CC BY
97
0
НАУЧНАЯ ЖИЗНЬ / Обзор научно-исследовательских работ
Лечебно-профилактические
свойства низкомолекулярных пептидов животного происхождения
Н. А. Горбунова, канд. техн. наук,
ГНУ ВНИИМП им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии
В последние годы значительно повысился интерес к изучению структуры и функций низкомолекулярных пептидов, содержащихся в животном и растительном сырье, а также в продуктах питания. Интерес представляет, прежде всего, ряд специфических биологических функций, выполняемых низкомолекулярными пептидами [1, 9].
^ Биологически активные пептиды образуются в ходе гидролиза белков пищеварительными ферментами, такими как трипсин, хи-мотрипсин или пепсин. Кроме того, биологически активные пептиды могут образовываться в ходе контролируемого гидролиза белков и пептидов. Они содержат всего несколько аминокислотных остатков и поэтому способны преодолевать эпителиальный барьер пищеварительного тракта и проникать в кровеносные сосуды, что позволяет им поступать к периферическим органам и, в конечном итоге, оказывать благотворное влияние на весь организм [2].
Ученые университета Мэидзе (Япония) провели оценку функциональных свойств свиной колбасы, обработанной в автоклаве, анализируя распределение протеинов и пептидов, ингибирую-щих активность ангиотензин-(1)-превращающего фермента (АПФ), что влияет на снижение артериального давления у больных гипертонией, и стимулирующих рост остеобласт-подобной культуры клеток [3].
Распределение белка гомоге-натов колбасы изучали с помощью метода электрофореза SDS-PAGE на градиентном блочном геле (7,5-20%) в соответствии с методом, описанным Леммли. Опытным образцом служила колбаса, обработанная в автоклаве при температуре 120 °С в течение 15 минут, контрольным - колбаса, обработанная в автоклаве при
температуре 75°С в течение 30 мин после достижения 63°С в центре. Распределение низкомолекулярных протеинов анализировали при помощи системы электрофореза трицин-SDS-PAGE. Гели окрашивали CoomassieBrilliant-В1ие R-250.
Анализ гомогената свиной колбасы обработанной в автоклаве с помощью SDS-PAGE показал, что полоса, соответствующая тяжелой цепи миозина исчезла. Также уменьшились интенсивности полос актина и а-ак-тинина по сравнению с результатами, полученными при исследовании гомогената колбасы, термически обработанной при 75°С. Кроме того, показано, что интенсивность полосы низкомолекулярных пептидов (<10 kDa) была больше у опытного образца, чем у контрольного.
Содержание свободных аминокислот и пептидов значительно увеличилось во время обработки фарша свиной колбасы в автоклаве по сравнению с термической обработкой при 75 °С. Было установлено, что опытный образец колбасы имеет более высокую ингибирующую активность АПФ, чем контрольный. Более того, активности щелочной фосфотазы и синтеза коллагена остеобласт-подобных культур клеток были значительно выше в обработанной в автоклаве колбасе, чем в колбасе, термически обработанной при 75 °С.
Таким образом, результаты
УДК 613.292:547.964.4
Ключевые слова: низкомолекулярные пептиды, функциональные продукты питания, метод электрофореза SDS-PAGE, протеаза, ингибирующая активность
проведенного исследования показывают, что свиные колбасы, обработанные в автоклаве, могут содержать больше функциональных пептидов с остеобластными и гипотензивными активностями, по сравнению с вареными колбасами. Можно предположить, что обработка в автоклаве способствует улучшению функциональных свойств мясопродуктов.
Цель исследований, проведенных на кафедре «Технологии пищевых продуктов» университета Эстремадуры (Испания) [4], заключалась в подтверждении результатов ранее проведенных исследований, показавших, что использование коммерческих протеаз в ферментированных колбасах позволяет высвободить большие количества низкомолекулярных пептидов с противоокис-лительными свойствами, которые повышают окислительную стабильность готовых продуктов.
Объектами исследований являлись две партии сыровяленых колбас: контрольная партия без добавления протеазы, и опытная партия с добавлением концентрата грибной протеазы валидазы из Aspergillus oryzae. Фракции экстрактов низкомолекулярных (НМ) соединений (< 3кДа) сыро-вяленой колбасы были разделены высокоэффективной жидкостной хроматографией с обращенными фазами (ОФ-ВЭЖХ)
Стабильный хромоген-радикал 2,2-дифенил-1-пикрилгид-разил (ДФПГ) использован для
36
ё О МЯСЕ № 1 февраль 2013
-Ф"-
Обзор научно-исследовательских работ / НАУЧНАЯ ЖИЗНЬ
fiP
исследования суммарной концентрации антирадикальных анти-оксидантов пептидных фракций.
Установлено, что экстракты обеих исследованных партий колбас содержали одинаковое количество пептидных фракций (9),только две из них показали методом ДФПГ противоокисли-тельное воздействие (55% для одной фракции и 40% для второй фракции). Анализ профилей ОФ-ВЭЖХ пептидных фракций опытных и контрольных образцов колбас показал одинаковые пики, различаясь по размеру. Это объясняется, возможно, более интенсивным протеолизом и большим количеством низкомолекулярных соединений изолированных во второй фракции в образцах с добавлением протеазы. Образцы колбас с протеазой имели более низкое окисление липидов, чем в контрольной партии (0,76 против 1,15 мг MDA/кг).
Кроме того, испанскими исследователями показано, что особая традиционная обработка Иберийского окорока сухого посола способствует протеолизу и образованию антиокислительных низкомолекулярных соединений в нем. Исследования конечных продуктов протеолиза в окороке подтвердили наличие различных низко- и среднемолекулярных пептидов, олигопептидов и свободных аминокислот. Антиокислительная активность, выраженная желирующим действием иберийских окороков, была значительно выше, чем активность экстрактов из окороков сухого посола (66% против 54%), в то же время не было обнаружено значительных различий между образцами по антигипертензивному действию [5].
Корейскими исследователями проведен выбор ферментов, которые позволили наиболее эффективно выделять биологически активные пептиды из белков мышцы т. longissimus от коров породы ханву [6]. Также задачами исследования являлось определение биологической активности сырых пептидных экстрактов, получаемых с помощью введения ферментов, таких как протеаза типа XIII и термолизин.
После ферментативного про-теолиза говядины от коров породы ханву и последующей экстракции вещества с молекулярной массой более 3000 Да были удалены с помощью ультрафильтрации. Фильтрат был лиофилизиро-ван и затем растворен в дистиллированной воде для измерения ингибирующей активности в отношение АПФ, антиоксидант-ной активности и активности по подавлению пролиферации раковых клеток. Сырой пептидный экстракт Е2 (экстракт из говядины ханву с инъекцией термолизина в концентрации 80 мг/л) показал наиболее высокую инги-бирующую активность в отношении АСЕ (1С50 = 2,3 мг/мл). В то же время экстракты Е1 (экстракт говядины ханву с инъекцией протеазы типа XIII с концентрацией 100 мг/л) и Е3 (экстракт говядины ханву с инъекцией протеазы типа XIII (100 мг/л) + термолизин (80 мг/л) продемонстрировали более высокую инги-бирующую активность в отношение АСЕ (ГС50 11,9 мг/мл и 21,2 мг/мл, соответственно) по сравнению с контрольным образцом (1370 мг/мл) (Р<0,05). Хотя экстракт Е2 обладал более высокой антиоксидантной активностью (7,63±0,28) по сравнению с контролем (6,52±0,26), его ан-тиоксидантная активность была все же невелика.
ЖЖизнеспособность трех протестированных раковых клеточных линий человека снижалась в зависимости от дозы и времени воздействия. В частности, через 48 часов после инкубации жизнеспособность клеток гепатокарци-номы человека HepG2 и клеток аденокарциномы толстого кишечника человека НТ29 при инкубации с экстрактами Е1 и Е2 в концентрации 400 и 800 мкг/мл значительно снизилась, до 55% от показателей необработанных клеток (К) (Р<0,05). Кроме того, экстракты Е1 и Е2 в концентрации 400 и 800 мкг/мл показали хоть и незначительную, но все же тенденцию к снижению жизнеспособности клеток карциномы эпителия шейки матки HeLa. Следовательно, экстракты Е1 и Е2 можно рассматривать как обла-
дающие ингибирующей активностью в отношении пролиферации раковых клеток HepG2 и HT29.
Исследование Национального института животноводства и Корейского научно-исследовательского института питания (Республика Корея) проводилось с целью выявления в свиной корейке пептидов, ингибирующих ангиотен-зин-1-превращающий фермент [7]. Тяжелые вещества с массой более 3000 Да удалялись из неочищенного ферментативного гидролизата свиной корейки с помощью ультрафильтрации. Наибольшую ингибирующую активность в отношении АПФ (IC50 = 606 мкг/мл) показал неочищенный пептидный экстракт из свинины, полученный с помощью термолизина. Затем он был очищен для отделения фракции с наиболее высокой АПФ-ингиби-рующей активностью при помощи гель-фильтрации и обра-щенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ). Из этой фракции были выделены две основные группы веществ с высокой АПФ-ингибирующей активностью, в которых было идентифицировано пять пептидов (VFPS, LLGR, LKYP, EPCLAT и LVGR-PRHGQ). Пептид LVGRPRHGQ с молекулярным весом 1019,6 Да продемонстрировал наиболее высокую ингибирующую активность в отношении ангиотензин-1-пре-вращающего фермента (IC50 = 15,69 мкМ/мл).
Авторами исследования обоснована необходимость дальнейших исследований с целью определения, является ли этот пептид устойчивым к воздействию пищеварительной системы желудочно-кишечного тракта и обладает ли другими биологически активными свойствами in vivo.
В Национальном университете Малайзии были изучены аминокислотный состав и свойства биологически активных пептидов, выделенных из кожи сома (Panga-sius sutchi) [8]. В экспериментах желатиновый экстракт из кожи сома подвергался гидролизу с помощью алкалазы при оптимальных условиях. Гидролиз прово-
№ 1 февраль 2013 ВСЁ О МЯСЕ
37
-Ф"-
0
НАУЧНАЯ ЖИЗНЬ / Обзор научно-исследовательских работ
дили в течение 0,5; 1; 2 и 3 часов. Желатин обладал наиболее высокой степенью гидролиза, равной 64,87% через два часа инкубации. Лиофилизированный гидролизат желатина с наиболее высокой степенью гидролиза был проанализирован на аминокислотный состав и молекулярно-массовое распределение. Результат электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсуль-фата натрия (SDS-PAGE) продемонстрировал, что протеолитиче-ский распад желатина из кожи сома, осуществленный посредством алкалазы, вызывает появление более низкомолекулярных полос по сравнению с исходным желатином. Гидролизат желатина
содержал две низкомолекулярные полосы, соответствующие массе около 45 кДа, и один фрагмент пептида массой 66 кДа. Анализ аминокислотного состава показал, что алкалаза расщепляет пептидные связи гидрофобных аминокислот, таких как Trp, Try, Phe и Pro. Как гидролизованный, так и негидролизованный желатин кожи сома были проанализированы на предмет ингибирующей активности в отношении ангио-тензин-превращающего фермента. Ингибирующая активность гидролизата желатина (IC50 = 0,77 мг/мл) была значительно выше, чем у негидролизованного желатина (IC50 = 1,95 мг/мл).
Авторами настоящего иссле-
дования рекомендовано дальнейшее изучение вышеупомянутых пептидов, полученных из желатина из побочных продуктов сома. Интерес представляет синтез АПФ-ингибирующих пептидов в качестве ингредиентов функциональных продуктов питания, предотвращающих гипертонию и способствующих укреплению здоровья. —
Контакты:
Наталья Анатольевна Горбунова +7(495)676-9317
Литература
1. Rainer Hartmann and Hans Meisel Food-derived peptides with biological activity: from research to food applications // Current Opinion in Biotechnology. 2007. 18: p.163-169
2. Yust, M. M., Pedroche, J., Giron-Calle, J., Alaiz, M., Millan, F., &Vioque, J. Production of ACE inhibitory peptides by digestion of chickpea legumin with alcalase.Food Chemistry. 81. p. 363-369.
3. Hayashi T., Toyoda N., Arakawa M., Haga S. Retort processing may induce protein degradation and improve food functionalities of meat product.- 56th International Congress of Meat Science and Technology. 2010. Jeju, Korea. E060
4. Timón M.L., Andrés A.I., Galea E.J., Parra V., Petrón M.J. Study of low molecular weight peptides (3<kDa) by RP-HPLC in Iberian chorizo, their antioxidative power and effect in oxidative stability of the products // 57th International Congress of Meat Science and Technology. 2011. Ghent, Belgium. P. 177
5. Timon M.L., Andres A.I., Galea E.J., Parra V., Petron M.J. Antioxidative and antihypertensive peptides in Iberian dry-cured ham.- 57th International Congress of Meat Science and Technology, 2011, Ghent, Belgium, P123
6. K.H. Seol, H.J. Kim, J.T. Hwang, M.H. Oh, A. Jang, J.S. Ham1, D.H. Kim, M. LeeBioactivities of crude peptide extracts of Hanwoo M. longissimus.- 56th International Congress of Meat Science and Technology. 2010. Jeju, Korea. B003
7. Kuk-HwanSeol, Dong-InSon, Hyun-JinKim, Thirawong Prayad и Mooha Lee Isolation and identification of angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptides from enzymatic proteolysate of pork loin // 58th International Congress of Meat Science and Technology. 2012. Canada, A-1
8. FatemehMahmoodani, MasomehGhassem, Abdul Salam Babji and SalmaMohamadYusopBioactive peptides isolated from enzymatic hydrolysate of catfish (Pangasiussutchi) skin gelati // 58th International Congress of Meat Science and Technology. 2012. Canada. A-3
9. Chen, Z.-Y., Peng, C., Jiao, R., Wong, Y. M., Yang, N. and Huang, Y. Anti-hypertensive nutraceuticals and functional foods // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11). p. 4485-4499
-Ф--
