CC BY
90
УДК 581.4:581.143:577.175.1.05
РЕГУЛЯЦИЯ РОСТА И ВТОРИЧНОГО МЕТАБОЛИЗМА КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ аАтвЖЕА (ЖИААПА У/ 28-ГОМОБРАССИНОЛИДОМ И СЕЛЕНОМ
©2013 И.Ф. Головацкая, Н.А. Володина
Национальный исследовательский Томский государственный университет, г. Томск
Поступила 02.06.2013
Определена степень изменчивости цитоморфологических характеристик и содержания терпеноидных сапонинов каллусной культуры клеток Бтшигеа ог%аас1спп. Показано, что низкие концентрации 28-гомобрассинолида и селената натрия поддерживают рост культуры, тогда как высокие - активируют вторичный метаболизм.
Ключевые слова: Баизяигеа о^аас1а\п, культура клеток, 28-гвмвбрассинвлид, селенат натрия, терпен видные сапонины.
Растения синтезируют широкий спектр вторичных метаболитов, которые могут выполнять важные функции в процессе адаптации растений к специфическим экологическим условиям или в ответ на действие биотических и абиотических стрессоров, различных элиситоров или сигнальных молекул [1—4]. Некоторые из этих растительных метаболитов оказывают благоприятное действие на жизнедеятельность человека и используются в фармакологической, пищевой, косметической и сельскохозяйственной промышленности. Из-за их уникальных и часто сложных химических структур, синтез этих природных веществ часто невыполним или экономически не выгоден. Поэтому много вторичных метаболитов все еще извлекают из растений, изъятых из их естественных местообитаний. В связи с решением проблемы сохранения биоразнообразия, появляется необходимость в сокращении использования ресурсов лекарственных растений из естественных популяций, поскольку масштабные заготовки с полным извлечением растений сокращают ареалы распространения видов, а также антропогенные воздействия приводят к деструкции естественной среды существования видов, увеличивая список «краснокнижных» видов.
Поиск путей компенсации дефицита лекарственных растений привел к разработке принципиально новых биотехнологических методов получения отдельных биологически активных соединений растительного происхождения на основе использования культуры изолированных тканей и клеток, которые позволяют круглогодично выращивать клеточную культуру на искусственных питательных средах в асептических контролируемых условиях.
Известно, что рост и развитие растений находится под контролем эндогенных систем регуляции, среди которых можно выделить гормональную и трофическую системы. Важными компонентами этих систем, участвующих в регуляции роста,
Головацкая Ирина Февктистввна, д.б.н., проф., e-mail: golovatskaya.irina(a!mail.ru; Володина Наталья Александровна, магистр
служат брассиностероиды и селен [5-11]. Брасси-ностероиды (БР) характеризуются плейотропным действием. Они играют роль в растяжении клеток, прорастании семян, эпинастии листьев, ризогенезе, цветении, созревании плодов, старении, дифференцировании ксилемы, фотоморфогенезе, изменении гормонального баланса, индукции биосинтеза этилена, активации амилазы, нитрат-редуктазы, протонного насоса, и регулировании экспрессии генов. Обработка БР увеличивает устойчивость растений к различным абиотическим и биотическим стрессам за счет повышения уровня фенольных смол и терпеноидов, увеличения активности ферментов пероксидазы и полифенолоксидазы [5-8].
Большое внимание уделяется проблеме обогащения селеном различных продуктов фармацевтической и пищевой промышленности [9], поскольку стало известно об антиоксидантных функциях се-лен-содержащих соединений [10]. Селен входит в состав важных селенопротеинов человека (глутати-он-пероксидаз, тиоредоксинредуктаз и других), предупреждая развитие более четырех десятков заболеваний у человека и животных [10]. Селен может регулировать вторичный метаболизм растений
[11]. Имеются единичные сведения о влиянии уровня селена на физиологическую активность БР
[12]. Недостаточно изучена регуляция вторичного метаболизма клеток растений in vitro. В связи с этим целью наших исследований было выявление зависимости ростовых процессов и содержания терпеноидных сапонинов в каллусной культуре клеток Sans sure a orgaadayi от уровня 28-гомобрассинолида и селената натрия в питательной среде.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Объектом исследования служила клеточная культура Saussurea orgaadayi (V.Kliaii. and Krasnob.). Горькуша оргаадай - многолетнее растение сем. Asteraceae (Сложноцветные), узколокальный эндемик небольшой территории, прилегающей к стыку Русского Алтая, Юго-Западной Тывы и территорий Монголии, редкий, лекарственный асоциальный вид, обитающий в субальпийском поясе высокогорий. В родственных видах S. salicifolia L.,
1591
S. controversa DC. и др. обнаруживают сесквитер-пены, алкалоиды, эфирное масло, флавоноиды, фе-нолкарбоновые кислоты, кумарины, тритерпеновые сапонины, стероидные соединения, инулин и органические кислоты. Широкий спектр вторичных метаболитов обеспечивает важное фармакологическое значение видов рода Saussurea. Тотипотент-ность растительных клеток позволяет прогнозировать синтез каллусной культурой клеток вторичных метаболитов, характерных для интактных растений данного рода.
Исходная клеточная культура получена из семядолей стерильно выращенных проростков S. orgaadayi на среде Мурасиге-Скуга (MC), содержащей 0,8 мг/л 2,4-Д и 0,5 мг/л 6-БАП, на кафедре физиологии растений и биотехнологии под руководством проф. P.A. Карначук, ею было начато исследование регуляции вторичного метаболизма [13]. Семена растений любезно предоставила проф. H.A. Некратова (НИИ ББ ТГУ, Томск).
В процессе эксперимента в асептических условиях в темноте наращивали исходную каллусную массу, затем разделяли ее на фрагменты, которые взвешивали и пересаживали на новую питательную среду. Последующее субкультивирование клеток проводили на агаризованной среде MC, содержащей 28-гомобрассинолид (ГБЛ) или селенат натрия (Se; "Sigma", США), или их комбинации (опыт) и без них (контроль). ГБЛ - (22R, 23R, 24S)-2a, За, 22, 23-тетрагидрокси-24-этило-В-гомо-7-окса-5а-холестан-6-он - был выбран как природный С 29-брассиностероид с широким спектром биологической активности, обнаруженный in vivo в Brassica campestris var. pekinensis L. [14].
Прирост каллусной культуры клеток определяли по изменению массы сырого и сухого вещества, рассчитывали ростовой индекс. Цитоморфологиче-ские исследования каллуса включали оценку размеров и формы клеток, частоту их встречаемости. Выделили 3 типа клеток по форме округлые, эллипсоидные и вытянутые, а также по размерам мелкие (до 30 мкм), средние (от 30 до 60 мкм) и крупные (от 60 до 200 мкм). Определили средний объем клеток каждого размера. Содержание терпе-ноидных сапонинов определяли спектрофотомет-рически по методикам [15] в расчете на сухую массу культуры клеток.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Всестороннее изучение биохимического состава культуры растительных клеток, выявление особенностей вторичного метаболизма, поиск методов повышения продуктивности является актуальной задачей физиологии и биотехнологии растений и может служить основой для создания промышленной технологии получения вторичных метаболитов в клеточной культуре in vitro.
Вторичные метаболиты упоминаются часто как вещества, не имеющие основополагающей роли в жизненно важных процессах растений, но опреде-
ляющие взаимодействие растений с окружающей средой, их адаптацию и защиту. Однако, по нашему мнению, они могут регулировать рост и развитие растений, поскольку синтезируются из первичных метаболитов (углеводов, липидов и аминокислот), отвлекая последние от основных клеточных процессов. Кроме того, они имеют свойства, изменяющие состояние клетки.
Исходя из известных функций БР и селена в процессах растяжения и деления клеток, вторичном метаболизме [12, 13] и терапевтической значимости для человека, их использовали в качестве регуляторов при культивировании растительных клеток. В ходе эксперимента изучали динамику ростовых процессов каллусной культуры клеток в течение 30 сут, а также оценивали дозы-эффекты индивидуальных факторов (ГБЛ и 8е) и их комбинаций на рост клеток в течение 20-дневного культивирования.
Кривая роста по сырой массе у контрольной каллусной культуры имела типичный Б-образный вид кривой: лаг-период длительностью 10 сут, экспоненциальную фазу - 15 сут, затем рост замедлялся и с 25-х сут начиналась стационарная фаза (рис. 1). На 30-е сут субкультивирования ростовой индекс по массе сырого вещества культуры составил 4,28±0,23. Добавление 10"у М селената натрия в питательную среду активировало ростовой индекс на 10 сут с последующим сохранением темпов роста на уровне контроля до 20 сут. Дальнейший рост культуры клеток замедлялся. Это могло быть обусловлено активным накоплением селена в клетках и замещением серы в белках, снижающем активность последних. 10~п М ГБЛ замедлял рост культуры клеток по сравнению с контролем, при этом торможение роста в большей степени происходило за счет снижения оводненно-сти (рис. 1а), чем накопления сухой массы (рис. 16). Совместное действие ГБЛ и селена частично снимало ингибирующее действие гормона на рост клеточной массы.
Цитологические исследования показали, что каллусная ткань на 20-е сут культивирования состояла из меристемных и паренхимных клеток. Меристемные клетки имели небольшие размеры (<60 мкм), округлую форму, хорошо заметное ядро (рис. 2, мелкие, средние). Характерным признаком клеток паренхимного типа была их существенная удлиненность и большие размеры (>60 мкм) (рис. 2, крупные). При действии низкой концентрации селенат-иона (10~ь М), высокой концентрации ГБЛ (10"7 М) и их сочетании увеличивалась доля мелких и средних клеток, что могло свидетельствовать или об ускорении клеточного деления в каллусной культуре, или торможении растяжения клеток. Причем совместное действие факторов выражалось в суммировании эффектов. В то же время высокая концентрация селена (10" М) и более низкая ГБЛ (10"9 М) увеличивали долю крупных клеток за счет уменьшения доли мелких и средних клеток.
1592
4.5
3.5
2.5
1.5 1
0.5
28-гомобрассинолид
5 10 15 20 25 30 Время культивирования, сутки
5 10 15 20 25 Время культивирования, сутки
0,035
0,03
0,025
0,02
К 0,015
0,01
° 0,005
Рис. 1. Динамика ростовых индексов каллусной культуры клеток по сырой (а) и сухой (б) массе в зависимости 10"9 М селената натрия, 10"11 М ГБЛ и их смеси в питательной среде
Культура клеток в контроле характеризовалась максимальной долей (60%) круглых клеток, минимальной долей вытянутых клеток (2%). Дополнительно введенные в питательную среду соединения изменяли форму и размеры клеток культуры. Увеличение концентрации селенат-иона в среде повышало долю вытянутых клеток по сравнению с контролем. При увеличении содержания ГБЛ увеличивалась доля круглых клеток, но уменьшалась доля эллипсоидных. Введение селена в присутствии ГБЛ увеличивало долю круглых клеток.
Анализ действия широкого спектра концентраций ГБЛ и селенат-иона показал, что с увеличением их уровня увеличивался негативный эффект на прирост сырой биомассы клеточной культуры. Максимальный ингибирующий эффект наблюдали при концентрациях 10-7-10-5 М (рис. 3). При совместном действии на рост ГБЛ частично снимал ингибирующее действие селенат-иона.
Изучение биохимического состава каллусной культуры 5". orgaadayi показало, что на 20-е сут культивирования в ней накапливались терпеноид-ные сапонины, содержание которых составило 0,4% от сухой массы. Добавление экзогенных соединений фитогормона ГБЛ и микроэлемента селената натрия в питательную среду одновременно с торможением роста каллуса увеличивало содержание исследуемой группы веществ относительно контроля (рис. 3). Повышение уровня сапонинов происходило 2-2,2-кратно при введении 10-7 и 10-5 М растворов ГБЛ и селенат-иона.
Пересчет содержания сапонинов на общую биомассу культуры клеток с учетом ее уменьшения на 20-25% свидетельствовал об увеличении выхода вторичного метаболита на 53-76% соответственно при действии 10~7М селенат-иона и ГБЛ. Более высокая концентрация 10~5 М селенат-иона и ГБЛ снижала общий выход сапонинов, поскольку происходило существенное снижение биомассы культуры клеток.
Эффект селенат-ионов низкой концентрации оказывал негативное действие, как на рост, так и на
накопление сапонинов. При совместном действии гормона и микроэлемента низкой концентрации снижался ингибирующий эффект ГБЛ на рост с сохранением темпов синтеза сапонинов на уровне контроля.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что селен влияет на активность ГБЛ в регуляции ростовых процессов, вероятно, изменяя оксидант-ный статус клетки. В то же время ГБЛ мог изменять поток селенат-ионов, поскольку известно, что одним из механизмов действия БР на рост клеток АгаЬ1с1ор.\1.\ ¡ИаНапа в суспензионной культуре служит гиперполяризация плазматической мембраны, поддерживаемая деятельностью протонных насосов, анионных транспортеров и калиевых каналов. Показано, что ГБЛ и его прямой предшественник 28-гомокастастерон (ГКС) имели общие и специфические функции. Так, они однозначно замедляли потоки анионов, в то же время ГБЛ увеличивал выходящие из клетки потоки К+, а ГКС замедлял их [16]. А поскольку селен транспортируется в виде селенат-анионов, то влияние ГБЛ на его поступление в клетку очень вероятно.
В проявление эффекта ГБЛ могло иметь значение и его взаимодействие с другими гормонами питательной среды (ауксинами и цитокининами). Для оптимального действия БР требуется определенное соотношение гормонов, поэтому с повышением уровня одного из гормонов необходимо повышение другого. Это предположение подтверждается данными, полученными другими авторами [17]. Стимулирующий эффект более активного БР брасси-нолида (БЛ) на рост клеток Опозта ратсгйаШт в присутствии ИУК происходил при более низкой концентрации (10 пг/л), тогда как повышение уровня вторичного метаболита - шиконина - при более высокой концентрации (105-107 пг/л), поскольку активировались ферменты его синтеза. Кроме того, рост клеток уменьшался с увеличивающейся концентрацией Б Л при любой концентрации БАП в среде.
1593
й- 3
ю
100% 80% 60% 40% 20% 0%
I мелкие □ средние □ крупные
Se
Гбл
Логарифмю концентраций вещества, М
Гбл+ Se
Рис. 2. Соотношение размеров клеток в каллусной культуре S. orgaadayi в зависимости от содержания селената натрия, ГБЛ и их смеси в питательной среде (п=150) на 20-е сут
и 2
и ы
3 о
§ fr
« «
120 -I 100 -
80 -60 -
40 -
20 -
ri~|
¿1
ril
Se
ril
ill
Гбл
Гбл+ Se
Логарифмю концентрации вещества, М
250 200 150 100 50 0
I
Г±1
rii
* *
П П П
Л.
а
«/■> т о\
Se Гбл
Логарифмю концентрации вещества, М
*
1.1
со т
Гбл+ Se
Рис. 3. Зависимость ростового индекса по сырой массе и содержания сапонинов в каллусе на 20-е сут от уровня селенат-иона (8е), ГБЛ и их смеси в питательной среде
Регуляция ростовых процессов культуры клеток S. orgaadayi осуществлялся как со стороны ауксинов, цитокининов и ГБЛ, так и со стороны селенат-иона. Кроме того, не исключено, что сами сапонины оказывали регуляторную роль в клетке, изменяя проницаемость растительных клеток, что могло быть связано с их поверхностной активностью, или проявлялась дозовая зависимость ростовых процессов, когда низкие концентрации сапонинов стимулировали, а большие, наоборот, ингибировали их.
Сопоставление ростовых характеристик и биохимических параметров каллусной культуры клеток показало, что более раннее завершение клеточного роста в присутствии ГБЛ приводило к актива-
ции вторичного метаболизма. Учитывая экономический эффект (мг биомассы/на 1 г сахарозы) можно рекомендовать введение 10"3 М ГБЛ в питательную среду для увеличения биомассы культуры, тогда как 10"7 М растворы ГБЛ или селената натрия - для повышения уровня вторичного метаболизма без существенной потери биомассы.
Таким образом, в результате наших исследований показана фенотипическая изменчивость клеток каллусной культуры в зависимости от уровня ГБЛ и селена. Полученные результаты свидетельствуют о взаимодействии селенат-ионов и ГБЛ в регуляции ростовых и метаболических процессов. В проявление эффекта ГБЛ могло иметь значение и его соот-
1594
ношение с другими гормонами питательной среды. Исследованные регуляторы можно использовать для увеличения выхода биологически активных веществ клеточной культуры, а также для обогащения фармакологически значимыми веществами. Следует расширить спектр исследуемых брассино-стероидов в сочетании с изменением комбинации других гормонов питательной среды.
Исследования поддержаны Госзаданием Ми-нобрнауки России ВУЗам (№01201256295).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Запрометое М.Н. Вторичный метаболизм в культурах клеток и тканей растений // Культура тканей растений. М.: Наука, 1981. С. 37-51.
2. Бутенко Р.Г. Клеточные технологии для получения экономически важных веществ растительного происхождения // Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука, 1986. С. 3-20.
3. Носов А.М. Регуляция синтеза вторичных соединений в культуре клеток растений // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М: Наука, 1991. С. 518.
4. Ramakrishna A., Ravishankar G.A. Influence of abiotic stress signals on secondary metabolites in plants // Plant Signal Behav. 2011. V. 6 (11). P. 1720-1731.
5. Khripach V., Zhabinskii V., De Groot A. Twenty years of brassinosteroids: steroidal plant hormones warrant better crops for the XXI century // Ann. Bot. 2000. V. 86. P. 441447.
6. Карначук P.А., Головацкая П.Ф., Ефимова ALB., Хргтач B.A. Действие эпибрассинолида на морфогенез и гормональный баланс проростков арабидопсиса на зеленом свету // Физиология растений. 2002. Т. 49. № 4. С. 591595 '
7. Gomes М.М.А. Physiological effects related to brassinosteroids application in plants // Brassinosteroids: a class of plant hormone / Eds S. Hayat and A. Ahmad. Springer. 2011. P. 193-242. DOI 10.1007/978-94-007-0189-2_5.
8. Golovatsliaya I.P. Brassinosteroids and light-regulatory factors of growth and development of plants // Brassinostero-
ids: a class of plant hormone / Eds S. Hayat and A. Ahmad. Springer. 2011. P. 119-143. DOI 10.1007/978-94-007-0189-2_5.
9. Боловацкая П.Ф., Карначук P.A., Кулагина ЮМ., Павлова ДБ., Лаптев НИ. Способ обогащения селеном овощей и злаков // Патент России №2451442. М., 2012. Бюл. №15.
10. Блинохватов А.Ф., Денисова Б.В., Ильин Д.Ю. и др. Селен в биосфере. Пенза: РИО ПГСХА, 2001. 324 с.
11. Golovatsliaya I.F., Pavlova D.G., Kulagina JuAL, Kania-chuk R.A., Khripach VA. The physiological action of brassinosteroids depends on concentration of selenium in the medium // 20th Intern. Conf. on Plant Growth Substances IPGSA (28 June - 2 July 2010, Tarragona, Spain). PS05-38. P. 88-89.
12. Golovatsliaya I.F., Krachaleva А. К The role of different forms of selenium in regulating morphogenesis and content of biologically active substances of plants Lactuca sativa L. // Vestnik TGPU. 2011. V. 8(110). P. 85-88.
13. Карначук P.А., Дорофеев В.Ю., Бвоздева Б.С., Боловацкая II.Ф., Чурин А.А., Суслов H.II, Медведева Ю.В. Влияние физиологически активных соединений на рост и уровень тритерпеновых сапонинов и флавоноидов клеточной культуры Atragene speciosa Weinm. // Вестник Томского гос. ун-та. Биология. 2008. № 3 (4). С. 48-54.
14. Bajguz А.А., Tretyn A. The chemical characteristic and distribution of brassinosteroids in plants // Phytochemistry. 2003. V. 62. P. 1027-1046.
15. Ладыгина Б.Я., Сафронич Л.Н., Отряшенкоеа В.Э. и др. Химический анализ лекарственных растений / Под ред. Н.И. Гринкевич, JI.H. Сафронич. М.: Высшая школа, 1983. 176 с.
16. Zhang Z.S., Ramirez J., Reboutier D., В vault M., Trouverie J., Pennantn A.M., Amiar Z., Biligui В., Galagovsliy L., Ro-na J.P. Brassinosteroids regulate plasma membrane anion channels in addition to proton pumps during expansion of Arabidopsis thaliana cells // Plant Cell Physiol. 2005. V. 46. P. 1494-1504.
17. Yang Y.H., Huang J., Ding J. Interaction between exogenous brassinolide, IAA and BAP in secondary metabolism of cultured Onosma paniculatum cells // Plant Growth Regul. 2003. V. 39(3). P. 253-261.
REGULATION OF GROWTH AND SECONDARY METABOLISM OF SAUSSUREA ORGAADAYI CELL CULTURE BY 28-HOMOBRASSINOLIDE AND SELENIUM
©2013 I.F. Golovatskaya, N.A. Volodina
National Research Tomsk State University, Tomsk
The degree of variability of the cytomorphological characteristics and terpenoid saponin substances contents of Saus-surea orgaadayi callus culture is determined. It is shown, that low concentration 28-homobrassinolide and sodium se-lenate support growth of culture whereas high - activate a secondary metabolism.
Key words: Saussurea orgaadayi, cell culture, 28-homobrassinolide, sodium selenate, terpenoid saponin.
Irina Golovatskaya, Doctor of Biology, professor, e-mail: golovatskaya.irina(a!mail.ru; Natalia Volodina, magister
1595
