CC BY
30
УДК 611.831.91:611.018
Е. Г. Аккуратное, А. Д. Ноздрачев
Вестник СПбГУ. Сер. 3, 2003, вып. 1 (№3)
ЛЕКТИНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АФФЕРЕНТНЫХ НЕЙРОЦИТОВ КАУДАЛЬНОГО УЗЛА БЛУЖДАЮЩЕГО НЕРВА БЕЛОЙ КРЫСЫ НА ЭТАПАХ ПОСТНАТАЛЬНОГО ОНТОГЕНЕЗА
В последнее десятилетие методика лектиновой гистохимии использовалась для выявления и маркирования клеточных популяций в норме и при патологии, а такжё в диагностических целях. Данным вопросам посвящено большое число работ. Весьма актуальны и исследования процессов дифференциации, становления различных тканевых элементов на этапах пренатального онтогенеза [6, 21]. В этом плане наиболее изученными оказались явления гистоморфогенеза элементов нервной ткани [4, 8, 9,16, 25, 26]. Изменениям лектинрецепторных взаимодействий в постнатальном онтогенезе нервных элементов посвящены лишь немногие работы [3, 5, 10, 11, 12, 17, 19, 20, 23, 27], и до сих пор нет целостных представлений о метаморфозе этих взаимодействий на протяжении жизни организмов. Не исследованы факторы морфофункциональной специализации чувствительных нервных клеток различных ганглиев по признакам родства к разным лектинам [7, 13, 15, 22, 24].
Цель данного исследования — изучить динамику лектиногистохимических Характеристик нейроцитов каудального узла блуждающего нерва белой крысы (КУБН) на этапах постнатального онтогенеза.
Материал и методы исследования
Работа выполнена на 48 белых крысах. Объектом исследования послужили" КУБН новорожденных белых крыс, крыс репродуктивного возраста и старых животных.
Перед эвтаназией животных наркотизировали внутрибрюшинным введением тиопентал-натрия (40 мг/кг) и перфузировали через левый желудочек 100 . мл изотонического раствора ЫаС1. Фиксацию материала проводили в 4%-ном растворе нейтрального формалина в 2 этапа: 1) введением т в^и через левый желудочек 100 мл фиксирующего раствора; 2) дофиксацией материала в том же фиксирующем растворе в течение 3 суток. Далее проводилась заливка объектов в парафин по общепринятой методике. Депарафинированные срезы толщиной 3-5 мкм обрабатывали коньюгатами лектинов с пероксидазой хрена —ПХ (в соответствии с рекомендациями А. Д. Луцик, Б. С. Детюк [1]. Проявление активности ПХ осуществляли в системе 0,05% ДАБ —0,015% Н2О2 по методу Р. К.Грэйхэм, М. Дж. Карновского [14] либо по методу Н. М. Месулама [18] в забуференном изотоническом растворе (ЗИР) с рН = 7,4. Время проявления ПХ для различных лектинов варьировало от 20 до 45 мин. Ход реакции контролировался визуально с помощью микроскопа по интенсивности окраски тканевых структур. Реакцию останавливали погружением срезов в ЗИР. Далее препараты заключали в канадский бальзам по общепринятой методике. Параллельно проводили контроль специфичности гистохимических реакций. Места связывания лектинов визуализировались путем использования обычных методов световой микроскопии.
Результаты исследования и их обсуждение
Установлено, что для новорожденных животных характерно связывание лектинов со всеми структурными компонентами КУБН. Отмечена интенсивная, практически однородная окраска клеток и соединительной ткани. Для препаратов, обработанных лек-тином бузины черной, омелы белой, завязей пшеницы и сои, характерно однородное
© Е. Г. Аккуратов, А. Д. Ноздрачев, 2003
окрашивание фона, на котором границы нейроцитов оказываются размытыми и трудно различимыми. Особенно нелегко определяются тела клеток на срезах, обработанных лектином бузины черной и сои. Ядра по степени окраски не определяются на фоне перикарионов. К этому типу связывания с тканевыми рецепторами можно отнести и связывание лектина клещевины.
Более селективным в отношении тканевых и клеточных структур КУБН на этом этапе онтогенеза оказались лектины виноградной улитки и бобовника. Несмотря на различную углеводную специфичность, эти лектины обнаруживают сходную картину связывания с рецепторами структур КУБН. Сродство лектинов виноградной улитки и бобовника с соединительной тканью заметно ниже, чем с клеточными компонентами: клеточные мембраны более четко определяются по откладывающимся на них продуктам гистохимической реакции, у некоторых нейроцитов на срезе обнаруживаются ядра в виде зоны с размытыми светлыми или темными границами в центре клетки. Ядрышки не определяются, заметна зернистость цитоплазмы. Для лектина завязей пшеницы характерно окрашивание типа слабодифференцированного коричневого фона. Однако тела нервных клеток определяются по четким контурам — клеточным мембранам, структурам, в которых локализовано наибольшее количество рецепторов лектина.
На этапе половозрелости характер связывания лектинов компонентами КУБН значительно меняется: границы перикарионов становятся хорошо различимыми, отмечается дифференциальное распределение лектин-положительного материала между ком-партментами клеток, на срезах прослеживаются миелиновые и безмиелиновые волокна. Однако общая тенденция изменения исследованных лектинов — индивидуальная.
Так же как и в ганглиях новорожденных животных, галактозо- и галактоз аминспе-цифичные лектины омелы белой, сои и клещевины обнаруживают сходный характер связывания. На фоне слабо прокрашенной соединительно-тканной стромы узла с хорошо заметными периневральными клетками лежат темные перикарионы с четкими границами и зернистым распределением лектин-положительного материала в нейро-плазме. Ядра определяются плохо или имеют размытые границы и выглядят как более светлые по отношению к перикариону нуклеальные зоны (рисунок, А, Б).
Повышенной тропностью к миелиновым волокнам обладают лектины сои и горошка, к глиальным элементам — клещевины и омелы белой. На срезах, обработанных лектином из омелы белой, в соединительно-тканной капсуле отчетливо прослеживается ба-зальная мембрана. Клетки глии на срезах, обработанных этими лектинами, выглядят более интенсивно окрашенными, чем нейроциты.
Перикарионы проявляют повышенную тропность к лектину из виноградной улитки и выделяются благодаря темной окраске на фоне соединительной ткани (рисунок, Б). Границы клеток четкие, распределение продукта гистохимической реакции в цитоплазме имеет зернистый характер. Ядра и ядрышки хорошо определяются, кариоплазма светлая, следовательно, связывания меченного НРА в ней не происходит, рецепторы лектина не выявляются. В соединительной ткани определяются периневральные клетки; у миелиновых волокон, попавших в срез, обнаруживаются рецепторы лектинов в миелиновой оболочке и осевых цилиндрах. Определяются глиальные элементы, с более высокой тропностью к лектину из виноградной улитки, чем перикарионы и соединительная ткань.
Сходная топография у рецепторов к лектину бобовника и клещевины с той лишь, разницей, что на препаратах, обработанных лектином бобовника, лучше видны различия в характере связывания с гликоконъюгатами разных клеточных структур: ядра выглядят еще светлее и имеют четкие границы.
/
62 ■
Особую картину представляет связывание лектина бузины черной. В отличие от всех остальных лектинов, использованных в нашем исследовании, пероксидазная метка лектина бузины черной выявляется в зоне нуклеуса. Ядра нейроцитов имеют интенсивную темно-коричневую окраску на фоне почти однородной, слабо зернистой и менее интенсивно прокрашенной цитоплазмы. Весь срез при этом окрашен однородно,
мембраны клеток в отличие от границ ядер прокрашиваются нечетко. На препаратах, обработанных другими лектинами, можно наблюдать темные ядра, однако это. не закономерность (рядом могут быть клетки с четко ареактивной нуклеальной зоной и клетки с темными гранулами в области ядра). Кроме того, в этих случаях достичь эффекта инвертирования окраски ядра относительно окраски нейроплазмы можно' с помощью работы микровинта. На срезах, обработанных лектином бузины, четко и закономерно обйаруживаются ядра со сплошной интенсивной окраской, в некоторых из них определяются темные ядрышки.
Свои особенности имеет динамика перераспределения рецепторов лектина'из завязей пшеницы в КУБН половозрелых животных по отношению к новорожденным. Материал гистохимической реакции откладывается в виде рассеянных гранул в ней-роплазме: прослеживается гранулярность нуклеальной зоны, границы клеток и ядер определяются с трудом. Срезы отличаются бледностью и обнаруживают недифференцированную окраску, как это отмечалось в КУБН новорожденных животных.
Таким образом, на этапе половозрелости наблюдается более высокая степень избирательности связывания лектинов различной углеводной специфичности с отдельными тканевыми элементами. Это наиболее четко выражено для лектинов из виноградной улитки, бобовника и горошка. При этом лектины виноградной улитки и бобовника проявляют сравнительно высокую тропность к клеточным структурам КУБН, а для лек-тина горошка характерна оригинальная топография лектин-связывающих гликоконъ-югатов нейроцитов. Тропность лектина завязей 1 :юницы — пониженная, а клещевины и сои — высокая при низкой избирательности связывания с клеточными структурами.
Для лектинов из омелы белой и сои характерна более высокая избирательность связывания со структурами КУБН старых животных, чем на этапе половозрелости. Хорошо определяется мембрана клеток, лектин-положительной является перинуклеальная зона, однако в светлой нуклеальной зоне после обработки лектином сои в некоторых случаях обнаруживаются темные гранулы продукта реакции.
Характер связывания структур КУБН с лектином из семян клещевины практически не меняется в сравнении с этапом половозрелости. Несколько более четко дифференцируются по отложению продукта реакции клеточные мембраны и границы нуклеальной зоны, цитоплазма имеет хорошо выраженный зернистый характер, связывание лектина идет в основном в цримембранной области перикариона. Хорошо определяются элементы глии. ,
Рецепторы лектинов бобовника и виноградной улитки, до сих пор обнаруживавшие сходную топографию, у старых животных распределяются по-разному. Рецепторы к лектину бобовника так же, как и в ганглиях половозрелых животных, выявляются в основном в перинуклеальной зоне нейроцитов. Отмечается хорошо выраженная зернистость, границы клеток четкие. В крупных клетках определяются ядра и ядрышки. На препаратах, обработанных лектином виноградной улитки, ядра нейроцитов не определяются или определяются с трудом, хотя перикарионы довольно хорошо дифференцируются на фоне умеренно реактивной соединительнотканной стромы узла. Гликоконъ-югаты миелиновых волокон и глиальных клеток сохраняют способность связываться с обоими лектинами.
Для лектина сои остаются характерными высокая тропность к компонентам КУБН и сплошная интенсивная окраска препаратов. Границы клеток и ядер практически не определяются, в цитоплазме положительный материал гистохимической реакции распределен равномерно, реактивность ядер утрачивается — интенсивной окраски нуклеальной зоны не обнаруживается. Миелиновые волокна на срезах не выявляются.
Способность структурных компонентов КУБН связываться с лектином завязей пшеницы в процессе старения падает, о чем можно судить по бледной окраске препаратов. При этом заметно дифференциальное распределение рецепторов лектина между клеточными структурами: границы клеток и ядер довольно четкие —здесь, происходит накопление продукт«, гистохимической реакции; в ядрах определяются ядрышки, и с помощью микровинта могут быть выявлены темные гранулы. В целом перикарио-ны обнаруживают слабую реактивность, нуклеальная зона ареактивна. Определяются миелиновые волокна с преимущественной локализацией рецепторов в миелицовой оболочке.
Таким образом, наибольшую тропность структуры КУБН старых животных проявляют к лектину сои, наименьшую — к лектину из завязей пшеницы, бобовника и омелы белой, характерны преимущественное накопление продукта гистохимической реакции в перинуклеальной зоне и довольно хорошая избирательность по отношению к клеточным и тканевым структурам. Для лектина из виноградной улитки понижается степень избирательности, характер распределения рецепторов к лектину из семян клещевины практически не меняется.
Высокая тропность всех лектинов к определенным структурам КУБН, проявляющаяся у новорожденных животных демонстрирует высокое содержание гликоконъюга-тов всех типов, является признаком структурной й функциональной незрелости элементов узла на этом этапе онтогенеза. Отсутствие исключительно высокого сродства с лектинами сои, клещевины и с другими галактозо- и галактозаминоспецифичными лектинами, считающимися некоторыми авторами [3, 10, 12] гистохимическими маркерами незрелости, позволяет изучить часть популяции чувствительных нервных клеток у половозрелых животных, еще не достигших полной морфофункциональной дифференциации.
Несколько повышенную тропность к сиалоспецифичному лектину завязей пшеницы можно рассматривать как признак потенциальной способности клеток к миграции — известно, что в процессе постнатального развития чувствительных ганглиев нейроциты постепенно перемещаются на периферию узла, будучи вытесняемыми проводниковыми элементами [22]. I
Повышенная реактивность популяции клеток средних размеров, характерная в отношении всех лектинов на этапе новорожденности, очевидно, характеризует популяцию средних клеток как наиболее способную к дальнейшей морфологической и функциональной специализации. Отчетливое повышение избирательности связывания лектинов со структурами узла и компартментами клеток в КУБН взрослых крыс может указывать на высокую степень дифференцировки структур ганглия и приобретение ими индивидуальных биохимических особенностей [7, 13, 20]. В связи с этим топография поверхностных гликоконъюгатов для каждой структуры приобретает свои характерные особенности, сохраняющиеся или частично утрачивающиеся затем" в процессе старения. При этом для Ь-фукозоспецифичного лектина бобовника и К-ацетилгалактозаминоспецифичного лектина виноградной улитки, рецепторы которых, как было установлено, имеют сходную топографию еще на этапе новорожденности и сохраняют ее в ганглиях половозрелых крыс, наиболее характерно связывание с мембранными структурами — об этом говорят четко прокрашенные мембраны клеток и гранулярный характер распределения продукта гистохимической реакции в нейроплаз-ме (связывание идет преимущественно не с матриксом цитоплазмы, а с мембранными органоидами нейроцита). Описанная различными авторами [24, 27] способность лектина сои маркировать миелиновые волокна, а лектинов клещевины и омелы белой —
глиальныё элементы, подтвердилась и в нашем исследовании. Кроме того, обнаружена тропность к миелиновым волокнам малоизученного лектина бузины черной.
Особые свойства лектина бузины черной в отношении связывания со структурами нуклеальной'зоны нейроцитов являются исключением из общепринятого мнения об отсутствии рецепторов лектинов в ядре. Следует отметить, во-первых, что эта особенность проявляется лишь на этапе половозрелости и утрачивается в ходе старения. Во-вторых, как было показано, окрашивание ядер клеток другими лектинами (бобвни-ка и из завязей пшеницы) нельзя считать закономерным и достоверным. Сиалирования поверхности нейроцитов в процессе постнатального развития не обнаружено, наоборот, наблюдаются повышение числа D-галактозоконъюгатов и соответственный рост соотношения D-галактоза/сиаловая кислота, что характеризует повышение адгезивных и понижение миграционных способностей нейроцитов ганглия на этапе половозрелости. При этом пониженную тропность лектина сои в сравнении с лектином клещевины можно объяснить частичным экранированием рецепторов лектина сои концевыми остатками сиаловой кислоты.
В результате нашего исследования показано уменьшение числа сиало- и D-галактозоконъюгатов в процессе старения клеток КУБН. Возможно, это связано с инволютивными процессами, характерными для стареющей нервной ткани, в том числе с процессами демиелинизации, и характеризует понижение адгезивных и миграционных способностей клеток.
Противоречием в данном случае является повышение тропности галактозоспеци-фичного лектина бузины черной к нейроцитам ганглия, на стадии старения. Можно предположить, что это может быть признаком компенсаторных процессов, имеющих место на фоне инволютивных. Однако делать какие-то определенные выводы затруднительно, поскольку данный лектин, к сожалению, в настоящее время является малоизученным [2] и малоприменимым.
Summary
Akkuratov E.G., Nozdrachev A.D. Lectinohistochemical characteristics of the ganglion nodose neurocytes during albino rat in postnatal ontogenesis.
Lectinohistochemical characteristics of ganglion nodose' structures have been investigated in ganglia of newborn, adult and aged albino rats. The 5 different carbohydrate specificity lectins were used. The changes of glicoconjugates composition and topography during postnatal ontogenesis stages were shown. A large amount of every lectin receptors was displayed in ganglia of newborn rats. The utmost variety of glycoconjugates composition and distribution was typically for ganglion structures of adult animals. Moreover, the increase in sensory neurons reactivity for Ricinus communis agglutinin was noticed. During an ageing process the increase in reactivity to Sambu-cus nigra agglutinin and the fall in bind ability to Ricinus communis agglutinin and Wheat germ agglutinin were displayed. Different size cell populations have changed a binding ability to lectins during maturation and aging processes.' Литература
1. Луцик А.Д., Детюк E.C. Применение лектинов в светооптической гистохимии (методические аспекты) // Архив АГЭ. 1987. Т. 92, №6. С. 74-89. 2. Яцковский А.Н., Луцик А.Д. Метод селективного гистохимического выявления сиалогликанов с использованием лектина бузины черной (Sambucus Ыдга L.) // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1991. Т. 111, №1. С. 71-74. 3. Akkina S.K., Patterson C.L., Wright D.E. GDNF rescues nonpeptidergic unmyelinated primary afferents in streptozotocin-treated diabetic mice // Exp. Neurol. 2001. Vol. 167, N 1. P. 173-182. 4. Barondes S.H. Lectins: their multiple endogenous cellular function // Annu. Rev. Biochem. 1981. Vol. 50, N 3. P. 207-231. 5. Bennett D.L., Averill S., Clary D.O.. Priestley J.V.,
McMahon S.B. Postnatal changes in-the expression of the high-affinity NGF receptor in primary sensory neurons // Eur. J. Neurosci. 1996. Vol. 8. N 10. P. 2204-2208. 6. Bennett D.L., Michael G.J., Ramachandran N.. Munson J.B., Averill S., Yan Q., McMahon S.B., Priestley J.V. // J. Neurosci. 1998. Vol. 18, N 8. P. 3059-3072. 7. Bergman E., Carlsson K., Liljeborg A., Manders E., Hokfelt T., Ulfhake B. Neuropeptides, nitric oxide synthase and GAP-3 in B4-binding and RT97 immunore-active primary sensory neurons: normal distribution pattern and changes after peripheral nerve transection and aging // Brain Res. 1999.. Vol. 832, N 1-2. P. 63-83. 8. Beurton C., Van Driess-che E., Franz H., Israel R., Rudiger H. Advances in lectin research. Berlin, 1988. 9. Bruckner G., Muller L., Wollweber L. Lectin binding sites and anionic components related to differentiation in the prenatal rat cerebral cortex // J. Hirnforsh. 1985. Vol. 26, N 6. P. 615-634. 10. Carlsten J.A., Kothary R., Wright D.E. Glial cell line-derived neurotrophic factor-responsive and neurotrophin-3-responsive neurons require the cytoskeletal linker protein dystonin.for postnatal survival // J. Comp. Neurol. 2001, Vol. 432, N 2. P. 155-168. 11. De George J. J., Carbonetto S. Weat germ agglutinin inhibits nerve fiber initiation in cultures of dorsal root ganglia neurons // Dev. Brain Res. 1986. Vol. 393, N 2. P. 169-175. 12. Fischer J., Luth H.J. Distribution, ontogenetis develoment and ultrastructural localization of the terminal N-acetylgalactozamine containing glycoconjugate in rat bran // Bull. Assoc. 1990. Vol. 74, N 224. P. 14. 13. Gerke M.B., Plenderleith M.B. Binding sites for the plant lectin Bandeiraea simplicifolia I-isolectin B(4) are expressed by nociceptive primary sensory neurons // Brain Res. 2001. Vol. 17, N 1. P. 101-104. 14. Graham R.C., Karnovsky M.J. The early stages of adsorption of injected horsradish peroxidase in the proximal tubules of mous kidney: ultrastructural cytochemistry by a new technique //J. Histochem. Cytochem. 1966. Vol. 14, N 4. P. 291-301. 15. Haberberger R.V., Bodenbenner M. Immunohistochemical localization of muscarinic receptors (M2) in the rat skin // Cell Tissue Res. 2000. Vol. 300, N 3. P. 389-396. 16. Ito J., Kato T., Tanaka R. Oligosacharide alterations of rat glioblast membrane — bound glycoproteins during differenciation induced by glia maturation factor /'/ Neurochem. Int. 1996. Vol. 8, N 1. P. 31-40. 17.' Kano M., Kawamaki T., Hikawa N., Hori H., Takenaka T., Goton H. Bradykinin-responsive cells of dorsal root' ganglia in culture: cell size, firing, cytosolic calcium, and substance P // Cell Mol. Neurobiol. 1994. Vol. 14, N 1. P. 49-57. 18. Mesulam N.-M. The blue reaction product in horseradish peroxidase neurochemistry; incubation, parameters and visibikity //J. Neurochem. and Cytochem. 1976. Vol. 130, N 2. P. 109-148. 19. Momoi T., Momoi M.Y., Kurata T. Peanut agglutinin receptor is a marker of nyelin in rat brain. Developmental changes in its distribution // J. Neurochem. 1986..Vol. 46, ¿\ 1. P. 229-234. 20. Orozco O.E., Walus L., Sah D.W., Pepin-sky R.B., Sanicola M. GFRalpha3 is expressed predominantly in nociceptive sensory neurons // Eur. J. Neurosci. 2001. Vol. 13, N 11. P. 2177-2182. 21. Pan M., Naftel J.P., Wheeler E.F. Effects of deprivation of neonatal nerve growth factor on the expression of neurotrophin receptors and brain-derived neurotrophic factor by dental pulp afferents of the adult rat // Arch. Oral Biol. 2000. Vol. 45, N 5. P. 387-399. 22. Petruska J.C., Streit W.J., Johnson R.D. Localization of unmyelinated axons in rat skin and mucocutaneous tissue utilizing the isolectin GS-I-B4 // Somatosens. Mot. Res. 1997. Vol. 14, N 1. P. 17-26. 23. Petruska J.C., Cooper B.Y., Gu J.G., Rau K.K., Johnson R.D. Distribution of P2X1, P2X2, and P2X3 receptor subunits in rat primary afferents: relation to population markers and specific cell types // J. Chem. Neuroanat. 2000. Vol. 20, N 2. P. 141162. 24. Stucky C.L., Lewin G.R..Isolectin B(4)-positive and-negative nociceptors are functionally distinct // J. Neurosci. 1999. Vol. 19, N 15. P. 6497-6505. 25. Tanaka Y., Yoshida Y., Hirano M. CGRP-immunoreactive cells supplying laryangeal sensory nerve fiberes in the cat's nodose ganglion // J. Laryngol. Otol. 1993. Vol. 107, N 10. P. 916-919. 26. Tezuca M., Ito M., Tazava T., Sato Y. Differential analyzis of the human anagen apparatus using lectin binding histochemistry 11 Arch. Dermatol. Res. 1991. Vol! 283, N 3. P. 180-185. 27. Wang H.F., Shortland P., Park M.J., Grant G. Retrograde and transganglionic transport of horseradish peroxidase-conjugated cholera toxin B subunit, wheatgerm agglutinin and isolectin B4 from Griffonia simplicifolia I in primary afferent neurons innervating the rat urinary bladder // Neuroscience. 1998. Vol. 87, N 1. P. 275-288.
Статья поступила в редакцию 7 октября 2002 г.
