CC BY
495
УДК 579.2:579.66:579.695:577.2
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ BACILLUS SUBTILIS В СТРУКТУРЕ БЕЗОТХОДНОЙ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ВЕТЕРИНАРНОГО
НАЗНАЧЕНИЯ
Н.В.Ширшиков, Ю.В. Редикульцев, Е.Н.Музафаров, А.Б. Гаврилов
Обсуждаются вопросы асептического культивирования спорогенных бактерий в погруженной культуре для получения суспензии клеток, используемых для разработки пробиотического препарата ветеринарного назначения. Разработаны элементы безотходной биотехнологии культивирования микроорганизмов с применением питательных средна основе зернового материала. Использование размолотого зерна пшеницы как на стадии приготовления питательной среды, так и на стадии приготовления препарата сокращает к минимуму расход водной фазы, что является основой безотходности в рамках микробиологического процесса. Обсуждаются вопросы применения пробиотиков в качестве альтернативы медикаментозным препаратам, массово используемых в птицеводстве и животноводстве. Рассматриваются также вопросы организации системы культивирования микроорганизмов на основе пневмо-приводных ферментеров.
Ключевые слова: пробиотики, культивирование бактерий, безотходная биотехнология, зерновой материал, пневмоприводной биореактор.
Введение
Использование спорообразующих бактерий в качестве пробиотических микроорганизмов известно уже более 20- лет. В мировой биотехнологии создано большой количество препаратов на основе рода Bacillus, в России создано более 20 подобных препаратов, используемых как в медицинских целях, так и ветеринарии [1]. Пробиотический эффект спорообразующих бактерий при лечении дисбактериоза животных и человека достигается тем, что споры, попадая в желудочнокишечный тракт, прорастают. Соответственно, бактерии продуцируют физиологически активные вещества типа антибиотиков и ферментов, которые подавляют рост патогенной микрофлоры. Следует отметить, что вопросам культивирования спорогенных бактерий посвящены многочисленные публикации патенты [2]. В прелагаемых модельных процессах использованы, как правило, комплексные среды на основании соевого шрота, кукурузного экстракта с применением минеральных компонентов. Нами предложен в качестве исходного сырья зерновой материал из пшеницы, причем зерно используется как на стадии приготовления жидкой питательной среды, так и на стадии приготовления продукта. Минеральные компоненты не используются, а водная фракция или этанол используются на стадии первичной очистки зерна от технологических примесей. При больших выходах продукта наиболее
эффективно использование этанола, поскольку этанол легче регенерировать. На этапах испытания активности препарата делались высевы для анализа колониеобразующих единиц (КОЕ).
Материалы и методы Ферментационная установка. Использовали систему ферментации ИБП РАН МФК-3 [3]. В состав системы входят: модуль фильтрации подающего и отходящего воздуха, ферментационные емкости объемом по 3 литра (рис. 1); система коммуникационных магистралей и клапанов; автономный модуль парогенератора рабочим объемом 20 л с подсистемой автоматической дозаправки водой; модуль периодической стерилизации питательных сред в режиме автоклавирования объемом 20 л; двухуровневая система сбора данных и управления.
Рис. 1. Схема ферментационной установки. 1-2-ферментационные емкости, 3-4 - крышки герметические, 5-6- теплообменныерубашки, 7-кольца Рашига или матрикс, 9 - трубопровод нижнего слива, 10 - насос, 11 - буферная емкость, 12 - шлюзовая камера, 13-21 - клапаны, 22-27- патрубки для подключения к внешним сетям,
28- система управления
Ядром системы является каскадный модуль, который состоит и двух ферментационных емкостей. В данном модуле используется пневматический режим аэрации и перемешивания культуральной жидкости (КЖ), моторы и герметические системы передачи мощности в жидкость типа магнитных муфт, уплотнений и сальников не используются. Ферментационные емкости соединены магистралью для перетока культуральной жидкости из одной емкости в другую, причем каждая наполовину заполнена «структурными элементами» типа колец Рашига или матриксом для создания «физиологической поверхности» массообмена. При подаче стерильного воздуха по магистрали 23 и открытом клапане 13 и закрытом клапане 16 КЖ из емкости 1 по патрубку нижнего слива поступает в емкость 2. При открытом клапане 16 и закрытом клапане 13 КЖ из емкости 2 возвращается в емкость 1; таким образом, осуществляется цикл перетока. В противофазе клапанам 13, 16 работают клапаны 14 и 15, которые вместе с буферной емкостью 11 и патрубком 24 образуют магистраль отходящего воздуха. По линии 22 и помощью насоса в ферментационную емкость 1 подаются питательная среда и загружается посевной материал. Линия 25 служит для подачи пара; линия 26 обеспечивает сбор продукта; линия 27 сброс в канализацию.
В модуле фильтрации газов и воздуха использовали стерилизуемые фильтры с фильтрующими элементами и корпусами компании «Владипор» (Россия).
В качестве приводных клапанов использовали 3/2 электропневмопреобразователи фирмы SMC (Япония). Для коммуникации культуральной жидкости, пара и сред использовали пережимные клапаны оригинальной конструкции. Двухуровневая система управления состоит из микроконтроллера и РС [4]. Система реализует удобные элементы графического пользовательского интерфейса (GUI), осуществляет режимы управления исполнительными элементами, параметризацию процесса и визуализацию состояния процесса ферментации, архивирование данных, доступных, кроме того, для интерпретации средствами Ехсе1.
Питательная среда. Основой питательной среды является отвар размолотого зерна пшеницы. Химический состав зерна представлен в работе [5]. Среду готовили следующим образом:
- зерно пшеницы промыли в холодной водопроводной воде до просветления смывной воды, затем просушили,
- размололи зерно на крупорушке до фракции 0.2-0.4 мм,
- взяли 200 г размола и залили 3-4 л водопроводной воды в бутыль объемом 10 л,
- в бутыль подвели пар (110 оС ) , разогрели смесь паром и варили 20-30 мин.; объем среды довели до 5.5 -6.0 л.
- отвар фильтровали через сито (0.7),
- в фильтрат внести 5 г/ л мела - СаСО3 и тщательно перемешали,
- взяли 600 мл отвара на приготовление посевного материала, основная часть среды загрузили в специальный стерилизатор сред, который является составной частью ферментационной установки, стерилизовали 120 оС, 60 мин,
- рН среды до стерилизации 7.2, среда забуферена углекислым кальцием.
Стерилизация модулей установки и питательной среды.
Стерилизацию модуля ферментеров, модуля фильтров и питательной среды осуществляли от встроенного в систему парогенератора с помощью процедур управления, специально разработанных и адаптированных для данного микробиологического процесса. Параметры стерилизации составляли 120 оС, 60 мин.
Выращивание посевного материала. Для исследований использовался штамм ВасШш БиЫШБ ВКПМ В-5225. Выращивание инокулюма осуществляли в трех колбах по 150 мл на качалке на основной среде ферментации, при 30 оС и 180 об/мин. Суточный посевной материал снимали и сливали в боксе под пламенем в одну колбу с отростком для последующего посева в ферментер.
Процесс культивирования. В ферментационную емкость 1 загружается питательная среда объемом 2 л и посевной материал; данный объем среды является оптимальным для требуемого режима перемешивания и аэрации. Обе ферментационные емкости заполнены связывающими КЖ элементами - кольцами Рашига (высота кольца равна его диаметру). Ход и параметры процесса отражены в табл. 1. В соответствии с процедурой управления культуральная жидкость перетекает поочередно из одного ферментера в другой, при этом на кольцах Рашига осаждается часть жидкости, которая аэрируется сжатым воздухом. Частота смены фаз на кольцах Рашига в цикле перетока культуральной жидкости определяет скорость массообмена по кислороду.
Таблица 1
Культивирование ЕлиЬШя в отъемно-доливном режиме
Культивирование В.БиЫШБ в отъемно-доливном режиме.Ферментер: 2х2 л пневмоприводной, активная поверхность сетка или фторопластовые кольца: насыпной объем 50 % от объема ферментера. Пит. среда:
- зерно пшеницы мыть в холодной водопроводной воде до просветления смывной воды. Сушить.
- размолоть на крупорушке до самой крупной фракции 0.2-0.4 мм.
Окончание табл. 1
- размол 200 г залить 3-4 л холодной водопроводной воды в бутыль - разогреть паром и варить 20-30 мин.; объем среды довести до 5.5 -6.0
л. - Отвар фильтровать через сито (0.7) - в фильтрат внести 50 г/5 л мела - СаСО3 ; тщательно перемешать - взять 600 млм на приготовление инокулята. Инокулят: Три колбы по 150 мл, слитые в одну, рН - 6.5, титр 8*10 клеток в 1 мл КЖ.
Время Операция рН Титр Примечание
Началор оста 1.Посев 9-30, Инокулюм 600 мл с Титром 8*108 2. Расход воздуха на подачу15 л/мин 6.0 Посевная доза в ферментере, титр: Т=8*108/2600=3 х106 1. Объем ферментера начальный =2600 мл 2. Температура культивирования 37°С
24 часа Отбор пробы в 10-00 6.0 Т=2.3*108
48 часов Отбор пробы в 10-00 Слив 1.5 л КЖ 6.0 Т=2.0х108
72 часа Отбор пробы в 9-00 Долив среды до 2хУф 6.5 Т=0.7х108
96 часов Слив КЖ полностью («Инокулят» на кольцах и стенках), долив среды 7.0
120 часов Процесс в норме
144 часа Слив/долив 7.0 Т=1.2х108
168 часов Слив/долив 7.0 Т=1.0х108
192 часа Слив 7.0 Т=1.0х108 Процесс окончен
Титр подсчитывали по формуле: Т=4Яшх106 Я-разведение, ш - среднее число клеток в одном малом квадрате
Расчет квоты слива в режиме отъема-долива и периода восстановления биомассы:
Физиологически предельная концентрация биомассы - Х12, текущая концентрация биомассы связаны с ростовым периодом12- ^(периодом
восстановления) и удельной скоростью роста - ц, следующим соотношением:
1= Ьи(Х(12)/Х(11))/ ц (1)
Для удобства эксперимента (обслуживание процесса один раз в сутки - утром) слив КЖ осуществляли «овернайт» в количестве исходного объема КЖ, т.е. в слив уходила практически вся суточная биомасса, а в ферментационной емкости оставалась биомасса ниже посевной дозы - то, что осаждалось на кольцах (матриксе), величина по титру около 0,3(1) х 106. При этом через сутки концентрация перед сливом достигала 2.3х 10 (см. табл. 1). В соответствии с этими данными при удельной скорости (0.25-0.3) 1/час рассчитывали период восстановления биомассы от Х(1;1) до Х(12) по формуле (1) : Ьи(230/0.5) / 0.25 = 24.52 часа.
Таким образом, микробиологический процесс укладывается в рамки классической экспоненциальной модели роста, что говорит о правильности выбранных методик и возможности потенциального масштабирования процесса.
Получение модельной формы препарата. Взяли 1 литр КЖ и перенесли на носитель: 0.7 л размола пшеничного зерна и перемешали на специальном поддоне; сушили при комнатной температуре. Одновременно с сушкой происходил рост бактерий по типу твердофазной ферментации. Высушенный препарат размололи до фракции аналогичной исходному размолу зерна; распаковали в полипропиленовые банки.
Контроль активности. Одним из показателем качества препарата является длительность его активности, которая выражается в сохранении спор бактерий способных к прорастанию. Анализ активности спор проводили методом определения колониеобразующих единиц (КОЕ). Для этого брали 1 г препарата, которой хранился при комнатной температуре или в холодильнике, и разводили в 50 мл водопроводной воды и 1 мл суспензии через разведение высевали на чашки с МПА, затем подсчитывали колонии и определяли титр жизнеспособных спор. Результаты свели в табл. 2.
Таблица 2
Анализ активности спор
Дата определения КОЕжизнеспособных спор Концентрация жизнеспособных спор в 1 грамме препарата
08-12 - 2010 6,5 х 107
14 - 01 - 2011 5,0 х 107
20- 01 - 2012 1,5 х 107
Результаты и обсуждение
В данной работе продемонстрированы результаты исследований по использованию пневмоприводных биореакторов и получение биопрепарата в рамках смоделированной в лабораторных условиях безотходной технологии.
Ферментационная система, основанная на периодической смене межфазного пространства для бактериальной культуры и состоящая из двух горизонтально расположенных емкостей, показала хорошие массообменные характеристики, которые оценивались по выходу биомассы. Выходы биомассы в биореакторе были сопоставимы с «колбочными» вариантами культивирования строгих аэробов, какими являются бактерии Bacillus subtilis. Применение кислородных электродов в данных система затруднено из-за того, что переменное давление в емкостях и периодическое удаление жидкой фазы из реакционной емкости проводит к некорректным измерениям парциального давления кислорода, поэтому массообменные характеристики получили оценку на основе интегральных показателей выхода биомассы.
Другим важным аспектом применения пневмоприводных биореакторов является их экономичность по механическому приводу и расходу сжатого воздуха, а также решение проблемы статического давления при горизонтально расположении ферментационных емкостей. Все эти позитивные факторы, заложенные в конструкционные элементы ферментационной системы привели к тому, что было проведено восемь ростовых циклов в режиме отъема-долива биомассы. Практически это означает, что было воспроизведено восемь периодических процессов в одном технологическом цикле!
Одним из самых важных результатов - моделирование в данном процессе безотходной технологии получения пробиотика ветеринарного назначения. Тема применения пробиотиков в ветеринарии и медицине в плане «антибиотикозамещения» достаточно актуальна как у нас в стране, так и за рубежом. Англичане К.А. Дей и Дж. Лисански показали, что при транспортном стрессе у свиней компенсаторная доза пробиотических
8 9
лактобацилл оценивается как 10 - 10 в день [6]. Существуют основания полагать, что для спорообразующих бактерий эффективная лечебная доза также находится в этих пределах. Полученный нами на основе зернового материала пробиотик имеет сопоставимые параметры по лечебной дозе, а также имеет высокие показатели качества при хранении. Вариант предложенной технологии вполне вероятно может иметь далеко идущие последствия в принципе безотходности, как переносе «продукта» на носитель.
Выводы
Процессе культивирования бактерий Bacillus subtilis в пневмоприводном биореакторе показал хорошую воспроизводимость выхода по биомассев нескольких ростовых циклов в отъемно-доливном режиме. Реализована модель безотходной технологии получения пробиотика на основе культуры спорогенной бактерии. Применение пробиотических препаратов в будущем, вероятно, приведет к отказу от массового применения антибиотиков в животноводстве.
Списоклитературы
1. Похиленко В.Д., Перелыгин В.В. Пробиотики на основе спорообразующих бактерий и их безопасность // Химическая и биологическая безопасность. 2007. №2-32. С.20-41.
2. Зубарева И.М., Федорова И.С., Зубова А.В. Разработка глубинных питательных сред в производстве биоспорина // Вопросы химии и химической технологии. 2004. №1. С.85-88.
3. Полезная модель 69518. Аппарат для культивирования клеток и микроорганизмов / Ю.В. Редикульцев, В.К. Кудряшов, В.С. Голиченков. Опуб. 27.12.2007. МПК: C12M3/00.
4. ФГБУН Институт биологического приборостроения Российской Академии Наук [Электронный ресурс] // [сайт]. URL: http://www.ibp-ran.ru/units/nauchno-
issledovatelskie_podrazdeleniya/otdel_razrabotki_eksperimentalnoy_apparatury _i_programmnogo_obespecheniya/
5. Семенов С.М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов. Справочник. М.: Агропромиздат, 1990. 240 с.
6. Форстер К.Ф., Дж. Вейз Д.А. Экологическая биотехнология / под ред. К.Ф. Форстера, Д.А. Дж. Вейза. Л.: Химия, 1990. Пер. изд.: Великобритания, 1987. 384 с.
Ширшиков Николай Васильевич[email protected]), ведущий биотехнолог Ширшиков Николай Васильевич, ведущий биотехнолог, [email protected], Россия, Пущино, Институт биологического приборостроения РАН,
Редикульцев Юрий Васильевич, руководитель группы, bio [email protected] Россия, Пущино, Институт биологического приборостроения РАН,
Музафаров Евгений Назибович, д-р биол.наук, проф., зав. кафедрой биологии, [email protected], Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Гаврилов Анатолий Брониславович, руководитель отдела, [email protected] Россия, Пущино, Институт биологического приборостроения РАН,
Шевелев Дмитрий Алексеевич, ведущий программист, bio [email protected] Россия, Пущино, Институт биологического приборостроения РАН
CULTIVATION OF BACILLUS SUBTILIS IN THE STRUCTURE OF NON-WASTE TECHNOLOGY OF PROBIOTIC VETERINARY DRUG
N.V.Shirshikov, Y. V. Redikultsev, E.N.Muzafarov, A.B.Gavrilov, D.A. Shevelev
The article discusses the aseptic culturing sporogenous bacteria in submerged culture for cell suspension used for the development of probiotic veterinary drug. Developed elements without waste biotechnology cultivation of microorganisms with the use of culture media on the basis of grain material. Use of the milled wheat grain at the stage of preparation of the nutrient medium, and the step of preparing the drug reduces to a minimum flow rate of the aqueous phase, which is the basis of disposability within microbiological process. The problems of the use of probiotics as an alternative to medical drugs, massively used in poultry and livestock. We also consider the organization of microbial cultivation system based on pneumatically fermenters.
Keywords: probiotics, bacteria cultivation, waste-free biotechnology, cereal material, pneumatically bioreactor.
Shirshikov Nikolas Vasilevich, lead biotechnologist, [email protected], Russia, Pushchino, Institute for Biological Instrumentation Russian Academy of Sciences,
Redikultsev Yuri Vasilevich, head of group, department of biotechnology, [email protected], Russia, Pushchino, Institute for Biological Instrumentation Russian Academy of Sciences,
Muzafarov Evgeni Nazibovich, doctor of biology science, professor, manager kathedra, [email protected],Russia, Tula, Tula state University,
Gavrilov Anatoly Bronislavovich, head of department, [email protected], Russia, Pushchino, Institute for Biological Instrumentation Russian Academy of Sciences,
Shevelev Dmitri Alexeyevich, lead programmer, [email protected],Russia, Pushchino, Institute for Biological Instrumentation Russian Academy of Sciences
