспрессия (1+-2+) р53 в ЛМС, в центре гигантская клетка с гиперэкспрессией гена (ИГХ, хромоген DAB, х400); д) гиперэкспрессия (3+) р53 в ЛМС, инвазия в миометрий, в нижнем левом углу деталь опухоли (ИГХ, хромоген DAB, х200; х400); е) различный уровень экспрессии Ag-ОЯОР-белков (внутриядрышковый и кариоплазматический кластеры) клетками ЛМС: слева - гиперэкспрессия, справа - низкая экспрессия (окраска AgNO3 по международным рекомендациям [8])
В неизмененном миометрии экспрессию гена-активатора апоптоза р53 не выявили ни в одном из 76 исследованных случаев. В ЛМС его амплификацию находили в 65,8 % случаев. В среднем активность гена выявлена в 14,5 ±
4,5 % клеток. Была обнаружена зависимость экспрессии гена от степени злокачественности: при G1 амплификацию находили в 7,8 ± 5,1 %, при G3 - в 28,1 ± 8,1 % клеток (таблица). Степень экспрессии при его амплификации в 73,9 % была от 1+ до 2+, в 16,1 % выявлена гиперэкспрессия гена (рис. 1г, д.). Само по себе наличие экспрессии никак не сказывалось на 10-летней выживаемости, однако в группе с наличием амплификации гена прогноз был значимо хуже при его гиперэкспрессии: 3-летняя выживаемость составила 34,3 ± 10,6 %, 10-летняя - 0 %, медиана -2,1 года. При слабой и умеренной
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 —отрицат
— - положительно
Время (дни)
экспрессии гена прогноз был значительно лучше - 63,4 ± 5,2 % (рис. 2в.). Многофакторный анализ прогностической значимости критериев по Коксу определил показатель х2=8,3, при р=0,003.
Рис. 2. Показатели 10-летней выживаемости больных ЛМС (кумулятивная пропорция выживших; по Каплан-Мейер) в зависимости от уровня экспрессии маркеров пролиферации и апоптоза, Аg-ОЯОР-белков: а) при различном уровне экспрессии КІ-67; б) при наличии или отсутствии экспрессии В^-2; в) при различной степени экспрессии р53; г) при наличии либо отсутствии коэкспрессии генов В^-2 и р53; д) при различной экспрессии Ag-ОЯОР-белков
Известно, что появление и прогрессия наиболее злокачественного пула клеток в опухолевом поле сопровождается ростом пролиферативной активности, ингибированием активации и снижением уровня апоптоза [2, 4]. Можно
предположить, что данные взаимоотношения должны определяться паритетом между геном супрессором и активатором апоптоза (BCL-2 и р53 соответственно). При нарушении этого равновесия в ту или иную сторону должен активироваться злокачественный пул клеток с итогом в виде значительной опухолевой прогрессии и ухудшением прогноза. Анализ коэкспрессии маркеров показал, что отсутствие того или иного гена (отрицательный паритет) значимо ухудшало 10-летнюю выживаемость: 22,8 ± 11,6 %, против 54,9 ± 9,5 % при коэкспрессии генов (положительный апопаритет; рис. 2г). %2 для изученных параметров - 5,4; р=0,05.
Общее число Ag-ОЯОР-белков в ядре (внутриядрышковый и кариоплазматический кластер) в клетках саркомы было 23,6 ± 15,1 (таблица; рис. 1е), что было статистически значимо выше прилежащего миометрия - 3,7 ± 0,3. Анализ влияния параметра на прогноз показал, что при среднем уровне аргирофиль-ных белков ниже 23,6 10-летняя выживаемость составила 66,8 ± 8,9 %. При количестве белков, превышающем этот средний уровень, 10-летняя выживаемость была достоверно ниже и не превышала 17,2 ± 9,6 % (р=0,003; рис. 2д). При многофакторном анализе по Коксу количество белков стало независимым критерием - %2=16,8: р=0,00007.
Таким образом, полученные данные позволяют утверждать, что высокий пролиферативный статус опухоли по уровню экспрессии Ki-67 (более 12 %) является показателем неблагоприятного прогноза у больных лейомиосаркомой тела матки. Кроме того, слабая и умеренная экспрессия BCL-2 в неизмененном миометрии оказывается органоспецифичной для ГМК миометрия, в то же время отсутствие экспрессии этого белка в ГМК лейомиосаркомы матки является прогностически неблагоприятным
критерием. Гиперэкспрессия р53 является показателем худшего прогноза по сравнению с ЛМС, в которых выявляется относительно слабый и умеренный уровень экспрессии р53. Коэкспрессия BCL-2 и р53 (положительный апопаритет) являются прогностически благоприятным показателем, тогда как отсутствие экспрессии одного из маркеров приводит к снижению 10-летней выживаемости. Увеличение числа Ag-ОЯОР-белков более 23,4 оказывает негативное влияние на исход заболевания при лейомиосаркоме тела матки.
ЛИТЕРАТУРА
1. Автандилов Г.Г. // Вопросы онкологии. 2000. Т. 46, № 4. С. 423-426.
2. Введение в молекулярную биологию канцерогенеза / Под ред. Ю.Л. Шевченко. М.: Гэотар-Мед, 2003. 222 с.
3. Гагуа И.Р., Кузнецов В.В., Лазарева Н.И. и др. // Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. 2007. Т.18, № 3. С. 23-31.
4. Имянитов Е.Н., Хансон К.П. Молекулярная онкология: клинические аспекты. СПб.: СПбМАПО, 2007. 211 с.
5. Клиническая онкогинекология: Руководство для врачей / Под ред. В.П. Козаченко. М.: Медицина, 2005. С. 178-220.
6. Райхлин Н.Т., Букаева И.А., Смирнова Е.А. и др. // Архив патологии. 2008. Т. 70, № 3. С. 15-18.
7. Франк Г.А. // Практическая онкология. 2004. Т. 5, № 4. С. 231-236.
8. AubeleM., BieterferdS., Derenzini M. et al. // Zentralbl. Pathol.
1994. Vol. 140 (1). P 107-108.
9. Coindre J.M., Terrier P., Guillou L. et al. // Cancer. 2001. Vol. 19 (10). P. 1914-1926.
10. Fédération Nationale des Centres de Lutte contre le Cancer. Standards, Options, et Recommandations. Sarcomes des Tissus Mous et Ostéosarcomes, Vol. 1, 1st edition. Paris: Arnette Blackwell, 1995. P. 6-113.
11. Harlow B.L., Weiss N.S., Lofton S. // J. Nat. Canc. Inst. 1986. Vol. 76 (3). P 160-161.
12. Livi L., Paiar F., Shah N. et al. // Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2003. Vol. 57 (5). P 1366-1373.
13. MatsuoH., Maruo T., Samoto T. // J. Clin. Endocrinol. Metabol. 1997. Vol. 82 (1). P. 293-299.
14. Nordal R.R., Kristensen G.B., Kaern J. et al. // Acta Oncol.
1995. Vol. 34. P. 797-802.
15. PichA., ChiusaL., MargariaE. // Micron. 2000. Vol. 31 (2). P. 133-141.
16. Trere D. // Micron. 2000. Vol. 31 (2). P 127-131.
17. Trojani M., Contesso G., Coindre J.M. et al. // Int. J. Cancer. 1984. Vol. 33. P. 37-42.
Поступила 6.07.09
