CC BY
9
УДК 616.61-079: [616-018:547.96:582.28]-07
ЛЕКТИН ГРИБА ГРУЗЛИКА ДИМЧАСТОГО (CLITOCYBE NEBULARIS FR.): НОВИЙ Г1СТОХ1М1ЧНИЙ РЕАГЕНТ ДЛЯ ДОСЛ1ДЖЕННЯ МОРФОГЕНЕЗУ ТА
ПСТОПАТОЛОГП НИРКИ
На прикладi постнатального морфогенезу нирки щура та з використанням експериментально! моделi дiабетичноí нефропати дослiджено можливiсть використання лектину гриба грузлика димчастого (CNFA) в якост гiстохiмiчного реагента. Показано, що означений лектин може бути використаний в якост селективного маркера ниркових тшець i щ^очково! облямiвки проксимальних трубочок нефрошв щура, для морфометричних дослщжень, а також як достатньо шформативний гiстохiмiчний реагент для дослiдження яюсно! перебудови глiкокон'югатiв нирки як в умовах фiзiологiчноl норми, так i при патологи. П^вняння характеру зв'язування лектину CNFA з близькими до нього за вуглеводною специфiчнiстю лектинами арахюу (PNA), со! (SBA) та виноградного слимака (HPA) виявило певш вiдмiнностi у зв'язуваннi зi структурними компонентами нирки, що свщчить про ушкальшсть лектину CNFA як гiстохiмiчного реагента.
Kjiiohobí слова: нирка щура, постнатальний морфогенез, д1абетична нефропа'пя, лектин CNFA
Робота е фрагментом НДР Лектино- та iмуногiстохiмiчний aHan.Í3 вуглеводних детермтант нормальных i патологiчно змiнених клтин i тканин» (№ державноíреестрацн 0113U000207).
Вивчення можливостей використання в пстох1мп лектишв рщко! та вузько! вуглеводно! специф1чносп продовжуе залишатися актуальним напрямом морфолопчно! науки [5, 6, 9]. До вищеозначено! категорп можна вщнести лектин з плодових тш гриба грузлика димчастого (Clitocybe nebularis Fr.), який виявляе виб1ркову специф1чшсть до ткокон'югапв з вуглеводними детермшантами Galß1-4Glc та DGalNAc [1, 7]. А.М. Ященко i ствавт.[4] було продемонстровано виб1ркове зв'язування лектину гриба Clitocybe nebularis (CNFA) з береговими макрофагами л1мфатичних вузл1в щура. Нещодавно показано, що CNFA може представляти певний штерес для ранньо! пстох1м1чно! д1агностики пухлинного переродження товсто! кишки людини [2], однак публшацш з використанням означеного лектину для маркування пстолопчних структур нирки у доступнш л1тератур1 нами не виявлено.
Метою роботи було вивчення можливостей використання лектину CNFA для характеристики процешв морфогенезу та пстопатологп нирки.
Матерiал та методи дослщження. У робот були використан пстолопчш проби нирки щур1в лшп Вютар, як включали с1м груп тварин: на 20-у, 60-у та 120-у добу постнатального онтогенезу, а також на 14-у, 30-у, 40-у та 80-у добу розвитку стрептозотоцин^ндукованого цукрового д1абету. Детальшше умови постановки експерименту наведет у нашш попереднш публшацп [8]. Нирки забирали тсля усипання тварин тд д1ею еф1рного наркозу, розр1зали в серединнш площиш, фшсували у 4% нейтральному форматш з подальшою заливкою у парафш вщповщно до стандартно! методики. Вс маншуляцп проводилися вщповщно до вимог Свропейсько! конвенцп щодо захисту хребетних тварин, котр1 використовуються для експерименпв чи шших наукових цшей (Страсбург, 1986), а також загальних етичних принцитв стосовно експериментальних тварин, затверджених на Першому украшському конгрес з бюетики (Кив, 2001).
Для пстох1м1чного дослщження використано кон'югат лектину CNFA з пероксидазою хрону, люб'язно наданий д.фарм.наук, проф.В.О.Антонюком. Зр1зи шкубували в розчиш лектину в ЗФР рН 7,4 (концентращя 50 мкг/мл, час шкубацп - 1 год.) з наступною в1зуал1защею мюць його зв'язування д1амшобензидину тетрапдрохлоридом (Sigma) як описано рашше [3]. М1кроскошю та фотографування препарапв здшснювали за допомогою мшроскопа Zeiss Ng (Carl Zeiss, Jena), обладнаного цифровою фотокамерою Canon IXUS 700 (Canon, Tokyo). 1нтенсившсть зв'язування оцшювалась двома незалежними спостер1гачами з використанням натвкшьюсно! шкали, де ++ значна реактившсть, + позитивна реакщя, - вщсутшсть зв'язування.
Результати дослiдження та Тх обговорення. Реактившсть структурних компоненпв нирки з лектином CNFA представлена у Табл.1, а також на рис.1, 2. При цьому зауважимо, що зпдно наших попередшх дослщжень [8], нирка щура набувае дефш1тивних ознак на 60-у
постнатальну добу, тому пстоироби ще! групи тварин були використаш в якост контролю для порiвняння з тканинами щурiв з модельованою дiабетичною нефропатiею. М^оскошя препаратiв виявила iнтенсивне маркування ниркових тiлець (головним чином елементiв фшьтрацшного бар'еру) на всiх етапах постнатального онтогенезу та розвитку дiабету.
Таблиця 1
Динамiка зв'язування лектину СNFA зi структурними компонентами нирки щура у процеС
морфогенезу органа та на тлi розвитку дiабетичноT неф ропати
Структури нирки 20 доба 60 доба 120 доба 14 доба 30 доба 40 доба 80 доба ц/д
п/н п/н п/н ц/д ц/д ц/д
Нирков1 тшьця ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
Проксимальш трубочки + л/п ++ щ/о ++ щ/о ++ щ/о ++ щ/о + ц/г ++ ц/г
Дистальш трубочки - + л/п + л/п + ц/г + ц/г + ц/г ++ ц/г
З61рн1 нирков1 протоки - ++ л/п ++ л/п + ц/г + ц/г + ц/г ++ ц/г
Примаки: п/н постнатально; ц/д цукровий д1абет; л/п люменальна поверхня; щ/о щ1точкова облям1вка; ц/г цитоплазматичш глкопол!мери. 1нтенсившсть зв'язування лектину: ++ значна реактившсть, + позитивна реакщя, - реактившсть вщсутня
Динамша реактивностi люменально! поверхнi проксимальних i дистальних трубочок нефронiв упродовж постнатального онтогенезу i у процесi розвитку дiабетично! нефроиатн загалом носила взаемопротилежний характер. Так, реактивнiсть проксимальних трубочок упродовж постнатального онтогенезу шдвищувалась, концентруючись у складi щ^очково! облям1вки (рис.1).
{. ■
V
ш
А В С D
Рис.1. Характер перерозпод1лу рецептор1в лектину CNFA упродовж постнатального морфогенезу нирки щура. А. 20-а доба: реактившсть ниркових тшець та люменально! поверхш проксимальних трубочок, х400; В,С. 60-а доба: ¡нтенсивне маркування ниркових тшець, щгточково! облям1вки проксимальних трубочок, люменально! поверхш дистальних трубочок та зб1рних ниркових проток, х200; D. 120-та доба: посилене експонування рецептор1в лектину у склад! ниркових тшець, щгточково! облям1вки та у цитоплазм! ештелюципв ниркових трубочок, х200.
По мiрi прогресi! нефропатi! виявлена тенденцiя до редукцi! зв'язування лектину з окремими
сегментами щiточково! облямiвки; при цьому ареактивнi дiлянки чергувалися з дiлянками iнтенсивною реактивнiстю, що поеднувалося з пiдвищеним експонуванням рецептс^в лектину склад1 цитоплазматичних ткокон'югапв ештелда ниркових трубочок (рис.2).
I I
ШОД|_ • /
A
ЯГ1
В
C
D
Рис.2. Пстотопограф!я рецептор!в лектину CNFA у структурах нирки щура на тш стрептозотоцин-шдукованого цукрового д!абету (ц/д). A. 14-а доба ц/д: значна реактившсть ниркового тшьця, гетерогенн!сть зв'язування лектину з! щ!точковою облям!вкою проксимальних трубочок (чергування лектин-позитивних та ареактивних д!лянок), х200; В. 30-а доба ц/д: шдвищене експонування рецептор!в лектину у склад! ниркових тшець, гетерогенна реактившсть щгточково! облям!вки, х400. С. 40-а доба ц/д: накопичення рецептор!в лектину у склад! цитоплазматичних гшкокон'юга-пв ештелш проксимальних трубочок та на люменальнш поверхн! зб!рних проток, х200. D. 80-а доба ц/д: посилення реактивност ниркових т!лець, накопичення рецептор!в лектину CNFA у цитоплазм! кл!тин ниркових трубочок у поеднанш з цшковитою редукц!ею реактивност! щ!точково! облям!вки, х200.
На 60-у та 120-у постанальну добу рецептори лектину СКБЛ були виявлеш на люменальнiй поверхнi дистальних трубочок i збiрних ниркових проток. 1нтенсившсть зв'язування лектину з цими структурами нирки частково редукувалася у ходi прогресн дiабетичного синдрому за рахунок зростання реактивностi цитоплазматичних глiкополiмерiв. Загалом дiабет-iндукована перебудова глiкокон'югатiв нирки супроводжувалась накопиченням рецепторiв лектину СКБЛ
(термшальних залишюв Оаф1-4О1с та БОаВДАс) у склад цитоплазми епiтелiю проксимальних i дистальних трубочок, збiрних ниркових проток у поеднанш зi зменшенням реактивностi !х люменально! поверхнi.
Ми розцiнюемо означену тенденцiю як вияв порушень процешв кiнцевого глiкозилювання у комплексi Гольджi i затримку включення глiкополiмерiв до ашкально! плазмалеми, що, правдоподiбно, негативно впливае на процеси реабсорбцп у нирщ. Порiвняння реактивностi лектину СКБА з близькими до нього за вуглеводною специфiчнiстю лектинами арахiсу (РКА), со! (8БА) та виноградного слимака (НРА) виявило певнi вiдмiнностi у зв'язуванш зi структурними компонентами нирки [9], що свiдчить про своерщшсть цього гiстохiмiчного реагента.
Лектин СКБА може бути рекомендований в якост селективного гiстохiмiчного маркера ниркових тшець та щггочково! облямiвки проксимальних трубочок нефрошв щура, для морфометричних дослщжень, а також в якостi достатньо шформативного реагента для дослiдження яюсно! перебудови глiкокон'югатiв нирки як в умовах фiзюлоriчноl норми, так i при патологи. Нирка щура виявилась адекватним тест-об'ектом для апробацп нових лектишв як гiстохiмiчних реагентiв.
Перспективи подальших дослiджень. Порiвняти г^тотопографт рецеnторiв лектину СМЕЛ в нирках людини i щура, а також характер 1хнього перерозподшу при шших формах експериментальноI та клШчно! патологи.
1. Antonyuk V.O. Lektini ta yih sirovinni dzherela / V.O. Antonyuk // Lviv: Kvart, - 2005.- S. 328-329.
2. Antonyuk R.V. lektinogistohimichne doslidzhennya tovstoyi kishki lyudini v normi ta pri neplastichnih protsesah z vikoristannyam lektiniv, spetsifichnih do T-antigenu ta N-atsetillaktozaminu / R.V. Antonyuk, O.D. Lutsik // Svit meditsini ta biologiyi.-2015.-No. 2(49).-S.73-78.
3. Lutsik A.D. Lektinyi v gistohimii / A.D. Lutsik, E.S. Detyuk, M.D. Lutsik // Lviv: Vischa shkola, - 1979.-S.7-37.
4. Yaschenko A. M. Tsitotopograflya retseptorlv lektiniv u strukturnih komponentah organlv Imunogenezu / A.M. Yaschenko, V.O. Antonyuk, O.V. Nakonechna [ta In.] // - Lvlvskiy medichniy chasopis.-2005.-T.9, No. 3.-S. 96-100.
5. Dan X. Development and applications of lectins as biological tools in biomedical research / X. Dan, W. Liu, T.B. Ng // Med.Res.Rev.-2015. P. 213-263.
6. Gabius H.J. The sugar code. Fundamentals of glycosciences / H.J.Gabius // Weinheim: Wiley, - 2009.-P. 317-328.
7. Horejsi V. Studies on lectins. XXXVI. Properties of some lectins prepared by affinity chromatography on O-glycosyl polyacrylamide gels / V. Horejsi, J. Kocourek // Biochim.Biophys.Acta.-1978.- Vol.538, № 2.-P.299-315.
8. Lutsyk A. Diabetic alteration versus postnatal maturation of rat kidney glycoconjugates - comparative detection by lectin probes/ A. Lutsyk, N. Ambarova, V. Antonyuk // Folia Histochem.Cytobiol.-2013.- Vol. № 1.-P.92-102.
9. Roth J. Lectins for histochemical demonstration of glycans/ J.Roth // Histochem.Cell Biol.-2011.-Vol.136.-P.117-130.
ЛЕКТИН ГРИБА ГОВОРУШКИ ДЫМЧАСТОЙ (СLITOCYBE NEBULARIS FR.): НОВЫЙ ГИСТОХИМИЧЕСКИЙ РЕАГЕНТ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ МОРФОГЕНЕЗА И ГИСТОПАТОЛОГИИ ПОЧКИ
Амбарова Н. А. На примере постнатального морфогенеза почки крысы и экспериментальной модели диабетической нефропатии исследовано возможность использования лектина гриба говорушки дымчас-той (С№А) в качестве гистохимического реагента. Показано, что упомянутый лектин может быть использован в качестве селективного маркера почечных телец и щеточной каемки проксимальных трубочек нефронов, для морфометрических исследований, а также в качестве достаточно информативного гистохимического реагента в исследовании качественной перестройки гликоконъюгатов почки как в условиях физиологической нормы, так и при патологии. Сравнение характера связывания лектина С№А с близкими ему по углеводной специфичности лектинами арахиса (РКА), сои (8БА) и виноградной улитки (НРА) позволило установить определенные различия в их связывании со структурными компонентами почки, что свидетельствует о своеобразии этого лектина как гистохимического реагента.
Ключевые слова: почка крысы, постнатальный морфогенез, диабетическая нефропатия, лектин С№А.
Стаття надшшла 5.01.2016 р.
LECTIN FROM CLITOCYBE NEBULARIS FUNGUS: A NEW HISTOCHEMICAL REAGENT
FOR THE INVESTIGATION OF RENAL MORPHOGENESIS AND HISTOPATHOLOGY Ambarova N. A. Having used postnatal renal morphogenesis and experimental diabetic nephropathy as test-models in rats we investigated the prospective usefulness of Clitocybe nebularis fungus lectin (CNFA) for histochemical research. It was documented possibilities of this lectin application as a specific histochemical marker of renal corpuscles and of proximal tubules brush border, for morphometric studies, as well as reliable histochemical reagent for the investigation of qualitative rearrangement of renal glycoconjugates under physiological conditions and in histopathology research. Comparison of CNFA with lectins of similar carbohydrate specificities - peanut agglutinin (PNA), soybean agglutinin (SBA), Helix pomatia agglutinin (HPA) - demonstrated certain differences in labeling, encompassing unique histochemical properties of this lectin.
Key words: rat kidney, postnatal morphogenesis, diabetic nephropathy, lectin CNFA.
Pe^roeHT GpomeHKO r.A.
