CC BY
76
УДК 616-07
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА НОВОЙ КОРОНАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ
COVID-19
Черничук О.В.,
заведующий центром лабораторной диагностики АУ «Югорский Центр профессиональной патологии», главный внештатный специалист по клинической лабораторной диагностике Департамента здравоохранения Ханты-Мансийского автономного округа — Югры
Чернова О.О., биолог центра лабораторной диагностики АУ «Югорский Центр профессиональной патологии»
г. Ханты-Мансийск
Методы клинической лабораторной диагностики, используемые для выявления РНК SARS-CoV-2 и определения антител к SARS-CoV-2.
Ключевые слова: РНК SARS-CoV-2/ антигена SARS-CoV-2/ антитела классов А, M, G (^А, ^ и ВД к SARS-CoV-2
Клиническая лабораторная диагностика занимает важное место среди диагностических служб современной медицины. Лабораторные исследования являются необходимыми для своевременного принятия правильного клинического решения и контроля эффективности проводимого лечения. По данным ВОЗ, с помощью лабораторных анализов специалист получает примерно до 80% точной информации о состоянии здоровья пациента. «Кто хорошо диагностирует, тот хорошо лечит» — это древнее изречение продолжает оставаться основой современной медицины.
Появление COVID-19 поставило перед специалистами здравоохранения задачи, связанные с быстрой диагностикой и оказанием медицинской помощи больным.
Лабораторная диагностика общая
Объем, сроки и кратность лабораторных исследований зависят от степени тяжести заболевания. В случае госпитализации по поводу среднетяжелого, тяжелого и крайне тяжелого течения необходимо выполнить следующие исследования:
• общий (клинический) анализ крови;
• биохимический анализ крови (мочевина, креатинин, электролиты, глюкоза, аланина-минотрансфераза, аспартатаминотрансфе-раза, билирубин, альбумин, лактат, лактат-дегидрогеназа тропонин, ферритин);
• С-реактивный белок (СРБ);
• гормональное исследование: прокаль-цитонин, мозговой натрий-уретический пептид - ЫТ-ргоВЫР/ВЫР;
• коагулограмма в объеме: активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), протромбиновое время, протромбиновое отношение, фибриноген, D-димер (количественным методом).
Прогностические лабораторные маркеры
У большинства пациентов с COVID-19 наблюдается нормальное число лейкоцитов, у одной трети обнаруживается лейкопения, лимфопения присутствует у 83,2% пациентов. Тромбоцитопения носит умеренный характер, но более отчетлива при тяжелом течении и у лиц, умерших от COVID-19.
Возрастание D-димера в 3-4 раза более возрастной нормы и удлинение протромбинового времени, особенно при тяжелом течении (снижение % протромбина), увеличение фибриногена имеет клиническое значение. Необходимо учитывать возрастные особенности: D-димер повышается после 50 лет в связи с накоплением хронических заболеваний.
Уровень СРБ коррелирует с тяжестью течения, распространенностью воспалительной инфильтрации и прогнозом при пневмонии. Концентрация СРБ увеличивалась у большинства
пациентов, одновременно с увеличением интер-лейкина-6 (ИЛ-6) и СОЭ в разной степени. Отмечено увеличение острофазового белка ферри-тина при неблагоприятном течении заболевания.
При развитии ОРДС: каждые 48-72 часа до стойкого получения отрицательных уровней необходимо определять: ИЛ-6, D-димер, фер-ритин, фибриноген, С-реактивный белок, триг-лицериды, ЛДГ.
Лабораторные показатели прогрессирующего синдрома активации макрофагов: дву-трехростковая цитопения, нарастание уровня ферритина, СРБ, АЛТ, АСТ, ЛДГ, ги-понатремия, гипофибриногенемия, снижение уровня антитромбина III, пролонгирование протромбинового времени и активированного частичного тромбопластинового времени.
Гипервоспаление при COVID-19 может манифестировать: цитопенией (торомбоцитопе-ния и лимфопения), коагулопатией (тормбоци-топения, гипофибриногенемия и повышение D-димера крови), повреждением тканей/гепатитом (повышение уровня ЛДГ и аминтранс-фераз сыворотки крови) и активацией макро-фагов/гепатоцитов (повышение уровня фер-ритина сыворотки крови).
В диагностике и прогнозе течения сепсиса имеет значение уровень прокальцитонина: < 0,5 мкг/л — низкий риск бактериальной коинфек-ции и неблагоприятного исхода; > 0,5 мкг/л — пациенты с высоким риском, вероятна бактериальная коинфекция. Анализ на прокальци-тонин при поступлении является дополнительной информацией для ранней оценки риска и исключения бактериальной коинфекции у пациентов с COVID-19.
Развитие сердечно-сосудистых осложнений при COVID-19 также сопровождается лимфо-пенией, тромбоцитопенией, повышением СРБ, МВ-фракции креатинкиназы, высокочувствительного тропонина и мозгового натрий-уре-тического пептида (ЫТ рго-ВЫР).
Этиологическая лабораторная
диагностика на 5А1?$-Со\/-2
Прямые методы диагностики
• Выявление РНК 8А118-СоУ-2 методом по-лимеразной цепной реакции;
• Выявление антигена 8АИ8-СоУ-2 с применением иммунохроматографического метода.
Непрямые методы диагностики
• Выявление иммуноглобулинов классов А,
M, G (IgA, IgM и IgG) к SARS-CoV-2 имму-
ноферментным методом и иммунохромато-
графическим методом.
Прямые методы диагностики COVID-19
Полимеразная цепная реакция
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — высокочувствительный и высокоспецифичный метод исследования, который позволяет определить наличие нуклеиновых кислот (НК) в биологическом материале. Принцип метода заключается в многократном копировании (амплификации) специфических участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов.
Технология постановки полимеразной цепной реакции состоит из 3 этапов:
1. Выделение РНК из биологического образца.
2. Проведение реакции обратной транскрипции.
3. Амплификация специфического фрагмента ДНК и детекция.
Real-Time ПЦР
Разновидность ПЦР, при которой происходит регистрация результатов накопления специфических участков искомой ДНК непосредственно в процессе реакции. Регистрация флуоресценции происходит с помощью детектора флуоресценции после каждого цикла амплификации. На основании считываемых данных происходит построение графика накопления флуоресцентного сигнала.
Рис.1 ПЦР в реальном времени. Источник:: Ppt-online.org
Сигнал флуоресценции в ходе ПЦР возрастает пропорционально количеству продукта амплификации. Момент регистрируемого увеличения сигнала и отрыва его от фонового, так называемый пороговый цикл (С), зависит от исходного количества искомой ДНК. Чем больше количество ДНК в образце, тем раньше наблюдается начало роста сигнала флуоресценции и тем меньше пороговый цикл. Таким образом, значение С обратно пропорционально количеству искомой ДНК в реакции, то есть чем меньшее количество искомой ДНК находится в реакционной смеси, тем большее количество циклов необходимо для достижения порогового цикла (С) реакции. Рис.1
Результат считается достоверным только в случае прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и отрицательного контроля выделения ДНК.
Оснащение оборудованием для проведения ПЦР-исследований
Диагностика методом ПЦР требует оснащения дорогостоящим оборудованием, которое на начало пандемии имелось в недостаточном количестве.
В связи с пандемией COVID-19 в 2020 году проведена модернизация лабораторий ПЦР, что позволило увеличить производительность ПЦР-лабораторий с 1500 до 7500 исследований в сутки и обеспечить нормативный срок выполнения 48 часов.
Биологический материал и его транспортировка
Основным видом биоматериала для лабораторного исследования на РНК SARS-CoV-2 является материал, полученный при заборе мазка из носоглотки (из двух носовых ходов) и ротоглотки. Мазки со слизистой оболочки носоглотки и ротоглотки собираются в одну пробирку для большей концентрации вируса.
Подготовка пациента перед сдачей мазка со слизистой носа и зева:
• Минимум за 1 час до взятия мазков из ротоглотки (зева) нельзя употреблять пищу, не пить, не чистить зубы, не полоскать рот/ горло.
• За три часа до исследования рекомендуется не употреблять жевательную резинку, лекарства и капли для носа.
• За 1 час до взятия мазков из ротоглотки
(зева) нельзя курить.
Все образцы, полученные для лабораторного исследования, следует считать потенциально инфицированными, и при работе с ними должны учитываться требования СП 1.3.311813 «Безопасность работы с микроорганизмами 1-11 групп патогенности (опасности)». Медицинские работники, которые собирают или транспортируют клинические образцы в лабораторию, должны быть обучены практике безопасного обращения с биоматериалом, строго соблюдать меры предосторожности и использовать средства индивидуальной защиты (СИЗ).
Забор диагностического материала, его упаковка, маркировка и транспортировка осуществляется в соответствии с требованиями и правилами к работе с материалами, потенциально инфицированными возбудителями II группы патогенности, их хранении и транспортировки согласно СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов Г-ГУ" групп патогенности».
Срок выполнения исследования
Срок выполнения исследования на выявление РНК SARS-CoV-2 методом амплификации нуклеиновых кислот не должен превышать 48 часов с момента поступления биологического материала до получения его результата лицом, в отношении которого проведено соответствующее исследование.
Преимущества метода ПЦР
Высокая специфичность. Метод ПЦР определяет заданную последовательность ну-клеотидов, присущую конкретному патогену. Таким образом, специфичность теста стремится к 100%.
Чувствительность. Для ПЦР достаточно всего несколько молекул ДНК патогена (или даже уже неактивных - разрушенных вирусных частиц, сохранивших специфические участки ДНК в достаточном количестве), чтобы он был обнаружен в ходе исследования.
Диагностика латентной инфекции. ПЦР-ди-агностика определяет возбудителя инфекции в инкубационном периоде и при скрытом течении заболевания.
Единственный серьезный «недостаток», связанный с методом полимеразной цепной реак-
ции, — его высокая технологичность. Исследования ПЦР требуют строжайшего соблюдения правил выстраивания технологических процессов и серьезной оснащенности лабораторного комплекса.
Иммунохроматографический анализ выявления антигена SARS-CoV-2
Данный тест основан на мембранной технологии. Нитроцеллюлозная мембрана сенсибилизирована моноклональными антителами, направленными против высококонсервативного нуклеопротеинового антигена SARS-CoV и SARS-CoV-2. При внесении образца в лун-
ку тест-кассеты происходит взаимодействие с конъюгатом, который связан с моноклональными антителами SARS-CoV-2. Если образец содержит SARS-CoV-2, комплекс конъю-гат-SARS-CoV-2 останется связанным с антителом SARS-CoV-2, иммобилизованным на ни-троцеллюлозной мембране.
Тест позволяет проводить масштабный скрининг пациентов, в соответствии с методическими рекомендациями. Разгружает лабораторию ПЦР. Наборы обладают хорошей чувствительностью (96%) и специфичностью (100%) (рисунок 2).
Рис. 2. Процедура теста на антиген SARS-CoV-2 Источник: Тпа1м843.г
Интерпретация результатов теста:
Результат выдается в качественном формате, при появлении или отсутствии цветных полос на тестовой линии (Т) и контрольной линии (С).
Контрольная линия (С) должна появляться на всех действительных тестах, независимо от того, положительный или отрицательный образец. Контрольная линия показывает, что образец был добавлен и жидкость перемещалась через испытательное устройство.
Непрямые методы диагностики COVID-19
Выявление антител к SARS-CoV-2 имеет вспомогательное значение для диагностики текущей инфекции и основное для оценки иммунного ответа на текущую или перенесенную инфекцию. Выявление антител к SARS-CoV-2 проводится с использованием иммунохимиче-
ских методов. Антитела класса А (Т^А) начинают формироваться и доступны для детекции примерно со 2 дня от начала заболевания, достигают пика через 2 недели и сохраняются длительное время. Антитела класса М (^М) начинают выявляться примерно на 7-е сутки от начала заражения, достигают пика через неделю и могут сохраняться в течение 2-х месяцев и более. Антитела класса G (IgG) к SARS-CoV-2 начинают определяться примерно с 3-й недели или ранее.
Особенностью гуморального ответа на инфекцию является небольшой временной промежуток между появлением антител ^М и IgG, а иногда и одновременное их формирование.
Иммунохроматографический метод выявления антител к SARS-CoV-2
Метод, основанный на разделении частиц методом парной связки и реакции между ан-
тигеном и соответствующим ему антителом в биологическом материале. Данный вид анализа проводится с помощью специальных экспресс-тестов, тест-полосок или тест-кассет.
При внесении исследуемой крови в специальную лунку теста она начинает мигрировать вдоль полоски по принципу тонкослойной хроматографии. Вместе с жидкостью движется конъюгат, содержащий антитела с красителем. Если в крови присутствует исследуемый анти-
опыт и инновации №2 2021
ген, то происходит его связывание с антителом. При этом происходит накопление антител с красителем.
Визуально накопление антител с красителем проявляется в виде окрашивания тест полоски. Свободные антитела с красителем мигрируют далее вдоль полоски и неизбежно взаимодействуют с вторичными антителами в контрольной зоне, где и наблюдается вторая окрашенная (контрольная) полоса (рисунок 3).
Рис.3 Процедура проведения экспресс-теста на определение антител к SARS-CoV-2
Источник:: Silasluha.ru
Метод иммуноферментного анализа
Метод основан на высокоспецифической иммунологической реакции «антиген-антитело» с образованием иммунного комплекса. При этом один из компонентов конъюгирован с ферментом. В результате реакции фермента с хромогенным субстратом образуется окрашенный продукт, количество которого можно определить спектрофотометрически.
Интерпретация результатов
исследований на антитела к ЗДРБ-СоУ-2
Результаты исследований на специфические антитела к SARS-CoV-2 методом ИФА могут быть выражены как в форме титров, так и в виде оценки коэффициента позитивности
(КП):
1. Титр образцов сыворотки крови — это
максимальное разведение сыворотки крови, при котором еще выявляются антитела (обнаруживается положительный результат исследований), и выражается он в виде соотношения, например, 1:70, 1:200, 1:500 и т.п.
2. Величина КП (в некоторой степени зависит от концентрации антител в сыворотке
крови) — это соотношение оптической плотности пробы пациента к пороговому, предельно допустимому, значению. Данный показатель является универсальным и используется в качественных тестах, он характеризует степень позитивности, но не дает оценку сформировавшемуся иммунитету.
Результаты исследований на уровень специфических антител к SARS-CoV-2, полученные на автоматическом анализаторе (иммунохеми-люминесцентный метод) указываются в условных единицах (например, МЕ/мл, Ед/л, и т.п.). С точки зрения терминологии, не совсем корректно называть эти результаты «титром антител» или «КП», так как речь идет о количестве антител к SARS-CoV-2 в конкретном образце сыворотки крови, определяемом автоматически в соответствии с калибровочным графиком, построенном на основе различных концентраций ^М и IgG в аликвоте.
Деятельность лабораторной службы ХМАО - Югры 2018-2020 гг.
В 2020 году выполнено 1 350 916 исследование методом ПЦР, что на 241% больше, чем
в 2019 году (диаграмма 1). Диагностика инфек- чение исследований произошло в связи с тем, ций, не вызывающих COVID-19 в 2020 году что метод ПЦР является основным в диагно-снизилась всего на 6,4%, значительное увели- стике SARS-CoV-2.
Диаграмма 1
Количество выполненных исследований методом ПЦР лабораториями медицинских
организаций ХМАО - Югры
2018 2019 2.02.0
Показатели лабораторных
исследований на SARS-CoV-2 методом ПЦР 2020-2021 годов
Анализируя статистические данные по выполнению исследований на SARS-CoV-2 мето-
дом ПЦР, наблюдается небольшое увеличение количества исследований в июне — июле 2020 года, значительное увеличение (пик) количества исследований пришелся на ноябрь 2020 года (диаграмма 2).
Таблица 1
Количество исследований на SARS-CoV-2, выполненные методом ПЦР лабораториями медицинских организаций ХМАО-Югры, ежемесячно с апреля 2020 года по апрель 2021 года
Период SARS-CoV-2 из них " + " % выявленных " + " проб
Апрель 24 584 209 0,9
Май 71 179 1 664 2,3
Июнь 110 271 7 452 6,8
Июль 128 043 12 748 10,0
Август 84 823 4 200 5,0
Сентябрь 95 709 5 404 5,6
Октябрь 155 865 23 090 14,8
Ноябрь 184 710 31 442 17,0
Декабрь 125 546 22 463 17,9
Январь 81 579 9 995 12,3
Февраль 68 389 5 547 8,1
Март 70 878 4 333 6,1
Апрель (2021) 60 693 2 950 4,9
Всего 1 262 269 131 497 10,4
По количеству выявленных положительных проб на SARS-CoV-2 наблюдается аналогичная картина (таблица 1, диаграмма 2). В отличие от абсолютного количества, максимальный про-
цент выявленных положительных проб приходится на декабрь 2020 года, когда общее число исследований стало снижаться (таблица 1).
Показатели лабораторных исследований на ЗДРЗ-СоУ-2 методом ПЦР 2020 год
Диаграмма 2
Количество исследований на ЗДРЗ-СоУ-2 и количество положительных проб, выполненных методом ПЦР лабораториями медицинских организаций ХМАО-Югры, ежемесячно с апреля 2020 года по апрель 2021 года
Число исследований на ЗДРЗ-СоУ-2, выполняемых ПЦР-лабораториями ХМАО-Югры в среднем за сутки
Диаграмма 3
Количество исследований на ЗДРЗ-СоУ-2, выполненных методом ПЦР в среднем за сутки лабораториями медицинских организаций ХМАО-Югры, ежемесячно с апреля 2020 года по апрель 2021 года
Проведенная модернизация лабораторий ПЦР медицинских организаций ХМАО — Югры позволила увеличить производительность от 1 426 исследований в сутки до 6 758 исследований в сутки, при необходимости это количество может быть увеличено до 7 500 тысяч (диаграмма 3).
Таким образом, анализируя представленные данные о проведении лабораторных исследованиях на SARS-CoV-2 методом ПЦР, выполненных лабораториями медицинских организаций ХМАО — Югры с апреля 2020 года по апрель 2021 года, наблюдаются два увеличения (пика) количества исследований, которые приходятся на июль 2020 года и ноябрь 2020 года.
Литература
1. Авдеев, С.Н., Адамян, Л.В., Алексеева, Л.И. и др. Временные методические рекомендации // Профилактика, диагностика и лечение новой коронавирусной инфекции COVТD-19. Версия 10 (08.02.2021). - С.24-33.
2. Бугров, А.В., Долгов, В.В., Казаков, С.П. и др. Клиническая лабораторная диагностика: в 2т. Т. 1 / под ред. Профессора В.В. Долгова. — М.: ООО «Лабдиаг», 2017. - 464 с.
3. Бактышев, А.И. ПЦР-тестирование: как работает метод ПЦР в диагностике https://citilab.ru/ articles/ptsr-testirovanie-kak-rabotaet-metod-htsr-v-diagnostike/ 10.02.2021 год.
4. Флямер, И. Важнейшие методы молекулярной биологии и генной инженерии // https:// biomolecula.ru/articles /vazhneishie-metody-molekuliarnoi-biologii-i-gennoi-inzhenerii 2011 год.
5. Зорина, В.В. Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР) / Методическое пособие. ООО «ДНК-технология». Версия 083-4. — 148 с.
6. Клеточные и гуморальные механизмы защиты при коронавирусной инфекции // Практикум специалиста. Справочник заведующего КДЛ — 2021.— №5.
7. Методы исследования. Справочник анализов. https://spravochnik.synevo.ua/ru/intro/method. html.
8. 30-форма ежегодной статистической отчетности лабораторий. Таблицы 5300-5301. 2020.
© Черничук О.В., Чернова О.О., 2021
