CC BY
70
Вестник Томского государственного университета. Биология
2009 № 3 (7)
БИОТЕХНОЛОГИЯ
УДК 581.14
В.Ю. Дорофеев, Р.А. Карначук, С.В. Пулькина,
Е.В. Комлева, В.Б. Дубина, Ю.В. Медведева
Биологический институт Томского государственного университета
(г. Томск)
КУЛЬТУРА КНЯЖИКА СИБИРСКОГО (ATRAGENE SPECIOSA WEINM.) IN VITRO: ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ И ОБРАЗОВАНИЕ ТРИТЕРПЕНОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ И ФЛАВОНОИДОВ
Работа поддержана грантом ФЦНТП (Государственный контракт № 02.512.11.2220 от 4 июля 2008 г.).
Аннотация. Получена клеточная культура Atragene speciosa Weinm. in vitro. В культуре каллусных клеток in vitro показано образование физиологически активных веществ, в том числе флавоноидов и сапонинов. Впервые проведены цитогенетические исследования по изучению генетической изменчивости клеток в каллусе княжика сибирского: обнаружена генетическая нестабильность каллусной культуры и выделено несколько цитотипов по числу и структуре хромосом. Для клеток меристе-матического типа каллусной культуры показана изменчивость в числе хромосом.
Ключевые слова: Atragene speciosa Weinm.; клеточная культура; in vitro; три-терпеновые гликозиды; сапонины; флавоноиды; полиплоидия; анеуплоидия; структурные перестройки хромосом.
В народной медицине Востока издавна для лечения широкого спектра заболеваний используется княжик сибирский (Atragene speciosa Weinm.) [1]. Современные исследования показали ноотропное, адаптогенное и антиоксидант-ное действие этого растения [2]. Основными группами веществ княжика сибирского, отвечающими за фармакологическую активность, являются тритер-пеновые гликозиды, флавоноиды и производные фенилэтанола [3, 4]. Как показали исследования препаратов с ноотропным действием, полученных из растений, они по своей активности превосходят такой препарат ноотропного ряда, как пирацетам. При этом практически отсутствуют побочные эффекты, а стоимость растительных препаратов такого класса намного ниже синтетических.
Однако препятствием для разработки лекарственных растительных препаратов являются ограниченность или отсутствие запасов сырья, связанные с особенностями биологии вида. Atragene speciosa Weinm. - лиана, и в силу такой специфики затруднена ее интродукция. Остается возможность введения княжика сибирского в культуру клеток in vitro, что позволяет получать
экологически чистое сырье круглогодично, независимо от климатических условий. В настоящее время для некоторых видов созданы клеточные культуры in vitro, способные к синтезу вторичных соединений, продуцентами которых являются целые растения [5, 6].
Объект и методики исследования
Объектом исследования явилась каллусная культура клеток княжика сибирского, полученная от разных эксплантов интактных растений, растущих в окрестностях Степановки (г. Томск). Получение и культивирование каллуса проводили на оптимизированных питательных средах Мурасиге-Скуга с добавлением гормонов 2,4-Д (2,4 дихлорфеноксиуксусная кислота), НУК (а-нафтилуксусная кислота) и БАП (6-бензиламинопурин) в разной концентрации. Выращивание проводили в темноте с продолжительностью субкультивирования 30-40 сут.
В культурах каллуса с 5-го по 10-й пассаж и 70-го пассажа анализировали накопление тритерпеновых гликозидов (сапонины) и флавоноидов спектрофотометрическим методом. Метод определения количественного содержания флавоноидов основан на процессе комплексообразования флавоноидов с хлоридом алюминия (III). Использовали 200-300 мг сухой массы клеток каллуса. Экстракцию проводили трижды 50% этиловым спиртом на водяной бане в течение 30 мин. Далее проводили спектрофотометрическое измерение суммы флавоноидов [7]. Для количественного определения сапонинов использовали 1 г сухой массы каллусных клеток. Экстрагировали трижды горячим ацетоном. Измеряли оптическую плотность водного раствора осажденных аммиаком сапонинов на спектрофотометре СФ-46.
Каллусная культура 10-го пассажа княжика сибирского in vitro была проанализирована на цитогенетическую стабильность. Определение митотической активности каллуса проводили с помощью темпоральной фиксации по одному образцу каллусной культуры с 9 до 18 ч в спирт-уксусной смеси в течение 6 ч. Для цитогенетического анализа 31 образец каллусной культуры 10-го пассажа фиксировали в спирт-уксусной смеси (3:1) в течение 6 ч с предварительной обработкой в 0,1% р-ре колхицина в течение 3 ч. Материал хранился в 80% спирте при температуре +4°С. Окрашивание проводили ацетогематоксилином по Смирнову [8]. Анализ стадий клеточного цикла и числа хромосом проведен на временных давленых препаратах. В исследовании использованы клетки меристематического типа [9].
Результаты и обсуждение
В лабораторных экспериментах было получено от разных эксплантов несколько линий клеточной культуры Atragene speciosa Weinm. При длительном культивировании в клеточной культуре княжика сибирского на твердой среде образуются физиологически активные вещества, в том числе тритерпе-новые гликозиды и флавоноиды (табл. 1). Их уровень растет, достигая 80% содержания сапонинов по отношению к листьям целого растения. Содержание флавоноидов в клетках 70-го пассажа составило около 40% также в срав-
нении с листьями интактного растения. Возможно, изменение уровня сапонинов и флавоноидов является результатом генетической изменчивости в культуре in vitro, в основе которой лежит изменение плоидности [10].
В литературе имеются сведения о кариотипе дикорастущего княжика сибирского [11-13]. В изученных природных популяциях Восточной и Западной Сибири, Тувы и Северо-Востока европейской части СССР, по литературным данным, вид представлен растениями с диплоидным числом хромосом 2n = 16. В кариотипе выявлены метацентрические и субметацентрические хромосомы и одна пара акроцентрических хромосом. Для растений популяции в окрестности г. Томска в кариотипе отмечены две пары спутничных хромосом (субакроцентрическая и акроцентрическая пары) [13].
Авторами впервые проведены цитогенетические исследования по изучению генетической изменчивости клеток каллуса княжика сибирского. Известно, что при введении в клеточную культуру растительные клетки теряют генетическую стабильность и наблюдается формирование высокого уровня полиплоидии и анеу-плоидии [14]. Одним из важных факторов, нарушающих генетическую стабильность в культуре клеток, являются гормоны питательной среды [15]. Значительную роль играет видовая специфика [16]. Некоторые виды сохраняют стабильность морфологии хромосом при длительном культивировании каллуса [17].
Для клеток меристематического типа каллусной культуры показана изменчивость в числе хромосом, которая проявилась в наличии клеток с диплоидным числом хромосом (2n = 16), полиплоидией, анеуплоидией и структурными перестройками хромосом (табл. 2). Клетки округлые с одним крупным ядром, занимающим 1/3 площади клетки. Показано, что максимум митотической активности приходился на 12-14 ч и составил в среднем около 4%.
В клетках 10-го пассажа преобладающими оказались тетраплоидные клетки (29,6%), частота клеток с исходным диплоидным числом хромосом и три-плоидией составила 22,9 и 21,9% соответственно. В небольшом проценте клеток отмечаются пента-, гекса-, гепта-, окта- и новемхромосомные числа (от 1,0 до 4,4%). В этой группе наибольший процент составили клетки с гек-саплоидным числом хромосом (табл. 2). Анеуплоидия обнаружена в 10,8% клеток, в основном встречается гипердитриплоидия. Клетки со структурными перестройками хромосом отмечены в 3,1%. Наблюдалось преобладание ги-пертетраплоидных клеток с ацентрическими фрагментами, а гипо- и гипер-диплоидия с дицентрическими хромосомами, гипертритетраплоидия с минихромосомами встречались очень редко (табл. 2).
В результате исследований установлено, что по числу хромосом в клетке можно выделить несколько типов каллусов:
- I тип - полиплоидные и диплоидные клетки (48,4%): 1-й цитотип -4х = 32; 2-й цитотип - 3х = 24; 3-й цитотип - 2n = 16;
- II тип - диплоидные, полиплоидные и анеуплоидные клетки (32,3%): 1-й цитотип - 4х = 32; А (анеуплоидия); 2-й цитотип - 3х = 24; А; 3-й цитотип -2n = 16; 3х = 24; А; 4-й цитотип - 2n = 16; 4х = 32; А; 5-й цитотип - 2n = 16;
- III тип - диплоидные, полиплоидные, анеуплоидные и анеуплоидные со структурными перестройками (19,3%).
Т а б л и ц а 1
Содержание биологически активных веществ в каллусной культуре Atragene speciosa Weinm.
№ пассажа Биологически активные вещества, %
Сапонины Флавоноиды
5 0,050 ± 0,002 Следы
6 0,060 ± 0,008 Следы
7 0,040 ± 0,005 0,040 ± 0,020
8 0,026 ± 0,005 0,070 ± 0,030
9 0,030 ± 0,004 0,090 ± 0,030
10 0,040 ± 0,004 0,070 ± 0,040
70 (20 сут) 0,100 ± 0,010 0,100 ± 0,050
70 (40 сут) 0,145 ± 0,016 0,178 ± 0,038
Примечание. Данные в таблице представлены в виде средней арифметической с ошибкой.
Т а б л и ц а 2
Числа хромосом и аберрации хромосом в каллусной культуре княжика сибирского 10-го пассажа
Число образцов каллусной культуры Число клеток Частота клеток с разным числом хромосом, %
2n 3х 4х 5х 6х 7х 8х 9х « и ч и о л с 4J н < Анеуплоидия и структурные аберрации
16 24 32 40 48 56 64 72 Ацентрический фрагмент Дицентрик а -м -исо я О s S я 1 хр
31 389 22,9 21,9 29,6 1,3 4,4 3,6 1,5 1,0 10,8 1,5 0,8 0,8
В III типе каллусных культур преобладали цитотипы 4х = 32; А; ацентрические фрагменты. Единично отмечались цитотипы 4х = 32; А; ацентрические фрагменты и дицентрические хромосомы, а также цитотипы 4х = 32; А; ацентрические фрагменты, дицентрические и мини-хромосомы.
Таким образом, цитогенетический анализ клеток каллусной культуры 10-го пассажа княжика сибирского показал, что разные цитогенетические аномалии генерируются в новый уровень плоидности и новые числа хромосом. Полиплоидия может являться значительным резервом изменчивости, которая реализуется в формировании стабильных каллусов разной плоидно-сти, что является одним из способов промышленного получения клеточной культуры и ее вторичных метаболитов.
Литература
1. Бокова В.С., Краснов Е.А. К фитохимическому и фармакологическому исследованию
княжика сибирского // Тезисы докладов межвузовской конференции «Изучение препаратов растительного и синтетического происхождения». Томск. 1978. Ч. 2. С. 14-16.
2. Шилова И.В., Краснов Е.А., Андреева Т.И. и др. Исследование химического состава над-
земных частей Atragene sibirica L. и ее культуры ткани // Материалы Всероссийского совещания. Томск: Изд-во ТГУ, 1998. С. 79-81.
3. Карначук Р.А., Клепикова Т.В., Шилова И.В. и др. Культура ткани Atragene sibirica L. -
продуцент биологически активных сапонинов // Материалы Международного совещания. Новосибирск, 1998. С. 29.
4. Карначук Р.А., Краснов Е.А., Дорофеев В.Ю., Шилова И.В. Клеточная культура княжика
сибирского - перспективный источник лекарственных средств // Материалы Международной научной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий». Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2001. С. 182-183.
5. ShoyamaY., Nishioka I., Hatano K. IV. Aconitum spp. (Monkshood) // Biotechnology in Agri-
culture and Forestry 15. Medicinal and Aromatic Plants III / Ed. by Y.P.S. Bajaj. With 208 Figures. Springer - Verlag Berlin Heidelberg, 1991. P. 68-73.
6. Schmauder H.-P., Doebel P. XIX Nigella spp.: in vitro culture, regeneration, and the forma-
tion of secondary metabolites // Biotechnology in Agriculture and Forestry 15. Medicinal and Aromatic Plants III / Ed. by Y.P.S. Bajaj. With 208 Figures. Springer - Verlag Berlin Heidelberg, 1991. P. 311-336.
7. МинаеваВ.Г. Лекарственные растения Западной Сибири. Новосибирск: Наука, 1992. 231 с.
8. Пухальский И.А и др. Практикум по цитологии и цитогенетике растений. М.: КолосС, 2007. 198 с.
9. Кунах В.А. Цитогенетическая разнокачественность штаммов листового и стеблевого
происхождения культуры тканей Haplopappus gracilis (Nutt). Gray // Цитология и генетика. 1971. Т. V, № 3. С. 241-249.
10. Кунах В.А., Можилевская Л.П., Адонин В.И., Губарь С.И. Продуктивность и генетическая структура клеточных популяций женьшеня Panax ginseng С.А. Mey в культуре in vitro // Биотехнология. 2003. № 3. С. 25-35.
11. Ростовцева Т.С. Числа хромосом некоторых видов семейства Ranunculaceae Juss. // Ботанический журнал. 1976. Т. 61. С. 1133-1137.
12. Беляев В.А., Сипливинский В.Н. Хромосомные числа некоторых видов Байкальской флоры // Ботанический журнал. 1977. Т. 62, № 8. С. 1132-1142.
13. Шрагер Л.Н., Малахова Л.А. Анализ кариотипов двух видов семейства Ranunculaceae // Ботанический журнал. 1979. Т. 64, №5. С. 731-734.
14. Bayliss M. V., Gould A.R. Chromosomal variability in plant tissue culture // International Review Cytology Suppl. 1980. Vol. 11A. P. 113-144.
15. Nagl W. Evidence of DNA amplification in the orchid Cymbidium in vitro // Cytobios. 1972. Vol. 5. P. 145-154.
16. Roy S.C. Chromosomal Variations in the Callus Tissues of Allium tuberosum and A. cepa Brief Report // Protoplasma. 1980. Vol. 102. P. 171-176.
17. Sengupta J., Jha S., Sen S. Karyotype Stability in Long-Term Callus Derived Plants of Crepis tectorum L. // Biologia Plantarum (Praha). 1988. Vol. 30. P. 247-251.
Dorofeev Vyacheslav Yu., Karnachuk Raisa A., Pulkina Svetlana V.,
Komleva Ekaterina V., Dubina Valentina B., Medvedeva Julia V.
Biological Institute of Tomsk State University, Tomsk, Russia
ATRAGENESPECIOSA WEINM. CULTURE IN VITRO:
THE CYTOGENETIC ANALYSIS AND FORMATION OF TRITERPENOID GLYCOSIDES AND FLAVONOIDS
Atragene speciosa Weinm. can be used as nootropic, adaptogenic, etc. remedy for treatment of some diseases. Biological features of this species do not allow its cultivation. Atragene speciosa cell culture in vitro has been received. Formation of physiologically active substances, including flavonoides and triterpenoid saponins was discovered in the cells callus culture in vitro. Genetic instability of callus culture and several cyto-types on chromosomes number and aberration structure are found.
Key words: Atragene speciosa Weinm.; cell culture; in vitro; triterpenoid glycosides (saponins); flavonoids; polyploides; aneuploides; chromosomes structure.
