CC BY
72Ветеринарный врач. 2022 . № 4 . С. 14-18 The veterinarian. 2022; (4): 14-18.
Научная статья
УДК 619:576.535:578.824.11
DOI 10.33632/1998-698Х_2022_5_14
Культивирование клеток: сравнительный анализ традиционных и инновационных технологий
Ольга Олеговна Карпова1, Ирина Николаевна Матвеева 2,
Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности, г/о Лосино-Петровский, Московской обл., vnitibp@mail.ru 1 okarpova@biotechno.ru 2biolog1967@mail.ru
Автор, ответственный за переписку: Ольга Олеговна Карпова, okarpova@biotechno.ru
Аннотация. В данной статье рассматриваются технологические процессы культивирования клеток, среди которых выделяют несколько типов культивирования: периодический, полупериодический, непрерывный (перфузионный). Тип выбранного процесса зависит от многих факторов, включая оснащенность производства, эксплуатационные расходы, размер биореактора и другие. В данной статье акцент делается на описании процесса непрерывного культивирования.
Ключевые слова: культивирование клеток, перфузионный процесс, непрерывное культивирование, перфузионная фильтрация, биореактор.
Cell cultivation: a comparative analysis of traditional and innovative technologies
Olga О Karpova1, Irina N Matveeva2
All-Russian research and technological institute of biological industry, Losino-Petrovsky city district, Moscow obl., vnitibp@mail.ru 1 okarpova@biotechno.ru 2biolog1967@mail.ru
Corresponding author: Olga Olegovna Karpova, okarpova@biotechno.ru
Abstract. This article discusses the technological processes of cell cultivation, among which there are several types of cultivation: periodic, semi-periodic, continuous (perfusion). The type of process chosen depends on many factors, including production facilities, operating costs, bioreactor size, and so on. In this article the emphasis is placed on describing the continuous cultivation process.
Keywords: cell cultivation, perfusion process, continuous cultivation, perfusion filtration, bioreactor.
Введение. Одним из главных вопросов развития современной биотехнологической промышленности является расширение ассортимента биомедицинских продуктов, необходимых для улучшения качества жизни человека и сохранения здоровья животных. Традиционно для процессов с участием культур клеток выделяют несколько типов культивирования: периодический, полупериодический, непрерывный (перфузионный) [16]. Периодическое культивирование - процесс, при котором питательная среда в полном объеме загружается в биореактор, после этого добавляют посевной материал и далее при благоприятных условиях происходит процесс до тех пор, пока не накопится нужное количество метаболита или биомассы. В ходе данного типа культивирования изменяется
скорость роста культуры, ее морфология и физиология. В частности, меняется состав среды — уменьшается концентрация питательных веществ и увеличивается содержание метаболитов. Считается, что периодическое культивирование менее эффективно, так как ряд технологических трудностей (сменные режимы, циклический ход операций) затрудняют контроль и регуляцию процесса [17]. С экономической точки зрения этот подход также не выгоден из-за малого количества целевого продукта [3]. В отличии от полупериодического, при периодическом процессе необходимо проводить ряд дополнительных операций. В биореактор добавляют различные питательные вещества, содержащие азот и углеводы, обеспечивают регулировку рН, а также в определенный момент ферментации
добавляется предшественник. За счет этого полупериодический процесс, по сравнению с периодическим, экономически выгоднее, так как позволяет получить больший выход продукции [6]. Растет интерес к возможности разработки действительно непрерывных процессов для крупномасштабного производства высококачественных биопрепаратов. Непрерывное культивирование может обеспечить значительное снижение трудозатрат и количество оборудования, одновременно улучшая качество продукции и облегчая проектирование гибких производственных мощностей. Суть непрерывного (перфузион-ного) процесса состоит в том, что из биореактора в процессе синтеза берется определенное количество культуральной жидкости и переносится в другой ферментер, где также начинается биосинтез. При этом культу-ральная жидкость несет на себе функции посевного материала. После этого в ферментер-донор добавляется определенное количество воды и процесс биосинтеза в нем продолжается. Поэтому, если использовать нужное количество ферментеров и обеспечить своевременный перенос части культуральной жидкости из одного биореактора в другой можно достигнуть замкнутого цикла [13]. Следует отметить, что одно из основных преимуществ непрерывного процесса, это сокращение временных затрат на выращивание посевного материала. Ранние перфузионные технологии, разработанные в 1980-х годах, часто негативно влияли на здоровье клеток и влекли за собой сложное инженерное манипуляции по масштабированию процесса, и несмотря на многообещающие преимущества, метод не получил широкого распространения. Кроме того, достижения в области разработки клеточных линий, состава среды и конструкции биореактора привели к многократному увеличению титра продукта из серийных и питаемых серийных клеточных культур. Перфузионный процесс заключается в постоянном поступлении в биореактор с определенной скоростью свежей питательной среды и отводе с той же скоростью отработанной культуральной жидкости с сохранением клеточной биомассы внутри реактора. Для перфузионного метода характерны основные принципы: свежая среда постоянно подается в биореактор; отработанная среда, содержащая продукт, непрерывно удаляется с помощью специальных установок (например, фильтр с полыми волокнами); клетки остаются в биореакторе; рабочий объем поддерживается постоянным за счет добавления и удаления
среды с одинаковой скоростью; продолжительность процесса варьируется от 21 до 60 дней и более. Перфузия является хорошо известным производственным подходом уже много лет для ряда биологических препаратов, таких как факторы свертывания крови, вакцины, а также моноклональные антитела. В этой технологии применяются устройства для удержания клеток на основе ATF-фильтров, которые удерживают клетки и пропускают жидкость и мелкие молекулы. В устройствах ATF используется принцип тангенциального потока, при этом регулярно меняется направление потока, чтобы минимизировать загрязнение и уменьшить силы сдвига на ячейках [8].
Процесс перфузионного культивирования. Способ получения химических веществ путем непрерывного культивирования, включает в себя следующие этапы: (а) культивирование клеток в среде в ферментере для ферментации исходного сырья для получения химического вещества; (б) проведение фильтрации культуральной среды с помощью разделительного мембранного модуля; (^ отделение пермеата, содержащего химическое вещество, от культуральной среды при сохранении непроницаемости в ферментере и (ё) подача газа, по меньшей мере, из нижней части модуля разделительной мембраны и трубы, соединяющей ферментер и модуль разделительной мембраны, для регулировки линейной скорости газа в модуле разделительной мембраны при подаче жидкости в модуль разделительной мембраны [7]. В конце ферментации многоциклического процесса 90% культуральной жидкости сливается из ферментера, а оставшаяся часть выполняет роль посевного материала. Система перфу-зионной фильтрации обеспечивает ведение непрерывного процесса культивирования с задержанием клеток с помощью фильт-роэлементов и возвращения их в биореактор [9]. Такое решение позволяют достигать в реакторах высоких клеточных плотностей, несравнимых с таковыми в периодических процессах [1]. Также, постоянное выведение культуральной жидкости из биореактора в сборочную емкость повышает сохранность высоколабильных белков. Для перфузионных культур доступно несколько методов удержания клеток. Одним из них является тангенциальная проточная фильтрация (TFF). В отличие от обычной проточной фильтрации (NFF), при которой среда прокачивается через мембранный фильтр, перистальтический насос используется для рециркуляции клеточной
культуры по поверхности проницаемой мембраны. Этот процесс снижает риск загрязнения фильтра. В TFF жидкость и соединения с молекулярной массой меньше порогового значения мембраны могут проходить через мембрану (пермеат), в то время как более крупные молекулы задерживаются (ретентат). Фильтрация с переменным тангенциальным потоком (ATF) использует метод TFF, но диафрагменный насос изменяет направление потока на поверхности мембраны [2]. По сравнению с периодическими процессами или процессами с подпиткой, перфузионная культура клеток позволяет клеткам оставаться в фазе экспоненциального роста в течение длительного времени и достигать более высокой плотности жизнеспособных клеток [7]. При сравнении производительности процессов периодического, периодического кормления и перфузии - трех основных методов производства hMAb - с использованием одного лабораторного контроллера биопроцесса [5], было выявлено, что культура Fed-batch обеспечила пятикратное увеличение выхода hMAb, но за значительно более длительный период, требуя гораздо большего вмешательства человека и более сложного оборудования, хотя использование среды оставалось низким. Метод перфузии ATF обеспечил самый высокий выход как жизнеспособных клеток, так и hMAb [5]. Однако он требовал дополнительных капиталовложений и лабораторного пространства для установки фильтрации ATF и контроллера, эксплуатации сложного оборудования, взятия множества ежедневных проб и контроля объемов сосудов. Кроме того, при этом использовалось гораздо большее количество клеточной культуральной среды, но значительно большей производительности удалось добиться при длительном перфу-зионном культивировании, когда после одной инокуляции можно непрерывно получать антитела до двух-трех месяцев. В другом исследовании [4] создали автоматизированный перфузионный процесс производства DIP под названием DI244 с использованием системы фильтрации с переменным тангенциальным потоком (ATF) для удержания клеток. Наблюдались концентрации жизнеспособных клеток и титры DIP более чем в 10 раз выше, чем в ранее представленном серийном культивировании.
Производство вакцин с помощью технологии перфузии. Перфузионный процесс повышает концентрацию клеток и объемную производительность, поэтому он становится
широко используемой стратегией в производстве вакцин. Проводили исследования в культивировании клеток Vero в Eppendorf BioBLU 5p Single-Use Vessels, предварительно заполненных Fibra-Cel [18]. Процесс контролировался с помощью станции управления биопроцессами BioFlo® 320. Культивировали клетки в режиме перфузии, что обеспечивало постоянное поступление питательных веществ и удаление токсичных побочных продуктов. В исследовании достигли очень высокой плотности клеток Vero - около 43 миллионов клеток на мл, что демонстрирует большой потенциал для производства вакцин на основе клеток Vero с использованием упакованных сосудов Fibra-Cel [18]. В другом исследовании оптимизировали и разработали перфузионный процесс для эффективного производства вакцины Зостер на основе аденовируса [12]. Сначала протестировали различные стратегии перфузии во встряхиваемых колбах, показав, что полунепрерывная стратегия обеспечивает оптимальный рост клеток HEK 293. Таким образом была показана эффективная разработка нового процесса перфузионного производства рекомбинантной аденовирусной вакцины против опоясывающего лишая (HZ). В другом исследовании [14] создали автоматизированный перфузионный процесс производства DIP под названием DI244 с использованием системы фильтрации с переменным тангенциальным потоком (ATF) для удержания клеток. Наблюдались концентрации жизнеспособных клеток и титры DIP более чем в 10 раз выше, чем в ранее представленном серийном культивировании. Таким образом, был создан автоматизированный перфузионный процесс для производства IAV DIPs против инфекции вируса гриппа А (IAV). Помимо этого, технология перфузии позволяет усовершенствовать технологии получения инактивированной вакцины. Это может быть актуально в животноводстве, например данная технология может быть использована против цирковируса свиней благодаря инновационной технологии перфу-зионного культивирования клеток почки свиньи (PK-15) [4]. Так как на сегодняшний день цирковирус свиней 2 типа является одним из самых распространенных патогенов среди свиноводческих комплексов (летальность 70— 80%) [9].
Перфузия в медицине. В последнее десятилетие большое значение приобрело трехмерное (3D) культивирование [11] стволовых клеток в динамических биореакторных системах для процессов тканевой инженерии,
тестирования биоматериалов и моделей in vitro [1]. Традиционные двухмерные (2D) статические системы культивирования используются во многих исследованиях, хотя они не представляют ситуацию in vivo [10]. Более того, статические системы имеют недостатки в массовом переносе питательных веществ и кислорода в 3D конструкции. Для преодоления этих недостатков были разработаны различные биореакторы, начиная от колб Спиннера, систем с перемешиванием [15], вращающихся стенок и вращающегося ложа, до перфузион-ных биореакторов. На основе этого была показана роль перфузионных биореакторов в инженерии костной ткани [5]. Перфузионные системы представляют собой более сложную альтернативу колбам Спиннера, сосудам с вращающимися стенками. По сравнению с упрощенными методами перфузия показала лучшие результаты в отношении индукции остеогенной дифференцировки и формирования костной ткани de novo in vivo.
Трехмерное (3D) культивирование стволовых клеток в динамических биореакторных системах имеет большое значение в контексте регенеративной медицины. В исследованиях [6] показываются разработки миниатюрных, способных к параллельному культивированию перфузионных биореакторных систем с двумя различными камерами.
Заключение. Таким образом, перфузи-онные процессы непрерывные, позволяют работать с чувствительными к механическим воздействиям клетками животных, обеспечивают сохранность биомассы, обладают высокой эффективностью. Преимущества по сравнению с аналогами заключаются в достижении в реакторах высоких клеточных плотностей, несравнимых с таковыми в периодических процессах. Также к преимуществам относятся: увеличенный выход продукта, использование биореакторов меньшего объема, по сравнению с другими методами, низкая себестоимость вакцины.
Список источников
1. Feng Li, Natarajan Vijayasankaran, Amy (Yijuan) Shen, Robert Kiss, and Ashraf Amanullahcorresponding. Cell culture processes for monoclonal antibody production. MAbs. 2010 Sep-Oct; 2(5): 466-477. PMCID: PMC2958569. PMID: 20622510.
2. M.F. Clincke, et al. Very high density of Chinese Hamster ovary cells in perfusion by alternating tangential flow or tangential flow filtration in WAVE Bioreactor. Part II: Applications for antibody production and cryopreservation. Biotechnol. 2013. Prog.29. P.768-777
3. Gwendal Granicher, Juliana Coronel, Felix Trampler, Ingo Jordan, Yvonne Genzel, and Udo Reichl. Performance of an acoustic settler versus a hollow fiber-based ATF technology for influenza virus production in perfusion. Appl Microbiol Biotechnol. 2020; 104(11): 4877-4888. PMCID: PMC7228903. PMID: 32291490.
4. K. Han, M. Sha. High-Density Vero Cell Perfusion Culture in BioBLU® 5p Single-Use Vessels. Eppendorf Application Note. 2017. P.359
5. Huifeng Zhang, Haibin Wang, Mei Liu, Tao Zhang, Ji Zhang, Xiangjing Wang, and Wensheng Xiang. Rational development of a serum-free medium and fed-batch process for a GS-CHO cell line expressing recombinant antibody. Cytotechnology. 2013 May; 65(3): 363-378. PMCID: PMC3597181. PMID: 22907508.
6. Marc D. Hein, Anshika Chawla, Maurizio Cattaneo, Sascha Y. Kupke, Yvonne Genzel, and Udo Reichl. Cell culture-based production of defective interfering influenza A virus particles in perfusion mode using an alternating tangential flow filtration system. Appl Microbiol Biotechnol. 2021; 105(19): 7251-7264. PMCID: PMC8437742 PMID: 34519855.
7. Michelet Dorceus, Stacey S. Willard, Amanda Suttle, Kevin Han, Pei-Juin Chen and Ma Sha. Comparing Culture Methods in Monoclonal Antibody Production: Batch, Fed-Batch, and Perfusion. Monday, March 20, 2017, CT 06082; 1-860-253-6649.
8. QYResearch Group. Global micro bioreactors market research report. November 2021. 120 P. Copyright © QYResearch. SKU: QYR16839835.
9. Satoko Kanamori, Shiga (JP); Jihoon Cheon, Shiga (JP); Takashi Mimitsuka, Kanagawa (JP); Norihiro Takeuchi, Shiga (JP); Makoto Nishida, Shiga (JP); Yuji Tanaka, Shiga (JP). United States Patent Application Publication: US 2013/0330787 A1. Method for producing chemical by continuous fermentation. Dec. 12, 2013
10. Huifeng Zhang, Haibin Wang, Mei Liu, Tao Zhang, Ji Zhang, Xiangjing Wang, and Wensheng Xiang. Rational development of a serum-free medium and fed-batch process for a GS-CHO cell line expressing recombinant antibody. Cytotechnology. 2013 May; 65(3): 363-378. PMCID: PMC3597181. PMID: 22907508.
11. Jakob Schmid, Sascha Schwarz, Robert Meier-Staude, Stefanie Sudhop, Hauke ClausenSchaumann, Matthias Schieker and Robert Huber. A perfusion bioreactor-system for cell seeding and oxygen-controlled cultivation of 3D-cell cultures. September 2018.Tissue Engineering Part C Methods 24(10). DOI: 10.1089/ten.TEC.2018.0204.
12. Jianqi Nie, Yang Sun, Kai Feng, Lingling Huang, Ye Li, and Zhonghu Baib. The efficient development of a novel recombinant adenovirus zoster vaccine perfusion production process. Vaccine. 2022 Mar 18; 40(13): 2036-2043. PMCID: PMC8863426. PMID: 35216843.
13. Karthik P. Jayapal, Katie F. Wlaschin, Wei Shou Hu, Miranda G S Yap. Recombinant protein therapeutics from CHO Cells - 20 years and counting. 2007. Chemical Engineering Progress, 103(10), 40-47.
14. Marc D. Hein, Anshika Chawla, Maurizio Cattaneo, Sascha Y. Kupke, Yvonne Genzel, and Udo Reichl. Cell culture-based production of defective interfering influenza A virus particles in perfusion mode using an alternating tangential flow filtration system. Appl Microbiol Biotechnol. 2021; 105(19): 7251-7264. PMCID: PMC8437742 PMID: 34519855.
15. Michael Sherman, Vincent Lam, Melisa Carpio, Nick Hutchinson and Christel Fenge. Continuous Cell Culture Operation at 2,000-L Scale. November 17, 2016. Sartorius Stedim Biotech GmbH.
16. Michelet Dorceus, Stacey S. Willard, Amanda Suttle, Kevin Han, Pei-Juin Chen and Ma Sha. Comparing Culture Methods in Monoclonal Antibody Production: Batch, Fed-Batch, and Perfusion. Monday, March 20, 2017, CT 06082; 1-860-253-6649.
17. QYResearch Group. Global micro bioreactors market research report. November 2021. 120 P. Copyright © QYResearch. SKU: QYR16839835.
18. Satoko Kanamori, Shiga (JP); Jihoon Cheon, Shiga (JP); Takashi Mimitsuka, Kanagawa (JP); Norihiro Takeuchi, Shiga (JP); Makoto Nishida, Shiga (JP); Yuji Tanaka, Shiga (JP). United States Patent Application Publication: US 2013/0330787 A1. Method for producing chemical by continuous fermentation. Dec. 12, 2013.
Вклад авторов:
Карпова О.О. и Матвеева И.Н. проанализировали литературные данные и написали рукопись
Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации. Авторы заявляют об отсутствии
конфликта интересов.
Contribution of the authors:
Karpova О.О. and Matveeva I.N. analyzed the literary data and wrote the manuscript The authors contributed equally to this article. The authors declare no conflicts
© Карпова О.О., Матвеева И.Н., 2022
