CC BY
57
Показатель вариабелен для различных субклонов
I
* * S *. # * t * ///у У -о
& ^ •? •?
# •!»’
МКА
Рис. 3. Протективная активность (процент увеличения ' показателя средней продолжительности жизни) при введении моноклональных антител (МКА) через 24 ч после заражения
ным не влияло на показатель СПЖ. Не выявлено существенных различий показателя СПЖ при введении МКА как инбредным мышам (линии BALB/C), так и аутбредным (таблица).
Таким образом, наибольшей протективной активностью, по данным настоящего исследования, обладают МКА к ЛПС P. aeruginosa и его полисахаридному компоненту; у МКА к белкам наружной мембраны протективные свойства выражены в меньшей степени. Статистически достоверных отличий показателя СПЖ между группами- животных, получавших МКА различной эпитопной направленности, не выявлено, но отмечена тенденция к увеличению СПЖ на 33-67 % по сравнению с контролем и повышению процента выживших особей в группах животных, получавших МКА к ЛПС P. aeruginosa и его полисахаридному компоненту до 33-50 %.
Учитывая то, что использованный в работе штамм P. aeruginosa 103Р является токсинпродуци-рующим, перспективным представляется исследование протективных свойств МКА к экзотоксину А P. aeruginosa (данные МКА находятся в стадии тестирования в ТИФМ, накопления их препаративных количеств). Интересно дальнейшее исследование антиферментной активности МКА с возможным установлением корреляции между антиферментной
активностью и протективным эффектом МКА. Принимая во внимание более высокую эффективность липосомальной формы гентамицина по сравнению с официнальной, планируется конструирование липо-сомальных форм МКА с последующей оценкой их протективного потенциала.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ашмарин И.П., Воробьев А. А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. - Л., 1962. -180с. - 2. Barclay G.R., Yap P.L., McClelland D.B.L. et al. // J. Med. Microbiol. - 1986. - Vol. 21. - P. 87-90. -
3. Bruderer U., Deusinger М., Schurch U., Lang A. В. // Res. Immunol. - 1993. - Vol. 144, N9. - P. 659-665. -
4. Hancock R.E.W., Mutharia L.M., Mouat E.C.A. // Eur. J. Clin. Microbiol. - 1985. - N 4. - P. 224-227. - 5. O’ Berry P.A. // Am. J. Vet. Res. - 1964. - Vol.25. -P. 1669-1672. -
6.VanDelden C., Iglewski B.H. // Emerg. Infect. Dis. -1998. - Vol. 4, N 4. - P. 551-560. - 7. Zweerink H. J., Gammon M.C., Hutchinson C.F. et al. II Inf. Immun. - 1988. -Vol. 56, N8.-P. 1873-1879.
M.A.Obodova, N.P.Khrapova, E.A.Snatenkov, L.V.Lomova, N.I.Narbutovich
Serologic Prophylaxis of Biue-Pus Bacillary Sepsis under Experimental Conditions
Volgograd Anti-Plague Research Institute
Protective characteristics of monoclonal antibodies (MCA) was assessed against different antigens of Pseudomonas aeruginosa parenterally inoculated into infected biotest animals under operation modes of serologic prophylaxis and serologic therapy. Protection efficacy of the biomodels against the infection after MCA injection was estimated according to the average lifetime index (ALT). Beside the main plan, a combination of MCA and an antibiotic (gentamycin) was used both in the officinal and liposomal forms. Application of MCA as a protection means resulted in 35-50% prolongation of the animals' ALT as well as the appearance of survivors in individual experimental groups. The combination of MCA and the antibiotic also appeared effective: 40% increase in ALT of some animals was observed in these test groups.
Key words’. Pseudomonas aeruginosa, monoclonal antibodies, protective effect.
Поступила 14.05.05.
УДК 616.981.42:615.371/.372
Б.А.Шабалин1, В.Ю.Охапкина1, Л.Б.Гаврилова1, Л.В.Саяпина2
) ЛЕЧЕБНАЯ БРУЦЕЛЛЕЗНАЯ ВАКЦИНА - ЭФФЕКТИВНОЕ СРЕДСТВО ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ БРУЦЕЛЛЕЗА
'Научно-исследовательский институт микробиологии МО РФ, Киров;
2Государственный институт стандартизации и контроля им. Л.А. Тарасевича, Москва
Предложен новый компонентный состав, усовершенствован способ приготовления и контроля вакцины бруцеллезной лечебной жидкой. Освоен выпуск препарата и разработана нормативная документация.
. Ключевые слова: бруцеллез, лечебная вакцина, освоение производства, иммунологическая эффективность.
Анализ данных литературы показывает, что ле- по бруцеллезу, эта инфекция распространена прак-
чение больных бруцеллезом людей до настоящего тически во всем мире. В странах СНГ она встреча-
времени остается актуальной проблемой. По дан- ется повсеместно, главным образом в Казахстане,
ным Объединенного Комитета экспертов ФАО/ВОЗ Средней Азии, Северном Кавказе, Закавказье, а
также в некоторых регионах Западной Сибири и Поволжья. В Российской Федерации ежегодно регистрируется около 500 случаев впервые выявленного бруцеллеза. При этом официальные данные в полной мере не отражают истинную эпидемиологическую ситуацию из-за большого количества неучтенных случаев, что объясняется трудностями проведения дифференциальной диагностики заболевания и высокой долей заболевших с отрицательными серологическими реакциями [10].
Бруцеллез у человека представляет собой общий генерализованный инфекционный процесс, характеризующийся бактериемией с последующим обсеменением различных органов и систем, развитием местной воспалительной и общей реакций организма.
Основу патогенеза бруцеллеза составляет многогранный ответ иммунокомпетентных клеток на действие этиологического агента, заключающийся в кооперативном взаимодействии Т- и В-лимфоцитов и их регуляторных субпопуляций, в развитии дисбаланса клеточного звена иммунитета, снижении функциональной активности фагоцитов. Прогноз при бруцеллезе определяется, прежде всего, состоянием именно клеточного иммунитета, так как инфекция часто протекает на фоне достаточно высокого уровня циркулирующих антител, которые не обеспечивают защиту и не препятствуют формированию бактерионосительства.
Сложность и многоплановость иммунопатогенеза приводят к полиморфизму и лабильности клинической симптоматики, что обусловливает трудность выбора адекватных методов терапии. Принятые схемы лечения бруцеллеза, предусматривающие продолжительные повторные курсы с использованием различных комбинаций антибактериальных препаратов, в 35 % случаев не обеспечивают полного выздоровления. Проведение длительной массивной антибиотикотерапии закономерно ведет к проявлению побочных реакций препаратов, усугубляет специфическую сенсибилизацию организма и иммуносупрессию.
Наряду с этим, важной проблемой терапии является быстро развивающаяся резистентность бру-целл к антибактериальным препаратам, а также трансформация микробов в Ь-формы, приводящая к длительной внутриклеточной персистенции возбудителя в организме [2].
Вышеуказанные обстоятельства определяют необходимость проведения комплексной терапии бруцеллеза, включающей эффективные этиотроп-ные средства в сочетании с иммуномодуляторами, действие которых направлено на повышение клеточного, гуморального иммунитета и микробоцид-ной активности фагоцитов.
Многолетней клинической практикой доказана высокая эффективность бруцеллезной лечебной вакцины для специфической терапии данного заболевания [4, 9, 11]. В течение длительного периода применения вакцинотерапии постоянно проводились исследования, связанные с изучением различных способов получения вакцины как по форме антигенного препарата, так и по видовому составу входящих в ее состав штаммов бруцелл.
Вопрос относительно пригодности для этих целей тех или иных штаммов бруцелл до настоящего времени остается открытым. Различными авторами с этой целью применялись вакцинные штаммы Brucella abortus 19ВА, В. abortus М-104, слабовирулентные - В. suis 4, В. suis 18, а также вирулентные - В. melitensis 20, В. abortus 494 [3, 5, 12].
Однако имеющиеся в литературе сведения об антигенном составе, эпидемиологической и патогенетической значимости различных представителей возбудителя бруцеллеза [1, 6, 7] дают основание отдать предпочтение вирулентным штаммам видов В. melitensis и В. abortus, относящихся к 1 биотипу. В этой связи наиболее широкое распространение получил корпускулярный препарат из инактивированных нагреванием микробов, выпускаемый в 80-е годы Тбилисским институтом вакцин и сывороток, производство которого впоследствии было прекращено.
Многолетнее применение Тбилисской бруцеллезной вакцины в терапии бруцеллеза, особенно хронических форм, показало ее активность в отношении не только специфического, но и неспецифического иммунитета. Наблюдалось увеличение числа и нормализация функциональной активности субпопуляций Т-клеток, фагоцитов, повышался уровень общего и специфических иммуноглобулинов. К тому же препарат обладал десенсибилизирующим эффектом. При сочетанном использовании с антибиотиками вакцина способствовала более быстрой элиминации возбудителя из организма, предотвращала рецидивы в 74-100 % случаев [9]. Наряду с этим, вакцинотерапия оказывала выраженный клинический эффект и существенно улучшала субъективное самочувствие больных.
Вакцина представляла собой взвесь убитых нагреванием культур вирулентных микробов двух штаммов В. melitensis и одного штамма В. abortus 1 биотипа, пропорционально смешанных и хранящихся в 0,25 % растворе фенола. Препарат содержал Ы09 м.к. в 1,0 мл.
Значимый клинический эффект вакцинотерапии в лечении бруцеллеза и существующая потребность в данном препарате практической медицины обусловили необходимость возобновления его производства, что было сделано на базе НИИ микробиологии МО РФ (Киров). В то же время ужесточение в настоящее время требований к качеству выпускаемых МИБП, вводимым людям, определило целесообразность исследований по совершенствованию технологии производства и контроля лечебной бруцеллезной вакцины.
Одним из основных условий, определяющих эффективность вакцины, является отбор высоко-иммуногенных стабильных по свойствам производственных штаммов возбудителя бруцеллеза. Ввиду того, что принцип действия убитых вакцин, в том числе и бруцеллезной лечебной вакцины, связан с наличием в инактивированных культурах микроорганизмов набора полноценных антигенов, обеспечивающих иммунный ответ, в процессе производства приходилось решать задачи не только отбора штаммов бруцелл, но и предотвращения изменчивости клеток при хранении эталонов и рабочих культур непосредственно в ходе технологического цикла.
] Исходя из современных представлений об антигенной структуре возбудителя бруцеллеза и, для обеспечения иммунологической представительности препарата, для конструирования вакцины были отобраны высоковирулентные штаммы 1-го классического биотипа эпидемиологически значимых видов возбудителя бруцеллеза: два В. melitensis 21, 1!45 и один - В. abortus 544 [13, 14, 15]. Штаммы прошли комплексную оценку по основным биологическим свойствам: видовым характеристикам, вирулентности, антигенности, иммуногенности и соответствовали по этим показателям новым требованиям регламентирующей документации.
Проведенные исследования показали, что наибольшую трудность в процессе приготовления вакцины представляет поддержание штаммов в исходном высокоиммуногенном состоянии, поскольку применение неадекватных методов хранения и питательных сред приводит к появлению в культурах диссоциированных вариантов, свидетельствующих о нарушении основных биологических свойств микробов.
Так, для приготовления и хранения рабочих культур малопригодным оказался метод субкультивирования на плотных питательных средах, который имел место в производстве Тбиллисской вакцины. Несмотря на достаточное накопление микробной массы на среде в пробирках и отсутствие признаков диссоциации в пробе с трипафлавином, срок хранения подобных культур ограничен из-за низкой выживаемости микробов, что требует постоянных пересевов, существенно влияющих на биологическую стабильность культур. В этой связи для обеспечения качества готового препарата был предложен метод хранения рабочих культур в криоконсервированном состоянии в защитной среде. Данный метод позволил обеспечивать достаточный уровень выживаемости микробов при сохранении ими стабильности основных биологических свойств, не оказывая при этом влияния на ростовые характеристики возбудителя и накопление микробной массы при выращивании на питательных средах.
Бесспорным является тот факт, что качество и стандартность препарата во многом определяются используемой в технологическом процессе питательной средой. На сегодняшний день предложен широкий круг питательных сред, которые в целом пригодны для получения микробной массы бруцелл; Этому условию удовлетворяют и традиционно применяемые печеночный и мясопептонный агар. Однако в ходе опытов была выявлена достаточно низкая чувствительность последних при относительном сохранении стабильности биологических свойств выращиваемых микробов. Данное обстоятельство определило необходимость проведения специальных исследований по сравнительной оценке и выбору адекватной питательной среды для выделения бруцелл. Наиболее подходящей для этих целей оказалась [сухая коммерческая среда для выделения и культивирования туляремийного микроба (fT-arap) производства ГНЦПМ (Оболенск), которую отличает сбалансированность по аминокислотному и минеральному составу, а также стандартность и стабильность свойств питательной основы. Данная пи-
тательная среда не только обеспечивает накопление достаточного количества микробной массы со стабильными свойствами, но и характеризуется высокой чувствительностью при выделении бруцелл, что определяет преимущество ее использования при оценке специфической безопасности препарата.
Следует отметить, что ужесточение требований к технологии приготовления как питательных сред и растворов, так и самих препаратов, вводимых людям, позволяет с большей надежностью получать качественный продукт микробиологического производства. Поэтому в процессе приготовления вакцины производственные штаммы, рабочие культуры, полуфабрикат и конечный продукт оценивались согласно новым требованиям регламентной документации, что, с учетом изменений в технологии приготовления вакцины, значительно повысило ее безопасность.
В ходе проведенных работ получено несколько экспериментальных серий вакцины бруцеллезной лечебной жидкой, качество которых проверялось в соответствии с новыми требованиями и подтверждено в лаборатории ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Полученные положительные результаты послужили основанием для проведения дальнейших исследований по изучению иммунологической полноценности и эффективности полученного препарата на лабораторных животных.
Проверку лечебного эффекта экспериментальных серий вакцины проводили на морских свинках с отрицательными серологическими и аллергическими реакциями на бруцеллез. Для заражения животных использовали культуру высоковирулентного штамма В. теШеп51з 16М, не входящего в состав вакцины, в дозе 10 ИД50(70 м.к.). Лечение начинали через 1-1,5 мес. после заражения. Вакцину вводили в возрастающих дозах от 20-103до МО6 м.к. внутривенно в ретробульбарное венозное сплетение, от 40-103 до 4-10 м.к. подкожно с интервалом между инъекциями в 2-3 дня. Кроме того, были проведены исследования по оценке эффективности комплексной терапии экспериментального бруцеллеза, включающей различные схемы сочетанного введения вакцины и антибиотика из группы фторхинолонов -пефлоксацина. В процессе лечения у всех животных проверяли наличие аллергии (проба Бюрне) и уровень специфических антител (реакции Райта, связывания комплемента), а также оценивали фагоцитарную активность по данным опсоно-фагоцитарной пробы. По истечении 10 дней после окончания лечения всех животных подвергали эвтаназии и осуществляли бактериологическое исследование.
При проверке иммунологических реакций установлено, что все животные, спустя 15-21 день от момента заражения и на протяжении всего курса лечения, реагировали положительно на внутрикож-ное введение бруцеллина. Однако наблюдалась выраженная тенденция к уменьшению внутрикожной реакции в пробе Бюрне на фоне вакцинотерапии, особенно с возрастанием кратности введения препарата. Титры агглютининов в сыворотках крови морских свинок при вакцинотерапии также были сравнительно выше, увеличивались к окончанию курса и составили в среднем 1:320.
Особенно интересна динамика опсоно-фагоци-тарной реакции, которая, по мнению ряда ученых, считается наиболее надежным показателем клеточного иммунитета при бруцеллезе [8]. У большинства морских свинок после проведения вакцинотерапии отмечено нарастание активности фагоцитов, и фагоцитарный показатель составил 52-68.
Бактериологическое исследование внутренних органов животных на наличие бруцелл показало, что монотерапия как вакциной, так и пефлоксацином привела к освобождению от бруцелл в 72 и в 75 % случаев соответственно. В то же время лишь комбинированная терапия способствовала элиминации возбудителя из организма животных в 100 % случаев.
К настоящему времени в НИИМ МО РФ оформлена и утверждена необходимая нормативная документация и освоен промышленный выпуск лечебной бруцеллезной вакцины.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Бруцеллез / Под. ред. П.А.Вершиловой. - М., 1972. -
2. Бруцеллез сельскохозяйственных животных / Под. ред. И.А.Косилова. - Новосибирск, 1999. - 3. Дрожевкина М.С., Простетова Н.П., Харитонова Т.Н., Хохлова А.М. // Тр. Рост. н/Д гос. н.-и. противочум. ин-та. - 1961. - Т. 17. -
С. 156-169. - 4.Ельчинова Е.А., Журбина М.Д. // ЖМЭИ. - 1973. - №10. - С. 72-76. - 5. Зайцева А.И. // ЖМЭИ. - 1961.-Х» 1. - С. 107-110. - 6. Кайтмазова Е.И., Островская Н.Н. // ЖМЭИ. - 1967. - X® 1. - С. 12-16. -
7. Кайтмазова Е.И., Островская Н.Н. // ЖМЭИ. -1967. - X» 2. - С. 66-70. - 8. Первушин Б.П. Вопросы микробиологической и иммунологической диагностики бруцеллеза у человека. - М., 1962. - 9. Поляков И.И. // Пробл. особо опасных инф. - 1969. - X® 6. - С. 162-166. - 10. Узбекова Б.Р., Кондратьева О.В., Синицын И.Д. // Пробл. особо опасных инф. - 1974. - Вып. 3 (37). - С. 115-119. - 11. Юнусова X. Вакцинотерапия бруцеллеза. Клинико-экспериментальные данные. - Ташкент, 1958. - 12. Феоктистов Г.И., Маркевич А.А. // Докл. Иркут, противочум. ин-та. - Иркутск, 1962.-Вып. 4. - С. 70-72. - 13. Joshi D.V., Prakash О. // Ind. J. Med. Rev. - 1971. - Vol. 59, N 10. - P. 1556. - 14. Joshi
D.V., Prakash 0., .Talvar G.P.//Ind. J. Med. Rev. - 1971. -Vol. 59, N 8. - P. 1225. - 15. Morgan W.J. // Dev. Biol. Standard. - 1984. - Vol. 56. - P. 43-53.
B.A.Shabalin, V.Yu.Okhapkina, L.B.Gavrilova, L.V.Sayapina
A Therapeutic Brucellosis Vaccine is an Efficient Means of Pathogenetic Treatment of Brucellosis
Microbiology Research Institute, RF MD, Kirov;
LA.Tarasevich State Institute for Standardization and Control, Moscow
A new component constitution is offered for the liquid therapeutic brucellosis vaccine with a more perfect procedure for its preparation and control. The production process has been adjusted and furnished with well-developed normative documentation.
Key words', brucellosis, therapeutic .vaccine, the development of the production process, immunologic efficacy.
Поступила 27.07.05.
ДИАГНОСТИКА
УДК 616.36-002:616-07
Н.Ф.Василенко1, С.Н.Степанова1, В.И.Ефременко1, Е.Н.Афанасьев1, Е.И.Еременко1, О.И.Цыганкова',
В.АЛетрюк , Н.А.Яценко2, С.М.Безроднова2
ПРИМЕНЕНИЕ СОЧЕТАННЫХ МЕТОДОВ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ГЕПАТИТА А
1Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт,
2Ставропольская государственная медицинская академия
Разработаны сочетанные методы экспресс-диагностики вирусного гепатита А с помощью селективного концентрирования вируса на поверхности магнитных иммунных сорбентов (МИС) и последующего проведения иммуноферментного анализа (ИФА) и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Показано, что применение МИС в сочетании с экспрессными методами диагностики (ИФА и ПЦР) увеличивает чувствительность этих методов, одновременно сокращая время проведения исследований за счет ускорения манипуляций и исключения ряда этапов в ходе анализов, что повышает эффективность проведения противоэпидемических мероприятий.
Ключевые слова: гепатит А, антиген, РНК вируса, иммуноферментный анализ, полимеразная цепная реакция, магнитные иммунные сорбенты, сочетанный метод.
ре вирусных гепатитов колеблется от 80 до 90 %. В Российской Федерации вирусный ГА занимает ведущее место в этиологической структуре вирусных гепатитов у детей, а уровень заболеваемости этой инфекцией в детском возрасте в России в несколько раз превышает соответствующие показатели в развитых странах мира [4]. В связи с этим актуальна про-
Вирусные гепатиты являются одной из самых актуальных проблем современной медицины. Это определяется как их повсеместным распространением, так и высоким уровнем заболеваемости. Гепатит А (ГА) - наиболее распространенное вирусное заболевание печени у человека. По данным В.Ф.Учайки-на с соавт. [7], доля этого гепатита в общей структу-
