CC BY
49
УДК 619:579:841.93
Л.М. Михайлов, А.И. Калиновский, Н.Л. Баранникова
КУЛЬТУРАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БРУЦЕЛЛ НА ЭТАПАХ ^ТРАНСФОРМАЦИИ
ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока»
Роспотребнадзора (Иркутск)
Изучены культурально-морфологические свойства бруцелл в процессе L-трансформации на плотных питательных средах с нарастающей концентрацией антибиотика и представлена визуализация особенностей морфологии клеток различных пассажей при световой микроскопии с фазовоконтрастным устройством. Показаны, отличия культурально-морфологических свойств L- от. S-форм. бруцелл. Ключевые слова: S- и L-формы бруцелл
CULTURAL-MORPHOLOGiCAL PROPERTiES OF BRUCELLA AT THE STAGES OF L-TRANSFORMATiON
L.M. Mikhailov, A.I. Kalinovskiy, N.L. Barannikova
Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East, Irkutsk
Cultural-morphological properties of Brucella are studied, during L-transformation on solid, nutrient media with increasing antibiotic concentration and visualization of morphology features of cells with various passages is presented, by light phase-contrast microscopy. Differences of cultural-morphological properties of Brucella L- and S-forms are shown.
Key words: Brucella S- and L-forms
концентрации бициллина-3 от 10 до 13000 ЕД/мл питательной среды. Мазки готовили из культур L-трансформантов бруцелл на различных стадиях L-трансформации и просматривали с использованием светового микроскопа с фазово-контрастным устройством «Liaka» при 400 кратном увеличении.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Особенностью процесса L-трансформации является замедление роста культур бруцелл на питательных средах (8 — 18 суток) по сравнению с исходными культурами (2 — 3 суток). Рост бруцелл, особенно на первых пассажах, скудный, в виде голубовато-сероватого в падающем и прозрачного янтарно-желтого цвета проходящем свете налета, плохо снимающегося петлей. Отдельные колонии различаются по размеру от мелких (меньше 0,5 мм) до крупных (5 мм в диаметре), отмечаются колонии с более темным центром и светлыми краями (в виде яичницы). При получении L-трансформантов из 18 штаммов наиболее глубокий процесс перехода в L-форму зарегистрирован у бруцелл наиболее эпидемиологически значимых видов Melitensis и Abortus, где максимальное число пассажей достигало 14, тогда как у остальных оно не превышало восьми. При этом рост на питательной среде на основе перевара сердечной мышцы наблюдали также только у представителей бруцелл видов Melitensis — 5 штаммов и Abortus — 1 штамм.
Рост бруцелл других видов не наблюдался дальше пятого пассажа. L-субкультуры бруцелл образуют мелкие колонии, округлой формы с
ВВЕДЕНИЕ
Способность бактерий к существованию в условиях частичного или полного отсутствия клеточной стенки — широко распространенное явление [2]. В настоящее время процесс L-трансформации бактерий рассматривается как один из приспособительных механизмов, способствующих их сохранению [3]. Отличительной особенностью бруцелл в L-форме является выраженный полиморфизм клеток, индуцированных in vitro или in vivo, одни авторы выделяют 15 [4], другие — 7 фенотипов L-форм бруцелл [8]. До настоящего времени при идентификации бруцелл в L-форме большое значение придается их культурально-морфологическим свойствам [2, 6]. По данным литературы, наряду с описанием морфологических признаков бруцелл в L-форме недостаточно материала по визуализации этих признаков, поэтому получение новых данных актуально.
Цель работы — культурально-морфологическая характеристика бруцелл на этапах L-трансформации на искусственных питательных средах.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали 18 штаммов бруцелл: Brucella melitensis 342 (S, R), 201, 203 (S, R); B. abortus И-206, 82 (вакцинный), 292 (S, R); B. suis И-103 (S, R), Thomsen (S, R); B rangiferi 283 (S, R); B. ovis И-65; B. canis 6/66 (S, R). L-трансформацию проводили на четырех питательных средах для культивирования L-форм бруцелл, приготовленных на основах: эритрит агара, печеночного настоя, переваров селезенки и сердечной мышцы крупного рогатого скота, с постепенным увеличением
ровным краем, вросшие в агар, в проходящем свете янтарно-желтые, голубоватые в падающем свете или в виде скудного, нежного голубоватосерого налета. При снятии петлей колонии трудно снимаются, имеют крошковатую консистенцию. Бруцеллы в L-форме грамотрицательны, спор и капсул не образуют.
Отличительной особенностью бруцелл в L-форме является выраженный полиморфизм клеток, при этом морфология клеток всех 18 штаммов бруцелл меняется в зависимости от концентрации трансформирующего агента в питательных средах. При фазовоконтрастной микроскопии бруцеллы, выросшие на питательных средах с концентрацией бициллина-3, составляющей 10 ЕД/мл (1-й пассаж), имели обычный вид — мелкие кокко-бактерии, не отличающиеся от исходных форм (рис. 1). При концентрации антибиотика — 50 ЕД/мл (2-й пассаж) в мазках, наряду с обычными клетками, наблюдалось слипание клеток с формированием глыбок и появлением резко увеличенных, «раздутых» клеток неправильной формы (рис. 2). В мазках третьего пассажа (концентрация бициллина-3 — 500 ЕД/мл) наблюдали небольшое содержание клеток с обычной морфологией, при этом основное поле зрения занимали клетки неправильной формы в виде прямых и изогнутых палочек различной величины (рис. 3). При концентрации бициллина-3 1000 ЕД/мл (4-й пассаж) в питательной среде в дополнение к имеющимся формам появились клетки округлой формы в виде цепочек (рис. 4). Бруцеллы с пятого по восьмой пассаж представлены преобладающим наличием сферических и палочковидных клеток, в которых оптически более плотные участки выглядели в виде полуколец или колец с просветлением в центре (рис. 5, 6, 7). L-трансформанты 9 — 14-го пассажей характеризовались преобладанием клеток протопластического типа: овальные или кругло-овальные, оптически плотные или с просветлением в центре (рис. 8). В отдельных случаях в мазках наблюдались клетки нитевидной (рис. 9) и веретенообразной формы (рис. 10).
Рис. 1. Исходная форма бруцелл.
Рис. 2. Второй пассаж (бициллин-3, 50 ЕД/мл питательной среды).
Рис. 3. Третий пассаж (бициллин-3, 500 ЕД/мл питательной среды).
Рис. 4. B. abortus И-206 (бициллин-3, 1000 ЕД/мл питательной среды).
Рис. 5. B. abortus И-206 (бициллин-3, 2000 ЕД/мл пита- Рис. 8. B. abortus И-206 (бициллин-3, 8000-14000 ЕД/мл тельной среды). питательной среды, формирование протопластов).
Рис. 6. B. abortus И-206 (бициллин-3, 3000 ЕД/мл питательной среды).
Рис. 7. B. abortus И-206 (бициллин-3, 5000-7000 ЕД/мл питательной среды).
Рис. 9. Нитевидные формы L-трансформантов.
Рис. 10. Веретенообразные формы L-трансформантов.
Полученные данные свидетельствуют о том, что культурально-морфологические свойства L-трансформантов отличаются от S-форм бруцелл увеличением времени роста на плотных питательных средах и формированием более мелких колоний иногда с плотным центром, что согласуется с результатами других авторов [1, 8]. С использованием фазовоконтрастного микроскопирования представлены и визуализированы особенности морфологии бруцелл при L-трансформации с различными концентрациями антибиотика.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гордиенко Л.Н. Фенотипическая изменчивость бруцелл в процессе L-трансформации in vitro // Вест. Ллгайского гос. аграрного униветси-тета. - 2011. - № 8. - С. 71-73.
2. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней / Практическое руководство; под ред. Г.Г. Онищенко, В.В. Кутырева. - М.: Медицина, Шико. - 2009. - 470 с.
Сведения об авторах
3. Механизмы выживания бактерий / О.В. Бухарин, А.Л. Гинцбург, Н.М. Романова, Г.И. Эль-Регистан — М.: Медицина, 2005. — 367 с.
4. Морфо- и сероварианты L-форм B. abortus начального этапа трансформации и их биологические свойства / В.Г. Ощепков, Л.Н. Гордиенко, А.Ю. Шварева, Д.В. Булдыгин // Акт. пробл. бруцеллеза и туберкулеза животных: сб. науч. тр. СО ВНИИБТЖ РАСХН. - Омск, 2000. - С. 257-270.
5. Прозоровский С.В., Кац Л.Н., Каган Г.Я. L-формы бактерий. — М.: Медицина, 1981. — 239 с.
6. Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза людей. Профилактика инфекционных болезней. Инфекции общие для человека и животных: Методические указания МУ, 3.1.7.1189-03. — М., 2003. - 38 с.
7. Толмачева Т.А., Кац Л.Н., Грекова Н.А. Структура клетки и патогенность бруцелл на разных этапах L-трансформации // Ж. микробиол. — 1979. - № 8. - С. 63-67.
8. Триленко П.А. Бруцеллез сельскохозяйственных животных. - Л.: Колос, 1976. - 279 с.
Михайлов Леонид Михайлович - кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник отдела зоонозных инфекций ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора (6664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера, 78; тел.: 8 (3952) 22-01-35; e-mail: [email protected])
Калиновский Александр Иннокентьевич - доктор медицинских наук, заведующий отделом зоонозных инфекций, старший научный сотрудник ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора
Баранникова Наталья Леонидовна - врач-бактериолог отдела зоонозных инфекций ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора
