CC BY
19
ЛЕКАРСТВЕННАЯ УСТОЙЧИВОСТЬ ОПУХОЛЕВЫХ ПЛАЗМОЦИТОВ IN VITRO ПРИ МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМЕ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ОТВЕТА НА ЛЕЧЕНИЕ
А.К. Голенков, Е.В. Трифонова, Е.В. Катаева, A.B. Кильдюшевский, Т.Д. Луцкая, Е.А. Зарядьева, И.Н. Назарова, М.Н. Лукашина, Т.Н. Заботина, И.Н. Михайлова, А.Н. Иншаков, Н.П. Логачева, А.Ю. Барышников
МОНИКИ, РОНЦим. Н.Н.Блохина РАМН
Преодоление рефрактерности к противоопухолевому лечению при множественной миеломе (ММ) является одной из важнейших проблем клинической гематологии. В основе этой проблемы лежит особое состояние опухолевой клетки, которое определяется гиперфункцией гена множественной лекарственной устойчивости (MDR) и связанного с ним поверхностного протеина (Рдр), а также другие механизмы [3,5,6]. Клинические наблюдения показывают, что первичная рефрактерность к стандартной химиотерапии ММ встречается в 20-30% случаев [1,2], и этот процент увеличивается практически до абсолютных значений по мере проведения противоопухолевого лечения. В этой связи лечение рефрактерной миеломы базируется на применении новых противоопухолевых препаратов, совершенствовании полихимиотерапевтических программ, использовании высокодоз-ной противоопухолевой химиотерапии.
На наш взгляд, достаточно актуальной остается оптимизация стандартных режимов противоопухолевой химиотерапии, рефрактерной ММ. В этой связи могут быть получены позитивные результаты при использовании программ, составленных на основании как эмпирического подхода, так и детерминированного принципа лечения. В последнее время это стало возможным в результате определения устойчивости миеломных клеток в культуре к противоопухолевым препаратам [5]. Учитывая, что современные индукционные программы лечения ММ базируются в основном на полихимиотерапевтических схемах, весьма интересна информация о том, какие противоопухолевые препараты, применяемые в индукционном периоде, сохраняют еще противоопухолевую активность при формирующейся рефрактер-ности. Можно полагать, что использование их в качестве базисной терапии вторичной рефрактерности при ММ будет сопровождаться клиническим эффектом. При этом будет складываться отличная от эмпирического подхода ситуация, когда в качестве противоопухолевого агента используется препарат, чувствительность которого к опухолевым клеткам больного определили лабораторным путем. Этот принцип детерминированного подхода к совершенствованию противоопухолевой терапии представляется очень важным для клинической гематологии. Однако имеющиеся работы по этой проблеме пока еще не дают достаточных оснований считать такой принцип приемлемым для клинического применения.
В связи с этим, целью нашего исследования было выявление клинической значимости теста определения лекарственной устойчивости
опухолевых плазмоцитов костного мозга in vitro у больных множественной миеломой с различным ответом на лечение.
Для определения устойчивости опухолевых клеток к цитостатиче-ским препаратам применяли DISC-метод [7]. Аспираты костного мозга, содержащие опухолевые плазмоциты, после соответствующей обработки культивировали в течение 4 суток. В клеточные культуры добавлялись противоопухолевые препараты, применяемые для лечения ММ, в концентрациях, в 10 раз превышающих терапевтические. Опухолевые клетки считали чувствительными к исследуемому препарату, если количество погибших клеток в культуре составляло не менее 70%. Экспрессию на опухолевых клетках Bcl-2, Pgp, FAS/APO определяли методом проточной цитофлюорометрии.
Исследовано 12 больных множественной миеломой, которые были разделены на две группы. Первую группу составили больные, рефрактерные к проводимой программной полихимиотерапии (ПХТ). Во вторую включены больные, отвечающие на ПХТ. Факт рефрактер-ности устанавливали при отсутствии ответа на 2 курса ПХТ, проведенных по индукционным схемам.
Первую группу составили 5 человек (3 женщины и 2 мужчин). Средний возраст больных 58,5 лет (от 42 до 72 лет). Все пациенты данной группы находились в III стадии заболевания. У 4 пациентов имела место G миелома (к - 3, X - 1), у 1 - А миелома Х-типа. Время с момента постановки диагноза до настоящего исследования составило 68,2 месяцев (от 29 до 180 месяцев). Больным этой группы ранее проводилась стандартная ПХТ по схемам: CSVP (циклофосфан по 400 мг в/в с 1-го по 10-й дни, алкеран по 10 мг per os с 1-го по 5-й дни, винкристин по 2 мг в/в в 1-й и на 8-й дни, преднизолон по 60 мг per os с 1-го по 10-й дни), CSVPK (к предыдущей схеме добавляется карминомицин в дозе 0,2 мг/кг в/в на 2-й и на 9-й дни), CSVPR (вместо карминомицина использовался рубомицин в дозе 60 мг) и М-2 (циклофосфан в дозе 10 мг/кг в/в в 1-й день, винкристин 2 мг в/в в 1-й день, алкеран в дозе 0,25 мг/кг per os с 1-го по 4-й дни, BCNU в дозе 1 мг/кг per os в 1-й день и преднизолон в дозе 1 мг/кг per os с 1-го по 7-й дни). Исследование проведено в среднем через 2 месяца после окончания очередного противорецидивного курса ПХТ.
Вторая группа состояла из 7 человек (5 женщин и 2 мужчин), средний возраст 60 лет (от 45 до 68 лет). У всех больных диагностирована III стадия заболевания, у одной больной наблюдался первый рецидив после достигнутой ранее клинико-гематологической ремиссии. У остальных лечение предпринято впервые после определения лекарственной устойчивости, однако без учета результатов, полученных in vitro. Иммунохимические варианты: PlgG у 5 пациентов (к - 4, X - 1), PlgA- у2(к-1Д-1). Проведенные исследования, касающиеся изучения лекарственной устойчивости миеломных клеток в клеточных культурах у 12 больных ММ, выявили различия между 1-й и 2-й группами исследованных.
Таблица 1
Характеристика лекарственной устойчивости в культурах миеломных клеток у больных с множественной миеломой в зависимости от ответа на лечение
№ Препараты 1-я группа - рефрактерные (п=5) 2-я группа - ответившие (п=7)
устойчивы исследовано устойчивы исследовано
1 Преднизолон 2 5 2 6
2 Алкеран 2 4 3 7
3 Белюстин 2 2 1 1
4 Винкристин 5 5 5 7
5 Рубомицин 1 2 0 1
6 Доксорубицин 3 5 2 7
7 Цитарабин* 3 4 1 4
8 Метотрексат* 2 2 1 1
9 Цисплатин* 1 1 3 3
10 Этопозид* 1 2 0 4
Отношение: устойчивы/исследованы (М±т) 0,7±0,28 0,4±0,02 (р>0,05)
* Препараты не включались в программы первичной индукции.
Как видно из табл. 1, в группе больных, рефрактерных к проводимой противоопухолевой терапии, доля лекарственной устойчивости по 10 исследованным противоопухолевым препаратам в сравнении с общим количеством исследований составила 0,7+0,28. Во второй группе больных, которые отвечали на проводимое лечение, этот показатель был значительно ниже и составил 0,4±0,02, при недостаточной достоверности результатов (р>0,05). Сущность выявленных изменений заключается в том, что, по-видимому, имеется закономерная взаимосвязь между лабораторным тестом на лекарственную устойчивость и клиническим результатом. В связи с тем, что больным, в основном, проводилась ПХТ, состоящая из 4 или 5 препаратов, они были тестированы in vitro для определения лекарственной устойчивости схемы ПХТ в целом. Полученные результаты выражались в процентах, что по существу являлось количественной характеристикой неэффективной доли лекарственных препаратов, входящих в схемы ПХТ.
Как видно из представленной табл. 2, в группе больных со вторичной резистентностью предпринятое эмпирическое лечение не оказывало противоопухолевого эффекта. Снижение Pig в среднем составляло 7,4±2,5%. Тестирование опухолевых плазмоцитов в культуре для определения их устойчивости к противоопухолевым препаратам, применяемым в противорецидивных полихимиотерапевтических комбинациях, указывало на совпадение клинических и лабораторных результатов. Доля неэффективных препаратов в 4 или 5 компонентных химиотерапевтических комбинациях, к которым опухолевые плазмоциты были устойчивы In vitro, колебалась от 50 до 80% (в среднем 65+2,3%). В группе больных, отвечающих на лечение (табл.
3), результаты отличались от данных, полученных при исследовании рефрактерной миеломы.
Таблица 2
Характеристика лекарственной устойчивости опухолевых плазмоцитов in vitro у больных множественной миеломой, рефрактерной к проводимой полихимиотерапии
№ Исследуемые больные Программы лечения Снижение Pig, % (M±m=7,4±2,5) Доля неэффективных препаратов в комбинации, %* (М±т=65±2,3)
первичная индукция противо-рецидив-ная
1. М.Н.Н. ЦСВП (2) ЦСВПР(1) М-2 (3) 14 80
2. С.Л.И. М-2 (10) Ц+П (1) М+П (1) Р+П (3) 1 75
3. З.А.К. ЦСВП (6) М-2 (2) 4 50
4. С.Л.Н. ЦСВПК (8) ЦСВП (6) МП (10) М-2 (3) 9 75
5. Б.А.А. М-2 (3) - 9 50
Примечание: * Даны минимальные значения, так как не все препараты, входящие в схемы ПХТ, тестированы in vitro.
Таблица 3
Характеристика лекарственной устойчивости опухолевых плазмоцитов in vitro у больных множественной миеломой, отвечающих на проводимую полихимиотерапию
№ Исследуемые больные Программы лечения (количество курсов) Снижение Pig, % M+m=32,5±3,7 Доля неэффективных препаратов в комбинации, % М+т=35,7±5,3
1. I1I.E.H. М-2 (7) 35 50
2. С.Р.Ф. М-2 (13)+(3)* 52 25
3. С.Л.А. М-2 (4) 23 50
4. А.Н.И. М-2 (4) 25 25
5. С.А.А. М-2 (4) 43 50
6. С.С.Л. М-2 (4) 21 25
7. В.Г.М. М-2 (4) 29 25
Примечание: * Рецидив, чувствительный к программе первой индукции ремиссии.
Как следует из табл. 3, снижение концентрации Pig в группе отвечающих больных было значительно больше, чем при рефрактерной ММ (32,5+3,7% и 7,4+2,5%, р<0,05). При этом доля неэффективных препаратов в комбинациях ПХТ была значительно ниже, чем в группе рефрактерных больных (35,7+5,3 и 65+2,3, р<0,05).
Характеристика иммунологического фенотипа опухолевых плаз-моцитов исследуемых больных представлена в табл. 4.
Таблица 4
Сравнительная характеристика иммунологического фенотипа и лекарственной устойчивости in vitro у отвечающих и резистентных больных с множественной миеломой
Группы исследования Число больных Рдр (%) (Р> 0,05) Bel—2 (%) (Р> 0,05) FAS/APO (%) (Р< 0,05) Снижение Pig (в %) (Р< 0,05) Доля неэффективных препаратов в комбинации (в%) (р< 0,05)
Рефрактерная 5 13±7 49,7±13,5 5,8±2,5 7,4±2,5 65±2.3
Отвечающая 7 10,6±7 30±14 14,3±7,5 32,5±3,7 35,7±5,3
Как следует из табл. 4, экспрессия Рдр зафиксирована в минимальных значениях и существенно не различалась у исследуемых групп больных. Более отчетливые, хотя и недостоверные различия, выявлены при анализе экспрессии Вс1-2, которая была значительно выше у рефрактерных больных. Достоверные различия отмечены при анализе процесса апоптоза по FAS/APO, экспрессия которого была более выражена в группе больных, отвечающих на лечение.
Таким образом, проведенные исследования показали, что выделенные группы больных различались по ответу на проводимое противоопухолевое лечение. Это подтверждалось достоверными различиями в снижении концентрации Pig, являющемся интегральным показателем массы опухоли при ММ. В группе больных со вторичной рефрактерностью концентрация Pig снизилась незначительно (на 7,4+2,5%) после двух и более курсов лечения. В другой группе больных, где среднее снижение концентрации Pig в сыворотке составляло 32,5+3,7% после 4 и более курсов ПХТ, лечение расценивали как эффективное. В группе ответивших больных недостаточное снижение Pig относительно принятых стандартов (в среднем менее 50%) было обусловлено незавершенным индукционным периодом.
Анализ экспрессии Рдр показал, что он не был достоверно выше у рефрактерных больных, хотя определялся примерно в равных значениях в обеих группах. Известно, что функция Рдр наиболее ярко проявляется в отношении винкристина [4,5]. Полученные нами результаты подтверждают это положение. Исследования показали, что лекарственная устойчивость опухолевых плазмоцитов in vitro к винкристину была установлена у 10 из 12 больных (табл. 1), причем в 100% случаев у рефрактерных больных и в 71% у отвечающих на лечение. Высокий процент устойчивости к винкристину у больных, отвечающих на ПХТ-программы, включающие винкристин, по-видимому исключает его роль в усилении противоопухолевого действия комбинации в целом, хотя для более точного суждения об этом необходимо увеличить число наблюдений. Анализ экспрессии онкобелка Bcl-2 выявил не-
достоверное его увеличение у рефрактерных больных. Это коррелировало с низкими значениями FAS/APO в этой группе исследованных.
В группе реагирующих больных экспрессия FAS/APO была достоверно выше, что коррелировало с более низкими значениями экспрессии онкобелка Вс1-2. Это подтверждает известное положение о том, что онкоген реализует свое влияние на опухолевую клетку путем угнетения апоптоза. Исходя из этого можно предположить, что проводимая терапия у данной группы больных осуществляет свой противоопухолевый эффект через усиление процессов апоптоза в опухолевых плазмоцитах.
Оценивая сумму отношений выявленной устойчивости к 10 исследованным препаратам (табл. 1), можно утверждать, что изученное отношение было больше в группе рефрактерных больных. Это свидетельствует о том, что имеется взаимосвязь между результатами устойчивости опухолевых плазмоцитов к препаратам in vitro и клинической оценкой эффективности противоопухолевой терапии.
При анализе устойчивости опухолевых плазмоцитов к противоопухолевым препаратам, входящим в полихимиотерапевтические схемы, по существу была определена противоопухолевая активность применяемых в клинике программ полихимиотерапии. В результате этого анализа получены принципиально важные результаты, свидетельствующие о том, что в рефрактерной группе примененные эмпирические программы ПХТ включали в себя 65+2,3% неэффективных препаратов, согласно тесту in vitro. В то же время, в группе реагирующих больных с достоверно различающейся динамикой Pig доля неэффективных по тесту in vitro препаратов была достоверно меньше и составляла 35,7+5,3%.
Важно отметить, что при рефрактерной миеломе опухолевые клетки были устойчивы к препаратам, которые не использовались в программах первичной индукции. Это свидетельствует о том, что в данной группе исследованных сформировалась перекрестная резистентность. Проведенные исследования позволяют определить новые подходы к совершенствованию противоопухолевой химиотерапии ММ на основе детерминированного принципа.
ЛИТЕРАТУРА
1. Голенков А.К. // Гематол. и трансфузиол. - 1997. - №4. - С.25-39.
2. Магомедова А.У., Андреева Н Е. II Гематол. и трансфузиол. - 1997. - №4. -С.25-39.
3. Тюрина Н.Р., Судариков А.Б., Митерев Г.Ю., Савченко В.Г. II Клин. лаб. диагн. -1998.-№8.-С.32-32.
4. Musto Р., Matera R., Carotenuto М. II Drug Resistance in Leukemia and Lymphoma II. / Ed. by Pieters R., Kaspers G.J.L., Veerman A.J.P. - 1997. - P.299-305.
5. Raaijmakers H.G.P., Itquzerdo M.A., Belien J.A.M. // Drug Resistance in Leukemia and Lymphoma II. / Ed. by Pieters R., Kaspers G.J.L., Veerman A.J.P. - 1997. -P.514-520.
6. Twentyman Peter R. // Drug Resistance in Leukemia and Lymphoma II. / Ed. by Pieters R„ Kaspers G.J.L., Veerman A.J.P. - 1997. - P.403-411.
7. Weisenthal Larry M., Marsden Joye A. et al. II Cancer Res. - 1983. - V.43. - P.749-757; 749-754.
