CC BY
25
Сравнительный анализ данных МТТ-пробы у больных хроническим лимфолейкозом с различным ответом на химиотерапию
Е.В.Катаева, А.К.Голенков, Е.В.Трифонова, Т.Д.Луцкая, А.Н.Иншаков,
Н.П.Логачева, Е.Ю.Лысюк, А.Ю. Барышников МОНИКИ им. М. Ф.Владимирского, Москва
В последнее время в гематологии уделяется большое внимание проблеме лекарственной резистентности, так как с этим связана неэффективность программной химиотерапии (XT). В основе этой многогранной проблемы лежит особое состояние опухолевой клетки, которое определяется гиперфункцией гена множественной лекарственной устойчивости (MDR) и связанного с ним поверхностного протеина (Pgp-170), изменения в системе глута-тион S трансферазы, ее изоэнзима (GST), а также другие механизмы [2,3,4,5].
Больные с хроническим лимфолейкозом (XJ1JI) изначально, как правило, отвечают на химиотерапию, но все пациенты через некоторое время становятся рефрактерными к лечению[4]. Учитывая, что применяемые программы противоопухолевой XT базируются на эмпирическом принципе, возможно, что действующим фактором в них является только один препарат из многокомпонентной химиотерапевтической комбинации. При этом остальные препараты, оказываясь неэффективными, в значительной степени усиливают токсическое действие программы и приводят к превалированию миелотоксического эффекта над противоопухолевым.
В связи с этим было целесообразно определение лекарственной чувствительности in vitro (МТТ-проба) опухолевых клеток к различным противоопухолевым химиопрепаратам.
Целью настоящего исследования было изучение клинического значения теста лекарственной чувствительности опухолевых лимфоцитов к химиопрепаратам in vitro (МТТ-проба) у больных XJ1J1, резистентных и отвечающих на лечение.
Материалы и методы
Под нашим наблюдением находился 21 больной с XJ1JI (10 мужчин, 11 женщин), средний возраст 60,9 лет (от 43 до 75 лет). Диагноз хронического лимфолейкоза был установлен на основании периферической лимфоаденопатии, абсолютного лимфоцитоза в крови, подтвержден цитологическим или гистологическим исследованием костного мозга. Всем больным проводилось иммунофенотипичес-кое исследование лимфоцитов крови: выявлено превалирование В-клеточной опухолевой популяции (высокая экспрессия СД 5- 56,8±6,1%, СД19 - 84,6±3,8%), что сочета-
лось с низкой экспрессией Т-клеточных маркеров (СД 3 -9.4±1,5%).
На опухолевых лимфоцитах крови определяли так же экспрессию Pgp,Bcl-2, FAS/APO-1 методом проточной цитофлюориметрии на приборе FAScan («Becton Dickinson», USA).
В первую группу включено 6 больных со II стадией по Rai, которым химиотерапевтическое лечение к моменту обследования не проводилось. Остальным 15 больным проводилось лечение в виде монотерапии лейкераном или стандартных курсов XT (СОР, CHOP, ЛВПП, циклофосфан с преднизолоном). Они были разделены на 2-ю и 3-ю группы в зависимости от ответа на лечение. Отвечающие на лечение с длительностью болезни65,2 месяца в среднем( 34-106 месяцев) были 7 пациентов со II-III стадиями по Rai. У 8 больных со II-IV стадиями по Rai с длительностью болезни в среднем 64,0 месяца (24-131 месяцев) была констатирована рефрактерность. Ответ на химиотерапию оценивали в соответствии с критериями National Cancer Institute [9].
Чувствительность опухолевых клеток к химиопрепаратам у больных XJIJI определяли с помощью МТТ-пробы [6,7,8]. Для этого выделяли из периферической крови стандартным методом лимфоциты и инкубировали в течение 96 часов с цитосгатическими препаратами (преднизолон, винкристин, винбласгин, доксорубицин, рубомицин, лей-керан, мелфалан, натулан, вепезид, флударабин, цитара-бин). Используемые концентрации цитостатиков в культуре соответствовали известным фармакокинетическим данным для каждого препарата, обеспечивающим терапевтический эффект [1,10,11]. На заключительном этапе к культуре клеток добавляли тетразолиевую соль МТТ (3-4,5-dimethyl-thiazol-2-yl2,5-diphenil tetrazolium bromid), которая метаболизируется жизнеспособными клетками, превращаясь в нерастворимый в воде фармазан, тем самым изменяя оптическую плотность раствора пропорционально количеству выживших клеток. Оптическую плот-ность измеряли на спектрофотометре МР-5000 («Dynateck», Sweden, длина волны 550 нм). Опухолевые лимфоциты считались чувствительными к исследуемому препарату, если количество погибших клеток в культуре составляло не менее 50%.
66
КЛИНИЧЕСКАЯ БИОТЕРАПИЯ
Результаты и обсуждение
Как видно из табл. 1 в результате исследования было установлено, что в группах ранее не леченых, ответивших на лечение и рефрактерных больных число чувствительных опухолевых больных по отношению ко всем исследованным по каждому противоопухолевому препарату было различным.
Таблица 1. Характеристика лекарственной чувствительности в культуре лимфоцитов у больных с В-клеточным хроническим лимфолейкозом с различным ответом на лечение
№ ПРЕПАРАТЫ I группа (6 чел.) ранее не леченные 11 группа (8 чел.) рефрактерные больные III группа (7 чел.) ответившие на лечение
Чувстви- тельны Исследо- ваны Чувстви- тельны Исследо- ваны Чувстви- тельны Исследо- ваны
1 ПРЕДНИЗОЛОН 3 4 4 5 5 7
2 ВИНКРИСТИН 4 6 2 8 3 7
ВИНБЛАСТИН 4 6 4 8 1 7
4 ДОКСОРУБИЦИН 5 6 8 5 7
5 РУБОМИЦИН 5 6 2 3 2 2
6 ЛЕЙКЕРАН 5 6 1 8 3 5
МЕЛФАЛАН 2 2 4 3 3
НАТУЛАН 4 4 1 3
ВЕПЕЗИД 5 4 4 2 2
1 0 ФЛУДАРАБИН 5 6 4 8 5 7
1 1 ЦИТАРАВИН 5 6 2 3 1 2
Отношение чувств ктельны/нсследованы (М+ш) 0.82±0.03 0.510.08 0.65±0.09
Достоверность 1 и 11 группы < 0.05 И и III группы > 0.05 1 и III группы > 0.05
В группе больных, которые ранее не лечились, отношение чувствительных больных ко всем исследованным было достоверно больше (0,82±0,03); чем в группе рефрактерных к лечению (0,5±0,08) (Р<0,05). Это свидетельствует о том, что развивающаяся клиническая рефрактер-ность у больных сопутствовала снижению чувствительности опухолевых клеток в культуре к химиопрепаратам по сравнению с пациентами, которые еще не лечились. Сопоставляя 1 -ю группу больных и ответивших на химиотерапию (0,82±0,03 и 0,65±0,09), мы получили недостоверные различия между отношениями чувствительных больных ко всем исследованным, что можно объяснить сходными биологическими свойствами опухолевой клетки у пациентов этих двух групп.
В связи с тем, что больным в основном проводилась ХТ, состоящая из 3-5 препаратов, которые были тестированы т \itro для определения лекарственной чувствительности, можно было определить долю эффективных препаратов, входящих в схемы ПХТ, выраженную в процентах.
Как следует из таблицы 2, в группе рефрактерных больных, у которых было отмечено прогрессирование заболевания, доля эффективных препаратов колебалась от 0 до 50 % и составила 16,6±3,8 %, у больных с полной и частичной ремиссией (табл. 3) процент эффективных препаратов был значительно выше -84,0±4,2% (различия были достоверны -Р<0,05).
Таблица 2. Содержание эффективных препаратов по лабораторным данным лекарственной чувствительности в протоколах лечения рефрактерных больных хроническим лимфолейкозом
№ Группа рефрактерных бальных Доля эффективных препаратов
Исследуемые больные Характер ответа на химиотерапию в данной программе лечения, %
1 П.Н.Ф. Прогрессирование заболевания 33
2 Р.В.И. Прогрессирование заболевания 25
3 Р.П.Е. Прогрессирование заболевания 0
4 А.Г.М. Прогрессирование заболевания 50
5 К.П.И. Прогрессирование заболевания 0
6 Л.В.В. Прогрессирование заболевания 25
7 С.А.Г Прогрессирование заболевания 0
8 м.д.л Прогрессирование заболевания 0
Средние величины М+ш 16.6±3.8
Таблица 3. Содержание эффективных препаратов по лабораторным данным лекарственной чувствительности в протоколах лечения ответивших на химиотерапию больных хроническим лимфолейкозом
№ Группа ответивших больных Доля эффективных препаратов в данной программе лечения, %
Иссле- дуемые больные Характер ответа на химиотерапию
1 Ф.Н.Е. Полная ремиссия 66
2 Х.Н.С. Частичная ремиссия 100
3 С.М.С. Полная ремиссия 50
4 Б.Т.П. Частичная ремиссия 100
5 у.м.в. Частичная ремиссия 75
6 Б.А.А. Частичная ремиссия 75
7 С.М.С. Частичная ремиссия 100
Средние величины М+ш 84.0±4.2
Основываясь на полученных данных клинической реф-рактерности с анализом чувствительности в культуре, было целесообразно проанализировать иммунологический фенотип по маркерам, косвенно свидетельствующим о процессе лекарственной резистентности (Pgp-170, Вс1-2 и РАБ/АРО-1). Характеристика иммунологического фенотипа опухолевых клеток исследуемых больных представлена в таблице 4.
Как следует из таблицы 4, экспрессия Р§р-170 у рефрактерных больных составила 11,2±3,6%, у отвечающих больных 6,1 ±2,4%. Минимальные значения были зафиксированы в группе ранее не леченных больных (3,8±2,2%). Не было выявлено достоверных различий при анализе экспрессии Вс1-2, которая была несколько выше у рефрактерных и не леченых больных ХЛЛ (57.2±7.9 и 59.3±2.3 соответственно) по сравнению с отвечающими на терапию (23.4±7.5). Достоверные различия отмечены при анализе РАБ/АРО-1, экспрессия которого была более выражена в
Таблица 4. Сравнительная характеристика иммунологического фенотипа и лекарственной чувствительности in vitro у отвечающих, рефрактерных и не леченных ранее больных хроническим лимфолейкозом
Группа исследования Количество больных Pgp-170 (%) Bcl-2 (%) FAS/APO-1 (%) Доля эффективных препаратов в комбинации (%)
I Рефрактерные 8 11.213.6 57.217.9 7.613.2 16.613.8
II Отвечающие 7 6.112.4 23.417.5 30.411.9 84.013.9
III Не леченные 6 3.812.2 59.312.3 15.815.8 —
Р1П>0.05 Pi,ш >0.05 Рц,ш>0.05 Pi,п >0.05 Pi,ш >0-05 Рц,ш>0.05 Pi,и <0.05 Рцц <0.05 Рщп<0.05 Р0.05
группе больных отвечающих на лечение (30.4± 1.9) по сравнению с рефрактерными (7.6±3.2) ине лечеными (15.8±5.8). Установлена обратная корреляция Вс1-2 со значениями FAS/APO-1 в группах исследованных с различным клиническим ответом. Высокая экспрессия Вс1-2 (57.2±7.9) сочеталась с низкими значениями FAS/АРО-1 (7.6±3.2)в группе рефрактерных больных XJ1JI, а в группе отвечающих на химиотерапию низкая экспрессия Вс1-2 (23.417.5) сопутствовала высоким значениям экспрессии FAS/APO-1 (30.411.9).
Низкие значения экспрессии FAS/APO-1 в рефрактерной группе больных XJIJI, а также обратная корреляция значений супрессора апоптоза Вс1-2 и системы, запускающей апоптоз - FAS/APO-1 в обеих группах подтверждают известное положение о том, что онкоген реализует свое влияние на опухолевую клетку путем угнетения апоптоза. Исходя из этого можно предположить, что проводимая терапия у больных осуществляет свой эффект через усиление процессов апоптоза в опухолевых клетках.
Таким образом, проведенные исследования показали, что при XJIJI выявляется совпадение между лабораторными тестами исследования лекарственной чувствительности опухолевых клеток in vitro и ответом на XT с использованием этих препаратов.
Проведенные исследования позволяют сформулировать новые подходы к совершенствованию противоопухолевой химиотерапии XJIJI на основе детерминированного принципа по чувствительности in vitro.
Литература:
1.Культура животных клеток. Методы. Под редакцией Р.Фрешни, Москва, «Мир», 1989, стр. 264-265.
2.Curt G.A., Clendeminn N.I., Chabner B.A. Drug resistance in cancer. CancerTreatRep68:87-99,1984.
3.Lemoine N., Neoptolemos J., Cooke T. Cancer: a molecular approach. Oxford:Blakwell Scientific Publications, 1994.
4. Cheson B.D. Chronic Lymphoid Leukemias. Clinical Oncology-New York, 1995-P1999-2022.
5,Oscier D. Chronic lymphocytic leukaemia. Brighton:BlackwellScience Ltd, Brit. J. ofHaemat. 105, suppl.l-1999-P1-3.
6.Pieters R., Huismens D.R., Leyva A., VeermanA.J. Adaptation of the rapid automated tetrazolium dye based (MTT) assay for chemosensitivity testing in childhood leukemia. Cancer lett, 41(3), P323-323,1988.
7.Twentyman P.R., Fox N.E., Rees J.K. Alternative antracycines and resistance modifiers in humanleukemias an in vitro stady using the MTT-assay/Br.j. Haematol:71(l)-P 19-24,1989.
8.WeisentalL.M., DillP.L, Finklestein J.Z. at all. Laboratory detection of primary and aequired drug resistance in human lymphatic neoplasms. Cancer Treatment Reports 70:1283-1295, 1986.
9. Cheson et al. Guidelines for clinical protocols for chronik Lymphocytic Leukemia: recommendations of the National Cancer Institute sponsored Working Group American Journal of Haematology 29:152-163(1988).
10. Alberts D.S., George Chen H.S., Salmon S.E.(1980) In. Cloning of Human Tumour Stem Cells, Salmon S.E. (ed.)., Alan R. Liss, Inc., NY, P. 197.
11. Alberts D.S., George Chen H.S. (1980) In. Cloning of Human Tumour Stem Cells, Salmon S.E.( ed.), Alan R. Liss, Inc., NY, Appendix 4.
