CC BY
245
DOI: 10.23868/202110005
КРИОКОНСЕРВАЦИЯ ПОЛОВЫХ КЛЕТОК: ИСТОРИЯ И СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ВОПРОСА
И.А. Одинцова, С.Э. Русакова, А.А. Шмидт, Ю.Л. Тимошкова llci^ym^ 12082021
„ . „ „ Принята к печати: 1°.1°2°21
Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Опубликована on-line: 12.102021
Санкт-Петербург, Россия
CRYOPRESERVATION OF GAMETES: HISTORY AND CURRENT STATE OF A QUESTION
I.A. Odintsova, S.E. Rusakova, A.A. Schmidt, Y.L. Timoshkova
S.M. Kirov Military medical academy, St. Petersburg, Russia
e-mail: rusakova-svetik@mail.ru
Развитие репродуктивной медицины, а именно, экстракорпорального оплодотворения, поставило перед научным сообществом задачу консервации и сохранения биологической пригодности женских и мужских половых клеток. Создание метода витрификации показало его преимущество перед другими способами криоконсервации и стало обнадеживающим событием в развитии криобанков половых клеток. В обзоре отражена история возникновения метода криоконсервации; современные аспекты криоконсервации гамет; отмечены недостатки и преимущества различных методик отбора полноценных гамет; приведены некоторые протоколы проведения криоконсервации; дана краткая характеристика отдельно используемых криопро-текторов и их различных комбинаций, способных более эффективно предохранять замораживаемые объекты от повреждения. Отмечено, что в настоящее время особое внимание уделяется рассмотрению механизмов криоповреждения и криозащиты при замораживании и витрификации. Представлена морфологическая характеристика изменений, происходящих в половых клетках после процедуры замораживания и оттаивания. Приведены современные методики оценки жизнеспособности половых клеток до криоконсервации и после нее. Показано, что нарушение компактизации хроматина и фрагментация ДНК в морфологически не измененных спермиях оказывает негативное влияние и на качество эмбрионов, и на результаты ЭКО. Подчеркнуто преимущество структурно-функционального состояния ооци-тов млекопитающих при криоконсервации в составе ооцит-ку-мулюсных комплексов по сравнению с ооцитами, созревшими в культивационной среде без фолликулярного эпителия.
Ключевые слова: криоконсервация, витрификация, кри-опротекторы, жизнеспособность гамет, экстракорпоральное оплодотворение, сперматозоид, женская половая клетка.
Введение
В 2010 году Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) официально включила бесплодие в перечень заболеваний, отметив, что ухудшение репродуктивного здоровья населения экономически развитых стран является серьезной медицинской и социальной проблемой. Количество бесплодных супружеских пар в мире составляет около 10-15%, более 50% случаев из их числа приходится на нарушения мужской фертильности [1]. Свой вклад в нарушение фертильности вносят аномалии эмбрионального развития органов репродуктивной системы, нарушение их функционирования вследствие нездорового образа жизни, вредных привычек, неконтролируемого приема лекарственных препаратов, несоблюдения техники безопасности на предприятиях, техногенных катастроф и др. [2, 3]. Среди развивающихся и быстро набирающих популярность вспомогательных репродуктивных технологий важное место занимает создание криобанков гамет [4-8]. Кроме того, донорство и криоконсервация гамет актуальны не только для пациентов, которым предстоит лучевая или химиотерапия, но и для людей, которые откладывают наступление беременности и рождение детей из-за карьерных соображений или по каким-то другим причинам. Донация гамет
Development of reproductive medicine, namely, extracorporal fertilization, set the task of preservation and preserving of biological suitability of female and men's gametes for scientific community. Opening of a method of a vitrification showed its benefit before other methods of a cryopreservation and became the encouraging event in development of cryobank of gametes. In this work the history of emergence of a method of a cryopreservation is described; modern aspects of a cryopreservation of gametes; shortcomings and benefits of various techniques of selection of full-fledged gametes are reflected; some protocols of carrying out a cryo-preservation are provided; short characteristic of separately used cryoprotectors and their various combinations capable more effectively to protect the freezing objects from damage, than, each of cryoprotectors separately is given. It is noted that in modern literature special attention is paid to consideration of mechanisms of cryodamages and cryoprotection during the freezing and a vitrification. Characteristics of the changes happening in gametes after the procedure of freezing and thawing are discussed. Modern techniques of assessment of viability of gametes before and after a cryopreservation are given. It is shown that violation of compaction of chromatin and fragmentation of DNA in morphologically not changed spermiya has negative impact and on quality of embryos. The benefit of a structurally functional condition of oocytes of mammals at a cryopreservation of oocytes in structure is emphasized an oocyte-kumulyusnykh of complexes in comparison with the oo-cytes which ripened in the kultivatsionny environment.
Keywords: cryopreservation, vitrification, cryoprotectors, viability of gametes, extracorporal fertilization, spermatozoon, female gamete.
и эмбрионов имеет особое значение для тех, чья служба или трудовая деятельность связаны с повышенным риском получения увечий, препятствующих рождению детей. Использование современных вспомогательных репродуктивных технологий, криобанкинг половых клеток (ооцитов и сперматозоидов) дает возможность военнослужащим своевременно и в полном объеме получать соответствующую помощь в преодолении проблем, связанных с фертильностью. Отдельное значение имеет тот факт, что клеточный криоматериал можно использовать и для посмертной идентификации личности, что представляется актуальным как для военной медицины, так и для гражданского здравоохранения.
Историческая справка
У истоков всех репродуктивных технологических методов и приемов лежит открытие половых клеток — сперматозоидов и яйцеклеток. Приоритет открытия сперматозоидов принадлежит голландцу, уроженцу города Делфт Антони ван Левенгуку, впервые увидевшему мужские половые клетки в 1677 году с помощью сконструированного им микроскопа. В 2022 году этому событию исполнится 345 лет. Полтора века спустя, в 1827 году
выдающийся ученый, подданный Российской Империи Карл Максимович Бэр (в некоторых источниках его упоминают как Карла Магнуса фон Бэра, учитывая его немецкие корни) — эмбриолог, антрополог, палеонтолог, географ — впервые опубликовал сведения о яйцеклетке млекопитающего, за которую ранее принимали ово-фол-ликулярный комплекс яичника (так называемый граафов пузырек) [9, 10]. Именно благодаря ряду фундаментальных эмбриологических открытий, связанных с цитофи-зиологией половых клеток, гистофизиологией органов половых систем, познанием основных закономерностей эмбрионального развития человека, стало возможным обоснование и применение различных технологий репродуктивной медицины [11, 12].
В XVIII веке исследователь Л. Спалланцани изучал сперматозоиды млекопитающих, которые обездвиживал холодовым воздействием [13]. Через некоторое время гаметы становились неподвижными, но после оттаивания восстанавливали свою подвижность и сохраняли ее в течение семи часов. Аналогичные исследования проводились и в XIX веке, когда К. Прево и Р. Монтегацца наблюдали восстановление активности сперматозоидов человека после замораживания гамет до — 17 °С. Тогда же было высказано предположение, что «в будущем сперму будут перевозить на большие расстояния и что от погибших на поле боя воинов после их смерти можно будет получать законное потомство» [13].
Принято считать, что первыми, кто сумел сохранить жизнеспособную сперму млекопитающих при ее замораживании до — 79 °С, была научная группа, возглавляемая английским ученым К. Полджем (1949 год). В качестве криопротектора они применили глицерол. В этом же году в СССР, согласно данным, приведенным в монографии А.В. Балахонова [13], сотрудниками Всесоюзного НИИ животноводства не только было сделано то же самое, но и впервые в мире получено потомство сельскохозяйственных животных (коров и баранов) в результате искусственного осеменения замороженными и оттаявшими сперматозоидами. Сперматозоиды были первыми объектами, успешно перенесшими искусственную криоконсервацию: учитывая их цитоморфологию, достаточно наглядно можно демонстрировать сохранение жизнеспособности после процедуры замораживания-оттаивания [14-16].
Рождению первого ребенка, зачатого вне организма матери, предшествовали множественные попытки экспериментального и клинического применения азов данной технологии учеными разных стран. В 1939 году G. Pincus опубликовал работу, посвященную созреванию in vitro женских половых клеток, извлеченных из фолликулов яичника человека. В эти годы в разных учреждениях и лабораториях мира проводились параллельно интенсивные исследования, в том числе и российскими учеными, по искусственной инсеминации у сельскохозяйственных животных, внесшие значительный вклад в понимание процесса зачатия у млекопитающих. трудами отечественных и зарубежных ученых был заложен фундамент для дальнейшей разработки вспомогательных репродуктивных технологий [5, 17, 18]. В литературе имеется упоминание о русском враче В.С. Груздеве, который в первой половине ХХ века проводил исследования по искусственному оплодотворению кроликов и сделал вывод, что «полноценность оплодотворения» связана со степенью зрелости яйцеклетки [18].
Первый большой успех этой достаточно новой отрасли медицинской науки датирован 25 июля 1978 года. В тот день неподалеку от Манчестера, в старинном английском городке ткачей Олдхэме в семье водителя автофургона
родилась дочь, которую назвали Луиза Джой Браун. Она стала первым в мире ребенком, зачатым in vitro с помощью экстракорпорального оплодотворения [1 3, 19-21]. Гинеколог Питер Стептоу и физиолог Роберт Эдвардс сотворили одну из крупнейших медицинских сенсаций, за которую 2010 году Р. Эдвардс был удостоен Нобелевской премии. Патрик Стептоу к тому времени уже ушел из жизни, а по правилам Нобелевского комитета, посмертно эта премия, к сожалению, не присуждается.
Другим фундаментом для разработки и развития современных клеточных репродуктивных технологий стал гистологический метод клеточных и тканевых культур [6, 11, 19, 22, 23]. Изучение живых клеток организма человека и млекопитающих в составе тканей или изолированно с целью выявления таких показателей жизнедеятельности как пролиферация, рост, интеграция, дифференциация и других стало возможным именно с развитием этого метода. Он позволяет сохранять тканевые элементы, важнейшими из которых являются клетки, в жизнеспособном состоянии, благодаря созданию условий, сходных с организменными (оборудование, поддерживающее необходимую температуру; специальные культивационные питательные среды; содержание углекислого газа, лабораторная посуда и инструментарий) [19, 24-26]. Первая научная работа о возможности сохранения и роста клеток вне организма (in vitro) была опубликована более века назад, в 1907 году [27]. За прошедшее с той поры время метод культивирования клеток и тканей in vitro был значительно усовершенствован, благодаря созданию разнообразных по составу питательных сред и современных культивационных сосудов, разработке и внедрению новых моделей микроскопической техники, с помощью которой можно наблюдать за живыми клетками — как соматическими, так и половыми [28].
Отбор и подготовка гамет для криоконсервации
Мужские половые клетки
Вопрос отбора наиболее жизнеспособных половых клеток, качественных как с морфологической, так и функциональной точек зрения, является одним из краеугольных в репродуктивной медицине. В настоящее время приняты и утверждены новые рекомендованные ВОЗ стандарты качества спермы, апробированы наиболее оптимальные методы подготовки сперматозоидов к процедуре ЭКО. Продолжается разработка новых методов отбора и культивирования гамет. Часть этих методов находится еще в стадии клинических испытаний [29-32].
Сперматогенез происходит в стенке семенных извитых канальцев мужских гонад (яичек) в условиях особого микроокружения, создаваемого эпителиоцитами цело-мического типа (сустентоцитами, клетками Сертоли). При движении по семявыносящим путям сперматозоиды смешиваются с секреторными продуктами семенных пузырьков и предстательной железы. Секрет этих желез называется спермальной плазмой, входящей наряду со сперматозоидами в состав спермы [11]. В клеточный компонент эякулята входят жизнеспособные и нежизнеспособные сперматозоиды, небольшое количество незрелых гамет, лейкоциты и эпителиоциты. Неклеточная составляющая (спермальная плазма) характеризуется сложным биохимическим составом и содержит простагландины, ферменты, фруктозу, L-карнитин, соединения цинка и другие вещества [19]. Показано, что необработанная (неотмытая) сперма не является оптимальной средой для сохранения жизнеспособных сперматозоидов, кроме того, она может
оказывать повреждающее действие на ооциты. Поэтому сперматозоиды, предназначенные для вспомогательных репродуктивных технологий, следует как можно быстрее отмыть в специальных средах. Эти «отмывочные» среды хранятся в холодильнике при температуре +4 °С и согреваются перед применением до +37 °С. Сперматозоиды отделяют от спермальной плазмы следующим образом: смешивают сперму со специальными культуральными средами, отфильтровывают и центрифугируют, каждый раз добавляя к осадку чистую порцию культуральной среды. При этом происходит удаление веществ, которые могут препятствовать капацитации (приобретение сперматозоидами оплодотворяющей способности). После отмывки сперматозоиды помещают в специальные культуральные среды, содержащие добавки, способствующие капацитации. Затем суспензию спермиев, объем которой 0,2 мл, помещают на дно стерильных чашек Петри, покрывают минеральным маслом для предотвращения высыхания и помещают в инкубатор на 3-5 часов для достижения капацитации. В инкубаторе необходимо поддерживать определенный микроклимат: температуру +37 °С, влажность 95% и особый газовый состав (5% углекислого газа, 5% кислорода и 90% азота) [13].
Основной задачей криоконсервации спермы является обеспечение сохранения жизнеспособности и биологической полноценности мужских гамет [4, 33, 34]. Это достигается при помощи различных синтетических сред и веществ, которыми разбавляют эякулят. Цель разбавления заключается в снижении интенсивности биохимических, осмотических, диффузионных и прочих процессов в сперматозоидах, при этом гибель большинства из них не происходит. В состав консервационных и поддерживающих сред входят биологически активные вещества, аминокислоты, антиоксиданты, электролиты, неэлектролиты, антибиотики и криопротекторы. После разбавления сперму помещают в специальные сосуды и 10-15 мин. выдерживают при комнатной температуре. За это время криопротекторы и полезные химические вещества обеспечивают предупреждение критического уровня падения осмотического давления и препятствуют развитию «температурного шока» в клетке. После этого приступают непосредственно к процедуре замораживания [13, 19].
Для экстракорпорального оплодотворения рекомендуют по возможности использовать сперматозоиды, выделенные из эякулята, полученного в тот же день. При подготовке сперматозоидов может остаться незамеченной микробная контаминация, поэтому рекомендуется за 1-2 месяца до предполагаемого ЭКО провести бактериологическое исследование спермы и при выявлении инфекции назначить антибактериальную терапию с последующим повторным бактериологическим исследованием, подтверждающим отсутствие возбудителя [19].
В цитоморфологии оплодотворения важным моментом является капацитация сперматозоидов, в результате которой они активируются и приобретают оплодотворяющую способность. В физиологических условиях (при оплодотворении in vivo) капацитация мужских гамет наступает при их продвижении по женским половым путям. Достигнуть этого эффекта in vitro удалось с помощью центрифугирования спермы и инкубации в культу-ральной среде в атмосфере с 5% сО2.
В настоящее время для отбора наиболее функционально активных спермиев чаще всего применяют методики разделения в градиенте перколла и swim-up методику (всплывание) [11]. Метод всплывания (swim-up) позволяет отобрать из эякулята сперматозоиды с наилучшими характеристиками и уменьшить бактериальное
загрязнение образца; после центрифугирования и удаления надосадочной жидкости от осадка, содержащего как живые, так и погибшие сперматозоиды, добавляют новую порцию среды так, чтобы чистая среда не перемешивалась с осадком. Затем пробирку на 20-30 мин. помещают в инкубатор. За это время подвижные сперматозоиды мигрируют из осадка в чистую среду и всплывают, оставив на дне нежизнеспособные, погибшие гаметы.
Изменение пространственной структуры хроматина сперматозоидов в аспекте фертильности изучено крайне слабо. Имеются лишь единичные сведения о том, что не только нарушения структуры жгутика, деформация и вакуолизация головки спермия, но и дефекты акросомы и органелл, расположенных в шейке, дефекты хроматина (нарушение конденсации, фрагментация) в ядре подлежат исследованию и влияют на успешность процедуры ЭКО [35-37]. Установлено, что в ходе сперматогенеза при редупликации ДНК неизбежно появляются разрывы в ее структуре, но в ходе эволюции сформировались молекулярные механизмы репарации мужского генома [38]. Известны случаи, когда сперматозоид, внешняя структура которого расценивалась эмбриологом как нормальная, имел поврежденную ДНК. В норме хроматин в ядре сперматозоида выглядит компактным, плотно упакованным, что защищает генетический материал от повреждающих воздействий. Высокая степень компактизации хроматина достигается за счет постепенной замены гистоновых белков на т. н. переходные (транзиторные) белки и протамины (негистоновые белки, богатые аргинином). Это начинается в процессе мейоза и продолжается вплоть до выхода спермиев из канала придатка яичка. Замену ядерных белков инициирует процесс модификации гистонов. В зрелом сперматозоиде человека на протамины приходится не менее 85% ядерных белков [38]. Те участки ДНК, которые не защищены протаминами, особенно чувствительны к различным повреждающим факторам, среди которых повышенная температура, ионизирующая радиация, острые и хронические инфекции, загрязнение окружающей среды различными токсинами, аутоиммунные реакции против сперматозоидов и др. Предполагают, что уменьшение доли протаминов делает хроматин более чувствительным к повреждающим воздействиям. По мнению авторов, фрагментация ДНК в морфологически не измененных спермиях оказывает негативное влияние и на качество эмбрионов, и на результаты ЭКо [38].
Для описания аномальной конденсации хроматина сперматозоидов некоторые исследователи используют термин «незрелый хроматин», указывая на наличие гру-богранулярного и фибриллярного компонентов в кариоплазме [22]. До сих пор остается неясным вопрос, каким образом взаимосвязаны аномалии хроматина с показателями стандартной спермограммы — концентрацией, подвижностью, морфологией сперматозоидов [39]. Неблагоприятные воздействия приводят к одноцепочеч-ным и двуцепочечным разрывам полинуклеотидной цепи ДНК. В нормальных физиологических условиях половые клетки с поврежденной ДНК разрушаются с помощью апоптоза (генетически запрограммированной клеточной гибели) вследствие активации т. н. апоптозных генов (например, р53). Существует предположение, что апоп-тоз служит конечным результатом различных патологических состояний и отражает нарушение молекулярных механизмов, контролирующих сперматогенез [40]. Но некоторое количество спермиев все же сохраняет жизнеспособность и может иметь типичные морфологические признаки, характерные для сперматозоидов с неповрежденной ДНК.
Нарушение компактизации хроматина или наличие его фрагментации могут указывать не только на морфологическую, но и на функциональную неполноценность клеток. Показано, что различные аномалии хроматина сперматозоидов оказывают серьезное влияние на нарушение репродуктивной функции. Исходя из этого, существуют достаточно веские аргументы в пользу того, чтобы включить оценку структурных нарушений хроматина сперматозоидов в качестве дополнительного критерия характеристики репродуктивной функции у мужчин, а также в алгоритм обследования при бесплодном браке и привычном невынашивании беременности в семейных парах. При этом необходимо уточнение нормальных «хроматиновых параметров» и совершенствование методов выявления отклонений от них. По некоторым данным, максимальное значение фрагментации ДНК сперматозоидов, обработанных in vitro для процедуры ЭКО, составляет 42% [38].
В научной литературе есть единичные указания на способность женской половой клетки влиять на восстановление целостности ДНК оплодотворившего ее сперматозоида [41]. Отмечается, что при значительном повреждении генетического аппарата спермия данное свойство женской половой клетки утрачивается. Неэффективное восстановление спермальной ДНК яйцеклеткой может вызвать различные мутации и врожденные аномалии развития.
Известно несколько методов выявления и исследования нарушений в структуре хроматина [38]. Например, метод CMA3 применяется для оценки дефицита протами-нов в хроматине с помощью флуоресцентной микроскопии (метод клинически значимый и высокочувствительный, но для него необходимо специальное оборудование). Другой метод основан на использовании гистологического красителя акридинового оранжевого, его рекомендуют для выявления разделения цепочек ДНК с помощью флуоресцентной микроскопии. Это простой и недорогой метод, но он не всегда позволяет четко отличить жизнеспособные сперматозоиды от нежизнеспособных. Достаточно высокочувствительный и клинически значимый метод, позволяющий объективно провести количественный анализ, это метод SCSA. С помощью проточной цитометрии он определяет чувствительность ДНК к кислотной денатурации. Но это дорогостоящий метод, который требует наличия специального оборудования. Еще один метод — высокочувствительный метод TUNEL, который позволяет выявить разрывы нити ДНК с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии. Но он, как и предыдущий, тоже требует дорогостоящего оборудования. Анализ литературы свидетельствует, что до сих пор нет единых общепринятых критериев для определения клинически значимых стандартов оценки степени фрагментации ДНК сперматозоидов и значимых пороговых уровней, что создает определенные диагностические проблемы. Несмотря на это, следует признать, что исследование фрагментации ДНК сперматозоидов и соотношения гистоновых и прота-миновых белков может оказаться полезным дополнением к рутинному анализу спермы и являться возможным прогностическим критерием для определения успеха или, наоборот, неуспеха вспомогательных репродуктивных технологий [14, 42, 43].
Женские половые клетки
Впервые созревшие вне овариального фолликула яйцеклетки человека были получены в 1939 году (Дж. Пинкус) [13]. В результате выяснилось, что вполне реально осуществить возобновление мейоза и созревание
яйцеклетки вне организма. В дальнейшем оказалось, что визуально не измененная клетка либо совсем не участвует в оплодотворении, либо эмбрион развивается аномально. Был сделан вывод о том, что нужно получать ооциты, находящиеся в созревших фолликулах Подходящими были признаны ооциты, находящиеся в метафазе второго мейотического деления (так называемая стадия мета-фазы II, или М II) [23]. Чтобы мейоз завершился, следует обеспечить непосредственное взаимодействие обеих половых клеток — ооцита и сперматозоида.
В зрелых ово-фолликулярных гистионах (ооцит-кумулюсных комплексах) ооциты находятся на стадии метафазы I-II мейоза и часто содержат полоцит — клетку, которую еще именуют направительным, редукционным или полярным тельцем [11, 31, 44]. Ооциты, полученные из яичника, помещают в специальные питательные среды, в которых строго соблюдаются стерильность, оптимальная температура, осмотическое давление [17, 45, 46]. Важную роль для сохранения гамет in vitro в жизнеспособном и функционально активном состоянии играет разработка специальных питательных сред. За несколько десятилетий развития и существования репродуктивной медицины был проделан долгий путь от использования простейших солевых растворов с добавлением экстрактов эмбриональных тканей или сыворотки крови до высокоочищенных, тщательно протестированных на наличие возбудителей инфекционных заболеваний, промышленно вырабатываемых сред, включающих все необходимые элементы — аминокислоты, соли, микроэлементы, витамины и др.
Криоконсервация женских гамет — ооцитов — в ведущих медицинских центрах, занимающихся вопросами ЭКО, в настоящее время является рутинной процедурой и характеризуется рядом технологических сложностей [3, 47-49]. Одна из возникающих при этом проблем связана с затвердеванием прозрачной оболочки — эластической гликопротеиновой структуры, выполняющей ряд важных функций. После проникновения сперматозоида в цитоплазму ооцита в последнем запускается каскад биохимических реакций, который вызывает экзоцитоз содержимого кортикальных гранул. Это, в свою очередь, модифицирует прозрачную оболочку, приводя к формированию так называемой оболочки оплодотворения, препятствующей полиспермии. Криоконсервация и последующее размораживание ооцита приводят к самопроизвольному высвобождению содержимого кортикальных гранул, затрудняя или делая вовсе невозможным последующее оплодотворение. Также следует учитывать, что ооциты в составе овулировавших овариальных фолликулов находятся в состоянии незавершенного мейоза, тонкие механизмы которого часто нарушаются криокон-сервацией, что осложняет дальнейшее оплодотворение или даже препятствует ему. Разработка новых технологий замораживания ооцитов продолжается, и есть надежда на достижение прогресса в этой области [50-52].
Криопротекторы
Половые клетки человека не содержат биологических антифризов, которые есть, например, у гусениц или бабочек. При замораживании тканевых клеток человека нарушаются кислотно-щелочное равновесие, водно-солевой и ионный баланс, меняется объем клетки. Имеются данные о том, что сохранение определенного уровня жизнеспособности клеток в переохлажденном, но не замерзшем состоянии приводит к их быстрому старению [13]. Способы криоконсервации с применением криопротекторов (КП) позволяют соматическим
и половым клеткам адаптироваться к новому состоянию. Криопротекторы стабилизируют структуру плазмолеммы, сводя к минимуму потерю веществ, растворенных в воде, уходящей из клетки вследствие дегидратации. также они снижают степень крайнего обезвоживания клетки. Путь проникновения воды и криопротекторов через клеточную мембрану может быть двояким: либо простая диффузия через билипидный слой молекул, либо диффузия через белковые водные каналы (аквапорины), встроенные в цитолемму. Особенности перемещения воды из клетки зависят от тканевой принадлежности клетки, температурного фактора, структуры цитолеммы, ее длины (т. е. от размера клетки, наличия выростов цитоплазмы — микроворсинок, жгутиков и пр.) [12, 19, 53].
До погружения в жидкий азот гаметы подвергают действию криопротекторов с целью повышения вязкости цитоплазмы и внеклеточного вещества до уровня, при котором вода быстро перейдет из жидкого состояния в твердое, не успев принять кристаллическую структуру [19]. Криопротекторы делятся на проникающие внутрь клетки и непроникающие. К проникающим относятся, например, диметилсульфоксид, многоатомные спирты — глицерин, этиленгликоль, пропиленгликоль. К непроникающим криопротекторам относятся, главным образом, различные олиго-, моно- и полисахариды — сахароза, трегалоза, фруктоза, фиколл, рафиноза и др. В качестве криопротекторов можно использовать и некоторые природные комплексные соединения, например, яичный желток и некоторые растительные полисахара [54]. Отмечается, что даже в пределах одной группы криопротекторов у них может сильно отличаться способность проникать в цитоплазму. Например, глицерин проникает через плазмолемму намного медленнее, чем диметилсульфоксид или этиленгликоль [1 9]. Некоторые ранее применявшиеся криопротекторы обладали цитотоксическими свойствами разной степени выраженности. Возможный токсический эффект того или иного криопротектора зависит не только от типа клетки, на которую он воздействует, но и от температурного фактора. У ооцитов, находящихся в стадии метафазы II, вода и криопротекторы медленно перемещаются путем диффузии через билипидный слой молекул, требуется более длительная экспозиция в КП-содержащих растворах.
также существует деление криопротекторов на витри-фицирующие и невитрифицирующие. При действии неви-трифицирующих криопротекторов клетка практически немедленно изменяет осмолярность путем потери воды и пикнотизируется. После фазы быстрого сморщивания дальнейшее поступление криопротектора в клетку замедляется, так как проницаемость плазмолеммы снижается. Практически во всех протоколах и рекомендациях отмечается важность соблюдения режима экспозиции биоматериала в растворах криопротекторов. В зависимости от типа криопротектора и биоматериала время действия невитрифицированных растворов составляет от 3 до 15 мин., а воздействие витрифицирующих крио-протекторов длится от 30 до 90 секунд [19]. В публикациях имеются многочисленные указания на то, что комбинация нескольких криопротекторов способна более эффективно предохранять замораживаемые объекты от повреждения, чем каждый из криопротекторов по отдельности. Поэтому в настоящее время выпускаются наборы, состоящие из смеси нескольких криопротекторов [8, 12, 19, 46, 53].
Современные аспекты криоконсервации гамет
Разработка эффективных методов криоконсервации гамет является задачей специалистов разных областей
знаний — эмбриологов, акушеров-гинекологов, репро-дуктологов, криобиологов, ветеринаров и др. В природе имеются примеры, когда организм животного на некоторое время впадает в состояние анабиоза. Это происходит естественным путем, например, в холодное время года, а с наступлением тепла жизнедеятельность таких организмов восстанавливается. свойством сохранять жизнеспособность при замораживании и последующем оттаивании обладают некоторые вирусы и бактерии. Гаметы и тканевые клетки млекопитающих и человека при обычном замораживании и оттаивании теряют жизнеспособность и погибают. Одной из причин этого является так называемый холодовой шок [19].
Изучением влияния сверхнизких температур на биологические объекты занимается криобиология. Замораживание биологических объектов позволяет им длительно сохраняться при температуре минус 196 °С в состоянии анабиоза, не теряя жизнеспособности, хотя при такой температуре метаболические процессы в организме сведены к минимуму, но полностью не прекращены. Несмотря на то, что теоретические основы витрификации были разработаны еще в 30-х годах ХХ века, приоритет программ замораживания отдается исследованиям Питера Мазура, который подробно изучал один из важнейших криобиологических факторов — кристаллизацию воды [55-57]. Его работы основаны на том, что вода является одним из основных химических компонентов клеток и межклеточного вещества, а у всех водных растворов существует так называемая равновесная точка замерзания — температура, при которой в них образуются кристаллы льда. Экспериментально установлено, что образование кристаллов льда инициируется и нарастает сначала в межклеточном пространстве, а кристаллы внутри клеток формируются позднее и при более низкой температуре [53, 57]. Кристаллизация воды в межклеточном пространстве ведет к обезвоживанию клеток, так как вода из клетки выходит за ее пределы и тоже кристаллизуется. Из-за обезвоживания клетка пикнотизируется, ее объем уменьшается, а концентрация микроэлементов, ионов и солей в цитоплазме снижается. Скорость обезвоживания зависит от типа клетки, ее объема, проницаемости плазмолеммы для воды и некоторых других характеристик. При этом повышается содержание молекул солевых веществ и микроэлементов в межклеточном веществе, нарушается кислотно-щелочное равновесие (рН) внутри и вне клеток, денатурируются белковые макромолекулы, что сопровождается разрушением цитолеммы и клеточных органелл. Свою лепту в разрушение клеток вносят и кристаллы внутриклеточного льда, которые образуются позднее внеклеточных ледяных кристаллов. Если проводить охлаждение слишком медленно, то клетка может погибнуть вследствие чрезмерного обезвоживания и длительной экспозиции в высококонцентрированном растворе. В случае слишком быстрого охлаждения клетка не успевает достигнуть достаточной степени обезвоживания и лишняя вода превращается во внутриклеточные кристаллы льда, которые механически травмируют все клеточных компоненты, включая плазмолемму. Исследования показали существование некой оптимальной для выживаемости клеток скорости охлаждения, которая, однако, различна для тех или иных биологических образцов. Например, для эритроцитов человека она равна 3000 °С в мин., а для ооцитов млекопитающих — около 1 °С в мин. [55].
Процедура криоконсервации включает несколько стадий: 1 — воздействие криопротектора на биоматериал, 2 — охлаждение, 3 — хранение в жидком азоте, 4 — оттаивание, 5 — возвращение в культивационную
среду. В настоящее время применяются два основных способа замораживания биоматериала — программное (медленное) замораживание и витрификация [6, 58, 59]. Программное замораживание заключается в охлаждении биологического объекта с относительно небольшой скоростью понижения температуры по специальной программе, включающей несколько стадий. При медленной программной заморозке температуру снижают постепенно, поэтому клетки проходят дегидратацию без негативных последствий и оптимально насыщаются кри-опротекторами, минимизируя формирование кристаллов льда [60]. Внутриклеточная вода выходит за пределы клетки и цитоплазма насыщается раствором криопро-тектора. Это заметно снижает точку кристаллизации. Программируемый замораживатель обеспечивает точность и постоянство физических параметров охлаждения.
термин «витрификация» («стеклование») произошел от латинского «vitreous», означающего «стеклянный; наподобие стекла». Витрификация — это сверхбыстрое охлаждение без образования внутриклеточных кристаллов льда, при этом биоматериал приобретает вид стекловидной затвердевшей структуры (нередко ее называют аморфной массой) [1 9, 61 ]. Витрифицированное (стекловидное) состояние клетка приобретает при мгновенном падении температуры ниже определенного уровня. Иными словами, витрификация обеспечивает переход внутриклеточной и межклеточной жидкости в стеклообразное (витрифицированное) состояние, при котором ледяные микрокристаллы не успевают сформироваться, что исключает механическое травмирование клеточных структур [62]. Переход раствора в аморфную твердую фазу происходит при высоких скоростях охлаждения (более 500 °С в мин.). При витрификации используются криопротекторы те же, что и при медленной заморозке [3, 28, 52]. Разные лаборатории используют различающиеся методики витрификации, отличающиеся применением различных криопротекторов, контейнеров, криосоломин, криопробирок (герметичных или открытых), методами хранения и размораживания биоматериала. Ключевая задача, которую следует решить, используя любой из возможных методов витрификации — создание и поддержание условий, которые исключают образование внутриклеточного льда как при охлаждении, так и при оттаивании биологического материала. При разработке и практическом использовании того или иного витрифи-кационного протокола следует учитывать проницаемость плазмолеммы гамет для воды и криопротекторов, пути проникновения их в цитоплазму, размеры и структуру клетки, а также скорость охлаждения и оттаивания. Недостаточно длительная экспозиция биоматериала в растворах криопротекторов, малая концентрация крио-протекторов, неправильно подобранные скорость охлаждения и скорость оттаивания могут способствовать образованию внутриклеточных кристаллов льда и в конечном итоге привести к гибели гамет. Экспериментальным путем установлено, что превращение биологического материала в стекловидную массу достигается только при быстром снижении температуры ниже уровня перехода воды в витрифицированное состояние [19].
В методике витрификации гамет применяются открытые (негерметичные, неасептические) или закрытые (герметичные, асептические) носители биоматериала. Использование неасептических носителей (систем), при котором гаметы непосредственно соприкасаются с жидким азотом, несет в себе риск перекрестного инфицирования (микробной контаминации) клеток и возможность их загрязнения, поэтому требуется обязательно стерилизовать жидкий азот (с помощью УФО или
фильтрования), либо хранить носители только в парах жидкого азота. Использование герметичных носителей биоматериала исключает возможность микробной контаминации при контакте с жидким азотом, но заметно снижает скорость охлаждения, увеличивая вероятность образования ледяных внутриклеточных кристаллов при недостаточной концентрации криопротекторов, усложняет ряд других манипуляций. Чем быстрее клетка проходит зону так называемого температурного риска образования кристаллов льда, тем более эффективной будет витрификация [63, 64].
Таким образом, криоконсервационная технология направлена на предупреждение образования кристаллов льда в клетке, которые могут разрушить ее структуру и привести к гибели. Клетка сохранит свою жизнеспособность, если удастся избежать образования внутриклеточных ледяных кристаллов, достигнуть витрификации (превращение клеточного содержимого в твердую стекловидную массу) при охлаждении, поддержать это физическое состояние при оттаивании. Единого общепринятого протокола витрификации не существует, но во всех технологических рекомендациях обязательным является постепенное снижение температуры: сначала температура биообъекта понижается в течение нескольких минут примерно до 0 °С, потом объект охлаждают парами жидкого азота до минусовой температуры (несколько десятков градусов ниже ноля), затем опускают в жидкий азот, где в специальных криосоломинах, криофлаконах или криопробирках хранят до времени использования, которое может составлять до одного года и более. Если сразу поместить замораживаемый биологический объект в жидкий азот, то процессы, необходимые для сохранения жизнеспособности клеток, не успеют произойти [13, 65]. В многочисленных литературных источниках подчеркивается, что витрификационный протокол можно считать успешно проведенным, если он обеспечивает как минимум три условия: оптимальную дегидратацию клеток при экспозиции с растворами криопротекторов; отсутствие цитотоксического действия применяемых растворов; достаточную концентрацию криопротекторов для перехода цитоплазмы в стекловидное состояние [8, 24, 59, 60]. Между тем, многие авторы подчеркивают, что технологии витрификации характеризуются отличительными особенностями в различных медицинских учреждениях (как государственных, так и частных) из-за разнообразия моделей оборудования, выпускаемого разными производителями, различия в рецептуре растворов и культивационных сред [1 8, 66]. В профессиональном сообществе продолжаются споры о преимуществах того или иного типа жидкого азота, имеются разночтения в вопросах безопасной деятельности витрификационных лабораторий и процедур. Несмотря на это, в настоящее время практически все специалисты признают, что витрификация является наиболее эффективным методом криоконсервации биоматериала, в особенности это касается ооцитов и эмбрионов [11, 13, 67].
Не менее важной для сохранения жизнеспособности клеток и выхода их из состояния анабиоза является процедура оттаивания, в ходе которой следует избегать перекристаллизации воды. Основной причиной крио-травмы при оттаивании гамет (ооцитов и сперматозоидов) является агрегация кристаллов льда, вызывающая гибель половых клеток, поэтому следует внимательно относиться к тому, чтобы криоконсервация и размораживание половых клеток осуществлялись с соблюдением всех необходимых требований [68]. В среднем, около 65% сперматозоидов после криоконсервации и размо-розки могут дать начало новой беременности [19]. Что
касается ооцитов, то большинство авторов не склонны рассматривать криоконсервацию в качестве оптимального метода их сохранения в связи с низкой частотой встречаемости жизнеспособных женских половых клеток после их оттаивания, составляющей лишь 5-10% [13, 23, 32, 69, 70].
Оттаивание, как и замораживание, бывает быстрым и медленным. Авторы указывают, что в случае медленного замораживания клеток их нужно оттаивать медленно (до 20 °С в мин.), а если замораживание было быстрым, то и оттаивание должно быть быстрым (от 300 до 2500 °С в мин.) [56]. Оптимальная скорость понижения температуры при криоконсервации мужских гамет составляет от 1 до 10 °С в мин. [17]. Отклонение от этих величин ухудшает выживаемость сперматозоидов. Сохранение подвижности у 60-65% гамет считается вполне приемлемым результатом. Подвижность сперматозоидов имеет важное, но не единственное значение в оценке их функциональной активности. Эти клетки должны обладать еще некоторыми свойствами, например, пройти капацитацию и приобрести оплодотворяющую способность.
Определенный практический интерес вызывают исследования состояния клеток и их структур, происходящие непосредственно в ходе замораживания и оттаивания (динамическое наблюдение), и сравнительная оценка реактивного состояния гамет до криоконсервации и после нее (так называемое статическое наблюдение). С помощью флуоресцентного микроскопа и витальных (прижизненных) красителей (флуорохромов, например, ФДА — диацетат флуоресцеина) можно достаточно быстро оценить жизнеспособность половых клеток после криоконсервации. Окрашивание гамет витальным красителем ФДА совместно с иодистым пропидием позволяет при помощи флуоресцентного микроскопа увидеть как живые, так и погибшие половые клетки [53]. Другой метод — криомикроскопия — позволяет бесконтактно изучать замороженные клетки. Иногда его используют в комбинации с другими методами — КРС (спектроскопия комбинационного рассеяния света) или ДРС (дифференциальной сканирующей калориметрией) [57].
В работе С.Я. Амстиславского и соавт. подробно рассмотрены особенности применения криоконсер-вации гамет и эмбрионов для создания криобанков
ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]:
1. Полякова М.В. Криоконсервация сперматогониальных стволовых клеток: возможности клинического применения для сохранения фертиль-ности у пациентов предпубертатного возраста. Журнал медико-биологических исследований 2017; 5(3): 33-42. [Polyakova M.V. Cryopreservation of spermatogonialny stem cells: possibilities of clinical application for preserving of fertility for patients of prepuberty age. Magazine of medicobiological researches 2017; 5(3): 33-42].
2. Никитин А.И. Вредные факторы среды и репродуктивная система человека. СПб: ЭЛБИ-СПб, 2008 [Nikitin A.I. Harmful factors of the environment and reproductive system of the person. SPb: ELBI-SPb, 2008].
3. Silber S.J., De Rosa M., Goldsmith S., et al. Cryopreservation and transplantation of ovarian tissue: results from one center in the USA. J. Assist. Reprod. Genet. 2018; 35: 2205-13.
4. Бесплодный брак. Современные подходы к диагностике и лечению. Под ред. В.И. Кулакова. М.: ГЭОТАР-Медиа. 2006 [Fruitless marriage. Modern approaches to diagnostics and treatment. Under the editorship of V.I. Kulakov. M.: GEOTAR-media, 2006].
5. Демкина Е.А. Правовой статус криоконсервированных эмбрионов. Вестник Саратовской государственной юридической академии 2016; 3(110): 33-6 [Demkina E.A. Legal status of cryotinned embryos. Bulletin of the Saratov state legal academy 2016; 3(110): 33-6].
6. Лечение женского и мужского бесплодия. Вспомогательные репродуктивные технологии. Под ред. В.И. Кулакова. М.: МИА. 2005 [Treatment of female and male infertility Auxiliary reproductive technologies. Under the editorship of V.I. Kulakov. M.: MIA, 2005].
7. Argyle C.E., Harper J.S. Oocyte cryopreservation: where are we now? Hum. Reprod. Update. 2016; 22: 440-9.
8. Son W.Y. Immature oocyte for fertility preservation. Front Endocrinol. 2019; 10: 464.
лабораторных животных, имеющих редкие мутации или нокаутные гены, что имеет большое значение для экспериментальных исследований генетических заболеваний [53]. Особое внимание авторами уделено рассмотрению механизмов криоповреждений и криозащиты при замораживании и витрификации, а также обсуждению возникающих при этом проблем и перспективам их преодоления. Подчеркивается, что главной задачей при работе эмбриологов и репродуктологов с гаметами является поддержание необходимых половым клеткам физиологических условий и минимизирование стрессовых отклонений от них.
На примере изучения структурно-функционального состояния ооцитов млекопитающих показано преимущество криоконсервации свежевыделенных ооцитов в составе ооцит-кумулюсных комплексов по сравнению с ооцитами, созревшими в культивационной среде [71]. Также показано, что витрификация приводит к некоторым изменениям архитектоники цитоскелета женских гамет: промежуточные микрофиламенты разрушаются, а тубу-линовые микротрубочки сохраняют свою структуру [72].
Заключение
Таким образом, современное понимание технологии криоконсервации основано на многочисленных экспериментальных исследованиях специалистов разного профиля — физиков, химиков, биологов, гистологов, эмбриологов, репродуктологов и др. За прошедшие несколько десятилетий удалось достигнуть существенного прогресса в понимании механизмов криоповреж-дения и криозащиты гамет. Благодаря новым технологическим открытиям и приемам, усилию и энтузиазму ученых-первопроходцев, их последователей и учеников — эмбриологов, гинекологов, генетиков, эндокринологов, объединивших свои усилия на основе взаимодействия и взаимопонимания, репродуктивная медицина и ее технологии продолжают успешно развиваться. Дальнейшая разработка и внедрение в клиническую практику надежных методов криоконсервации половых клеток является одной из наиболее актуальных задач современной репродуктивной медицины, направленной на преодоление бесплодия.
9. Baer K.E. De ovi mammalium et hominis genesi. Leipzig. 1827.
10. Baer K.E. Uber Entwickelungsgeschichte der Thiere: Beobachtung und Reflexion. Erster Theil, mit 3 col. Kupfertaf. Königsberg. 1828; 12: 271.
11. Руководство по гистологии. Под ред. Р.К. Данилова. СПб.: СпецЛит. 2011; 2: 336-508 [Guide to histology. Under the editorship of R.K. Danilov. SPb.: Special letter 2011; 2: 336-508].
12. Abdelhafez F., Desai N., Ali M. et al. Oocyte cryopreservation: a technical and clinical update. Expert Rev. Obstet. Gynecol. 2009; 4: 443-54.
13. Балахонов А.В. Преодоление бесплодия. СПб. 1999 [Balakhonov A.V. Overcoming infertility. SPb. 1999].
14. Lusignan M.F., Li X., Herrero B., et al. Effects of dfferent cryopreservation methods on DNA integrity and sperm chromatin quality in men. Androl. 2018; 6: 829-35.
15. Mortimer D. The functional anatomy of the human spermatozoon: relating ultrastructure and function. Mol. Hum. Reprod. 2018; 24: 567-92.
16. Gu N.H., Zhao W.L., Wang G.S. et al. Comparative analysis of mammalian sperm ultrastructure reveals relationships between sperm morphology, mitochondrial functions and motility. Reprod. Biol. Endocrinol. 2019; 17: 1-12.
17. Белоус А.М., Гриценко В.И., Паращук Ю.С. Криоконсервация репродуктивных клеток. Киев: Наукова думка 1986 [Belous A.M., Grit-senko V.l., Parashchuk Yu.S. Kriokonservation of reproductive cages. Kiev: Naukova thought 1986].
18. История ЭКО в России. Под общей редакцией А.И. Никитина и М.Б. Аншиной. М. 2011 [History IVF in Russia. A.I. Nikitin and M.B. Anshi-na's general edition. M, 2011].
19. Культивирование эмбрионов и организация лаборатории ЭКО: практическое руководство. Ред. Варгхесе А., Шеблум П., Джаяпраксан К. М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2019 [Cultivation
of embryos and organization of IVF laboratory: practice guidance. Edition to Vargkhesa A., Sheblum P., Dzhayapraksan K. M.: LLC Medical News Agency, 2019].
20. Steptoe P.C., Edwards R.G. Birth after the reimplantation of a human embryo. Lancet 1978; 2: 366.
21. Vajta G., Rienzi L., Yovich J. Embryo culture: can we perform better than nature? Reprod. Biomed. 2010; 20: 453-69.
22. Брагина Е.Е., Абдумаликов Р.А., Курило Л.Ф. и др. Электронно-микроскопическое изучение сперматозоидов и его роль в диагностике мужского бесплодия. Проблемы репродукции 2000; 6(6): 62-71 [Bragina E.E., Abdumalikov R.A., Smoked L.F. et al. Electronic and microscopic studying of spermatozoa and its role in diagnosis of male infertility. Problems of a reproduction 2000; 6(6): 62-71].
23. McLaughlin M., Albertini D.F., Wallace W.H.B. et al. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multistep culture system. Mol. Hum. Rep. 2018; 24(3): 135-42.
24. Bavister B.D. Early history of in vitro fertilization. Rep. 2002; 124: 181-96.
25. Edwards R.G., Bavister B.D., Steptoe P.C. Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro. Nature 1969; 221: 632-5.
26. Yanagimachi R., Chang M.C. Fertilization of hamster eggs in vitro. Nature 1963; 200: 281-2.
27. Harrison R. Observation on the living developing nerve fiber. Anat. Rec. 1907; 1: 116-28.
28. Tefler E.E. Fertility preservation: progress and prospects for developing human immature oocytes in vitro. Rep. 2019; 158: 45-54.
29. Skibinska I., Andrusiewicz M., Soin M. et al. Increased expression of PELP1 in human sperm is correlated with decreased semen quality. Asian J. Androl. 2018; 20: 425-31.
30. Wu B., Gao H., Liu C. et al. The coupling apparatus of the sperm head and tail. Biol. Reprod. 2020; 102: 988-98.
31. Tefler E.E. Future development: in vitro growth (IVG) of human ovarian follicles. Acta Obstet. Gynecol. Scand. 2019; 98: 653-8.
32. Nikiforov D., Junping C., Cadenas J. et al. Improving the maturation rate of human oocytes collected ex vivo during the cryopreservation of ovarian tissue. J. Assist Reprod. Genet. 2018; 35: 2205-13.
33. Dai D.H., Qazi I.H., Ran M.X. et al. Exploration of miRNA and mRNA profiles in fresh and frozen-thawed boar sperm by transcriptome and small RNA sequencing. Int. J. Mol. Sci. 2019; 20: 802.
34. Roldan E.R. Sperm competition and the evolution of sperm form and function in mammals. Reprod. Domest. Anim. 2019; 54: 14-21.
35. Руднева С.А., Брагина Е.Е., Арифулин Е.А. и др. Фрагментация ДНК в сперматозоидах и ее взаимосвязь с нарушением сперматогенеза. Андрология и генитальная хирургия 2014; 4: 26-33 [Rudneva S.A., Bragina E.E., Arifulin E.A., et al. Fragmentation of DNA in spermatozoa and its interrelation with violation of a spermatogenesis. Andrology and genital surgery 2014; 4: 26-33].
36. De Almeida Fereira Braga D.P., Setti A.S., Figueira R.S. et al. Sperm organelle morphologic abnormalities: contributing factors and effects on intra-cytoplasmic sperm injection cycles outcomes. Urology 2011; 78(4): 786-91.
37. Pedrix A., Travers A., Chelli M.H. et al. Assessment of acrosome and nuclear abnormalities in human spermatozoa with large vacuoles. Hum. Reprod. 2011; 26(1) 47-58.
38. Божедомов В.А., Липатова Н.А., Спориш Е.А. и др. Роль структурных нарушений хроматина и ДНК сперматозоидов в развитии бесплодия. Андрология и генитальная хирургия 2012; 3: 82-92 [Bozhe-domov V. A., Lipatova N.A., Sporish E.A. et al. A role of structural violations of chromatin and DNA of spermatozoa in development of infertility. Andrology and genital surgery 2012; 3: 82-92].
39. Cohen-Bacrie P., Belloc S., Menezo Y.J. et al. Correlation between DNA damage and sperm parameters: a prospective study of 1633 patients. Fertil. Steril. 2009; 91(5): 1801-05.
40. Karabulut S., Demiroglu-Zergerogl A., Yilmaz E. et al. Effects of human sperm cryopreservation on apoptotic markers in normozoosper-mic and non-normozoospermic patients. Zygote 2018; 26: 308-13.
41. Meseguer M., Santiso R., Garrido N. et al. Effect of sperm DNA fragmentation on pregnancy outcome depends on oocyte quality. Fertil. Steril. 2011; 95(1): 124-8.
42. Li S., Ao L., Yan Y. et al. Dfferential motility parameters and identification of proteomic profiles of human sperm cryopreserved with cryostraw and cryovial. Clin. Proteom. 2019; 16: 24.
43. Zabeo D., Heumann J.M., Schwartz C.L. et al. A luminal interrupted helix in human sperm tail microtubules. Sci. Rep. 2018; 8: 1-11.
44. Anderson R.A., Baird D.T. The development of ovarian tissue cryopreservation in Edinburg: translation from a rodent model through in a large mammal and then into clinical practice. Acta Obstet. Gynecol. Scand. 2019; 98: 545-9.
45. Балахонов А.В. Ошибки развития. СПб: ЭЛБИ-СП. 2001 [Balak-honov A.V. Development errors. SPb: ELBI-SP, 2001].
46. Trounson A., Gardner D.K. Handbook of in vitro fertilization. Victoria, Australia 1993.
47. Gellert S.E., Pors S.E., Kristensen S.G. et al. Transplantation of frozen-thawed ovarian tissue: an update on worldwide activity published in peer-reviewed papers and on the Danish cohort. J. Assist Reprod. Genet 2018; 3: 561-70.
48. Rienzi L, Gracia C, Maggiulli R. et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Hum. Rep. Update 2017; 23: 139-55.
49. Andersen C.Y., Kristensen S.G., Greve T. et al. Cryopreservation of ovarian tissue for fertility preservation in female young oncological patients. Future оп^1. 2012; 8: 595-608.
50. Fasano G., Dechene J., Antonacci R., et al. Outcomes of immature oocytes collected from ovarian tissue for cryopreservation in adult and prepubertal patients. Rep. Biomed. 2017; 34: 575-82.
51. Donnez J., Dolmans M.M. Fertility preservation in women. N. Engl. J. Med. 2017; 377: 1657-65.
52. Yding Andersen C., Mamsen L.S., Kristensen S.G. Fertility preservation: freezing of ovarian tissue and clinical opportunities. Rep. 2019; 158: 27-34.
53. Амстиславский С.Я., Брусенцев Е.Ю., Окотруб К.А. и др. Криоконсервация эмбрионов и гамет для сохранения генетических ресурсов лабораторных животных. Онтогенез 2015; 46(2): 67-81 [Ams-tislavsky S.Ya., Brusentsev E.Yu., Okotrub K.A. et al. A cryopreservation of embryos and gametes for preserving of genetic resources of laboratory animals. Ontogenesis 2015; 46(2): 67-81].
54. Luyet B.J. The vitrification of organic colloids and protoplasm. Biody-namica 1937; 29: 1-14.
55. Mazur P. Cryobiology: the freezing of biological systems. Science 1970; 168: 939-949.
56. Mazur P. Equilibrium, quasi-equilibrium, and nonequilibrium freezing of mammalian embryos. Cell Biophys. 1990; 17: 53-92.
57. Mazur P., Leibo S.P., Seidel G.E. Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: importance, impact, status, and future directions. Biol. Reprod. 2008; 78: 2-12.
58. Руководство по клинической эмбриологии. Сделано в МЦРМ. Под ред. В.С. Корсака. М.: Издательство медицинских книг 2011 [Guide to clinical embryology. It is made in MTsRM. Under the editorship of V.S. Kor-sak. M.: Publishing house of medical books, 2011].
59. Berkovitz A., Miller N., Silberman M. A novel solution for freezing small numbers of spermatozoa using a sperm vitrification devise. Human reproduction 2018; 33(11) 1975-983.
60. Stehlik E., Stehlik J., Katayama K.P. et al. Vitrification demonstrates significant improvement versus slow freezing of human blastocysts. Reprod. Biomed. 2005; 1: 53-7.
61. Жмакин А.И. Физические основы криобиологии. Успехи физических наук 2008; 178(3): 243-66 [Zhmakin A.I. Physical bases of a cryobiology. Achievements of physical sciences 2008; 178(3): 243-66].
62. Kuleshova L.L., Shaw J.M. A strategy for rapid cooling of mouse within a double straw to eliminate the risk of contamination during storage in liquid nitrogen. Hum. Reprod. 2000; 15: 2604-9.
63. Kuwayama M., Vajta G., Kato O. et al. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reprod. Biomed. 2005; 11: 300-8.
64. Leonel ECR et al. Stepped vitrification technique for human ovarian tissue cryopreservation. Sci. Rep. 2019; 9: 1-12.
65. Kuwayama M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: the Cryotop method. Theriogenology 2007; 67(1): 73-80.
66. Medeiros C.M.O., Forell F., Oliveir A.T.D. et al. Current status of sperm cryopreservation: why isnt it better? Theriogenology 2002; 57: 327-44.
67. Pomeroy K.O., Harris S., Conaghan J. et al. Storage of cryopreserved reproductive tissues: evidence that crosscontamination of infectious agents is a negligible risk. Fertil. Steril. 2010; 94: 1181-8.
68. Белоус А.М., Гриценко В.И. Криобиология. Киев: Наукова думка 1994 [Belous A.M., Gritsenko V.I. Kriobiologiya. Kiev: Naukova thought, 1994].
69. Cobo A., Romero J.L., Perez S. et al. Storage of human oocytes in the vapor phase of nitrogen. Fertil. Steril. 2010; 94: 1903-7.
70. Cobo A., Vajta G., Remohi J. Vitrification of human mature oocytes in clinical practice. Reprod. Biomed. 2009; 19(Suppl. 4): 4385.
71. Shapira M., Raanani H., Barshack I. et al. First delivery in a leukemia survivor after transplantation of cryopreserved ovarian tissue, evaluated for leukemia cells contamination. Fertility and Sterility 2018; 109: 48-53.
72. Денисенко В.Ю., Кузьмина Т.И. Освобождение Са2+ из внутриклеточных депо растущих и завершивших фазу роста нативных и девитрифицированных ооцитов свиней. Российский физиологический журнал имени И.М. Сеченова 2012; 98(7): 890-8 [Denisenko V.Yu., Kuzmina T.I. Release of Sa2+ from intracellular depots of the native and devitrifitsirovanny oocytes of pigs growing and finished a growth phase. The Russian physiological magazine of I.M. Sechenov 2012; 98(7): 890-8].
