CC BY
49
ЛЕКТИНЗАВИСИМЫЙ АДГЕЗИИ КАК ПЕРСПЕКТИВНЫЙ КОМПОНЕНТ КОМПОЗИТНОГО ПРОБИОТИКА
И.В. Анохина, Э.Г. Кравцов, Н.В. Яшина,
А.В. Ермолаев, В.Л. Чеснокова, М.В. Далии
Кафедра микробиологии Российский университет дружбы народов Ул. Миклухо-Маклая, 8, J17J98 Москва, Россия
Среди производственных штаммов лактобацилл одни обладают высокой адгезивной активностью, а другие экскретируют в среду культивирования лектинзависимый компонент. Фракционирование концентрата культуральной жидкости L.fermentum штамма 90 TS-4(21) клон 3 позволило установить, что данный компонент представляет собой кислый гликопротеид с молекулярной массой от 100 до 300 кДа, модулирующий адгезию тест-культур на клетках-мишенях.
Терапевтическое действие пробиотиков рассматривается как результат конкурентного отношения между «полезными» бактериями и бактериями, вызывающими патологические процессы в макроорганизме.
Благоприятное воздействие пробиотических препаратов на основе лактобактерий в равной степени зависит, как от их способности индуцировать «колонизационную резистентность», иначе говоря препятствовать гранслокации патогенных микроорганизмов во внутреннюю среду макроорганизма за счет образования микропленки на поверхности слизистых, так и от того, какие адгезины экспрессирует и экскретирует микроорганизм в среду микроэкологической ниши [1; 2].
Такая двойная трактовка механизма действия «живых» лечебных препаратов на макроорганизм создает предпосылки для конструирования композитных средств, включающих не только высокоадгезивный лечебный штамм, но и продукты жизнедеятельности других пробиотических штаммов, усиливающие эффект «колонизационной резистентности».
При изучении производственных штаммов лактобактерий нами было установлено, что среди лактобацилл одни штаммы обладают высокой адгезивной активностью, а другие на фоне низкой адгезии экскретируют в среду культивирования биологический компонент, взаимодействующий с конканавалином А (КонА) и активно модулирующий адгезию тесг-культур на клетках-мишенях [3; 4].
Цель настоящей работы заключалась в выяснении природы компонента, появляющегося в культуральной жидкости (КЖ), и определения его биологической свойств. Для достижения этой цели последовательно решались следующие задачи: 1) осуществить выделение и частичную очистку искомого продукта; 2) изучить его свойства; 3) определить его модулирующую активность на адгезию двух культур С.albicans и двух культур E.coli к эпителиоцитам влагалища (ЭВ) клинически здоровых женщин по способу, описанному ранее [5].
Для получения исходного сырья ЬТегтепшт 90 Т8-4 (21) клон 3 и Ь.р1атагит 8 КА-З культивировали в стеклянных емкостях по 1 литру (без перемешивания). КЖ отделяли от биомассы путем центрифугирования при 3000 об/мин. в течение 15 минут. Супернатант КЖ очищали от низкомолекулярных компонентов и концентрировали путем диафильтрации на ячейках фирмы «АМ1СОМ» с использованием мембран РМ-20 марки «Диафло».
Через двое суток культивирования было собрано по 2 литра КЖ каждого вида лактобацилл. После сгущения и удаления низкомолекулярных компонентов концентрация белка в образцах составляла 64,0 мг/мл и 50 мг/мл соответственно. Эти образцы были высушены лиофильно в аппарате «Фригеро» в стандартном для лактобацилл режиме. Выход сухого вещества с 1 мл концентрата Ь^егтепШгп штамма 90 Т8-4 (21), клон 3 составил 82 мг, Ь.р1агиашт штамма 8 ЯА-З — 138 мг; при этом содержание белка в них было на уровне 85 и 93% соответственно. Оба образца КЖ преципетировали с конканавалином А (КонА): ЬТегтепШш штамм 90 Т8-4 (21), клон 3 в дозе 32,5 мг/мл, а Ь.р1аЩагит штамм 8 ИА-3 — в дозе 250 мг/мл. Это обстоятельство позволило считать, что ЬТегшепШш штамма 90 ТБ-4 (21), клон 3 является наиболее эффективным продуцентом лектинзависимого компонента. Дальнейшие исследования проводили с образцами КЖ этого штамма.
Фракционирование такого концентрата, осуществленное путем ступенчатой диафильтрации на мембранах ХМ-300, ХМ-100 и РМ-20, установило, что фракция, активно преципитирующая КонА, находится в образце, собранном над мембраной ХМ-100 (рис. 1). Это позволило заключить, что компонент представляет собой биополимер с молекулярной массой в пределах 1 ОО-ЗООкДа.
Относительная удельная активность фракции КЖ иегтепШт штам 90 ТБ-4 (21), клон 3 в реакции преципитации с 0,1% раствором КонА
Рис. 1
На следующем этапе концентрат КЖ был исследован с помощью электрофореза в агаровом геле. Разделение образца проводили при pH — 8,2; напряжении 200 В и силе тока 10 мА. На фореграмме видно, что в концентрате КЖ Ь.ґегтепШт штамма 90 ТБ-4 (21), клон 3 присутствуют две фракции, движущиеся к катоду.
При проведении исследований в условиях движения лектинзависимой фракции через «траншею», заполненную КонА-сефарозой, компонент отсутствовал в форе-грамме. Это факт явился основанием для выделения искомого продукта методом аффинной хроматографии («бач»-метод). В ходе исследований отмечено, что хроматографически очищенный на КонА-сефарозе продукт, содержащий 150 мкг/мл белка, агрегативно не устойчив при значениях pH выше 6,0.
Таким образом, на данном этапе исследования возникло предположение о том, что искомая субстанция является кислым гликопротеидом с молекулярной массой от 100 до 300 кДа. Дополнительное исследование с использованием реакции торможения адгезии тест-культур на ЭВ позволило заключить, что его углеводная часть включает маннозу.
Изучение модулирующих свойств супернатанта и хроматографически очищенной фракции КЖ Ь^егтепшт штамм 90 ТБ-4 (21), клон 3 в тесте торможения адгезии тест-культур на ЭВ дало следующие результаты (табл. 1).
Таблица 1
Модулирующее действие фракций концентрата КЖ Ь.ГегтепШш штамм 90 Т8-4 (21), клон 3 на тест-культуры при адгезии на ЭВ
Штаммы микроорганизмов Концентрат КЖ L.fermentum 90-TS-4 (21) клон 3 (РМ-20) (CfelKa=150 мкг/мл)
фракция, способная реагировать с КонА фракция, лишенная способности реагировать с КонА
М±ш М±т
контроль опыт контроль опыт
C.albicans 04-703 Б (вагинальный изолят) 4,33±0,4 1,2±0,2* 1,26+0,2 0,64±0,12*
C.albicans (оральный изолят) 13,04+1,8 8,62±1,12* 2,74±0,5 4,76± 1,02
E.coli К-12 12,35±0,84 12,12± 1,34 12,35±0,84 20,94+1,51
E.coli 89-1449 (кишечный изолят) 33,92±2,2 19,92±1,42* 13,76±1,6 23,64±2,9
Примечание: * — достоверное снижение адгезии тест-культур на ЭВ
Приведенные данные свидетельствуют, что хроматографически очищенная фракция активно ингибирует адгезию вагинального изолята ДПГ вида С.albicans штамм 89-1449 на ЭВ и в меньшей степени влияет на адгезию орального изолята ДПГ вида C.albicans. На адгезию E.coli штамм К-12 фракция не оказывает никакого эффекта, но значительно блокирует адгезию E.coli штамм 89-1449 на ЭВ. В то же время при удалении из КЖ L.fermentum штамм 90 TS-4 (21), клон 3 лектинзависи-мого компонента усиливается адгезивная активность тест-культур E.coli к ЭВ. Адгезия вагинального изолята ДПГ вида C.albicans штамм 04.703 в этой модельной системе уменьшается.
Представленные результаты позволяют заключить, что КЖ, полученная при культивировании L.fermentum штамма 90 TS-4 (21), клон 3 представляет много-
компонентную систему, включающую биополимеры, модулирующие адгезию микробов на ЭВ. Очевидно, что она в определенной степени сбалансирована, поскольку удаление из нее компонента, тормозящего адгезию, усиливает фиксацию тест-культур на клетках-мишенях.
ЛИТЕРАТУРА
1. Rambaud J.C., Bouhnik У., Marteau P. et al. II Proc. Nutr. Soc. — 1993. — Vol. 52. — № 2. — P. 357-366.
2. Bengmark S. II Gut. —1998. — Vol. 42. — № 1. — P. 2-7.
3. Анохина И.В., Кравцов Э.Г., Яшина H.B. и др. Характеристика поверхностных адгезинов лактобактерий, используемых при изготовлении препаратов пробиотиков // Бюл. экспер. биол. — 2006. — Т. 141. — №6. — С. 664-667.
4. Анохина КВ., Кравцов Э.Г., Яшина Н.В. и др. Поверхностные адгезины лактобацилл, рыхло связанные с клеточной стенкой и элиминирующиеся во внешнюю среду при культивировании на жидких питательных средах // Бюл. экспер. биол. — 2006. —Т. 142, —№ 11, —С. 557-561.
5. Анохина И.В., Кравцов Э.Г., Яшина Н.В. и др. Изучение компонентов культуральной жидкости L.fermentum 90 TS-4(21) клон 3, проявляющие бактерицидную и адгезивную активность // Бюл. экспер. биол. — 2007. — Т. 143. — №3. — С. 330-334.
LECTIN — DEPENDED ADHESIN — THE PERSPECTIVE COMPONENT OF COMPLEX PROBIOTIC
I.V. Anokhina, E.G. Kravtsov, N.V. Iashina,
A.V. Ermolaev, V.L. Chesnocova, M.V. Dalin
The Department of Microbiology Peoples’ Friendship University of Russia Miklukho-Maklaya St., 8, 117198 Moscow, Russia
There are some of the strains that have a very high adhesion activity, but the others express a lectin-depended component into the cultural media among industrial Lactobacilus strains. The lactin-depended component that has been produced during concentrated cultural filtrate traction of L.fermentum strain 90 TS-4(21) clone 3 has been determined as an acid glycoprotein with molecular weight from 100 to 300 kDa. The component modulates the adhesion of test — cultures of the target cells.
