CC BY
17
BÍCHHK Украгнсъког медичног стожатологЬчног академИ'
УДК 615.252.349.7
КОРРЕКЦИЯ СВОЙСТВ МЕМБРАНЫ ЭРИТРОЦИТОВ КРЫС С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ С ПОМОЩЬЮ ЭКСТРАКТА ИЗ МИДИЙ
Шумейко А.Г., Овсянникова Т.Н., Забелина И.А., Буркина B.C., Тишко Д.Н.
Высшее государственное учебное заведение Украины "Украинская медицинская стоматологическая академия"
Изучались структурно-функциональные характеристики эритроцитов крыс с экспериментальным сахарным диабетом 2 типа и при использовании различных коррегирующих средств: метформина, экстракта из мидий черноморских. Определены показатели динамики кислотного гемолиза и индекс формы (на агрегометре-фотометре Shapemeter-01B), уровень продуктов пере-кисного окисления липидов эритроцитов (спектрофотометрически), изготовлены трехмерные снимки эритроцитов с помощью цифрового голографического интерференционного микроскопа. Установлен положительный эффект применения метформина и экстракта из мидий при СД 2 типа, что может быть основой для разработки схем внедрения комплекса в клинике, как позволяющего снизить дозу метформина при терапии данной патологии.
Ключевые слова: мембрана,эритроцит,диабет,экстракт,мидия.
Механизмы трансформации эритроцитов при сахарном диабете 2 типа (СД 2 типа) обусловлены структурной дезорганизацией липидов и белков мембраны клеток, нарушениями белок-липидных взаимодействий, изменением динамических свойств липидных молекул, нарушением функций катион-транспортных систем клеток, увеличением содержания внутриклеточного кальция, гликозилированием гемоглобина и белков мембраны, активацией процессов пере-кисного окисления липидов и истощением системы антиокислительной защиты эритроцитов [5,6].
Нарушения структурно-метаболического статуса эритроцитов периферической крови приводят к изменению формы клеток и их поверхностной архитектоники. У людей с СД 2 типа, количество двояковогнутых дискоцитов оказалось ниже их содержания у здоровых лиц. У больных также регистрировалось выраженное возрастание процентного содержания дискоцитов с одним и множественными выростами, с гребнем, эритроцитов в виде тутовой ягоды, сферических, куполообразных эритроцитов и клеток в виде спущенного мяча. Исследование поверхностной топографии эритроцитов с СД 2 типа позволило установить, что лишь 79% клеток представлено эритроцитами в форме двояковогнутого диска [8].
Структурные и функциональные особенности эритроцита, а также доступность его исследования, делают эритроцит чрезвычайно удобной моделью для оценки состояния организма при патологии.
Целью наших исследований было: во-первых, установить характер изменений структурно-функциональных свойств мембран эритроцитов при СД 2 типа; во-вторых, выяснить возможность использования изучаемых показателей для оценки развития патологии; в-третьих, предложить способы коррекции свойств эритроцитов при СД 2 типа с комплексным применением антидиабетического препарата метформина и вещества природного происхождения. В каче-
стве последнего был выбран экстракт из мидии черноморской (Mytilus galloprovincialis Lam.). В его составе идентифицированы 20 аминокислот, в том числе, все незаменимые, эссенциальные жирные кислоты, микроэлементы и витамины А, Е, С, U. Большинство компонентов экстракта могут служить субстратами для ресинтеза поврежденных клеточных структур при диабете. Кроме того, ранее были показаны антиоксидантные свойства данного экстракта [3].
Материалы и методы исследования
Исследования проводились на половозрелых крысах-самцах линии Вистар с экспериментальным СД 2 типа. Была использована липидно-стрептозотоциновая модель СД 2 типа, воспроизведенная под руководством профессора Пол-торак В.В. на базе лаборатории патофизиологии и медицинской генетики Института проблем эндокринной патологи им.В.Я.Данилевского АМН Украины (г.Харьков). Животные были разделены на 5 групп: контрольная группа (К) получала нормальный рацион вивария (12 % калорий составляли жиры). Диабетические группы (Д1, Д2, Д3, Д4) содержались на высоко-жировой диете (40 % калорий составляли жиры) в течение 3-х недель, после чего им был введен стрептозото-цин (СТЦ, 50 мг/кг массы тела, внутрибрюшин-но). Животные группы Д2 получали экстракт из мидий (0,4 г/кг массы тела, per os) с 28-го по 38-й дни эксперимента. Животные группы Д3 получали метформин (0,05 г/кг массы тела, per os) с 28-го по 38-й дни эксперимента. Животные группы Д4 получали экстракт из мидий в сочетании с метформином (в вышеприведенных дозах) с 28-го по 38-й дни эксперимента. Контроль и группа Д1 получали плацебо.
Кровь забирали с антикоагулянтом (гепарин) после декапитации животных, трижды отмывали 10-кратным объемом физиологического раствора (0,15 М NaCl на 5 мМ трис-НС1, рН 7,4) с центрифугированием на центрифуге ОПН-3 при 3000 g в течении 3 минут. Плазму и лейкоцитарную пленку методом аспирации. Полученную
суспензию эритроцитов использовали для изучения динамики кислотного гемолиза [11], определения уровня продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) [1,4], а также - для исследования трехмерной морфологии эритроцитов (использовались мазки крови на стеклянных подложках) с помощью цифрового голографиче-ского интерференционного микроскопа [12].
Содержание первичных продуктов ПОЛ - диеновых (ДК), триеновых (ТК), оксодиеновых (ОДК) и тетраеновых конъюгатов (ТЕТ) жирных кислот и малонового диальдегида (МДА) измеряли спектрофотометрически. Расчет концентраций производился на 1 мл суспезии отмытых от плазмы эритроцитов с использованием коэффициентов молярной экстинкции, исключение составляли ТЕТ, для которых его величина не определена.
Все данные были обработаны статистически, разница показателей между группами оценивалась с помощью t-критерия Стьюдента и непа-
Содержание продуктов ПОЛ в з
раметрическими методами.
Результаты и обсуждение
Изменение свойств липидного матрикса, образование межмолекулярных липид-липидных и липид-белковых сшивок при хронической гипергликемии во многом связано с активацией ПОЛ. При СД 2 типа к тому же регистрируются выраженные нарушения в системе антиокси-дантной защиты, которые проявляются в том числе, и в изменении процессов тиолдисуль-фидного обмена [9]. Поэтому представляло интерес измерить уровень прооксидантных компонентов в эритроцитах крыс при диабете.
Как видно из данных, представленных в таблице 1, в группах крыс с модельным СД 2типа количество продуктов ПОЛ меньше, чем в контрольной группе. Исходя из полученных нами результатов и данных литературы, это может быть связано с несколькими причинами.
Таблица 1
юцитах крыс с модельным сахарным диабетом, Х±вх, п=6+9
Группы Продукты ПОЛ
ДК ТК ОДК ТЕТ МДА
Контроль 110,44±13,88 62,72±12,80 106,22±12,80 1,92±0,43 3,21±0,31
Сахарный диабет 58,96±17,40* 54,23±13,08 81,26±13,08* 1,43±0,36 4,32±0,37*
* - достоверно относительно контроля, р<0,05.
Прежде всего, вероятно, истощен пул полиненасыщенных жирных кислот - субстратов процесса. К тому же, первичные продукты могут переходить в более поздние - вторичные (МДА) и конечные (шиффовы основания). Данные литературы не позволяют сделать достаточно обоснованный вывод о затухании свободноради-кальных процессов в условиях модельного СД. Полученные нами результаты, показывающие некоторое повышение уровня МДА, делают правомерным вывод о переходе первичных продуктов ПОЛ во вторичные и, возможно, конечные. Как бы то ни было, ясно, что жирнокислотный состав эритроцитарной мембраны в условиях СД 2 типа изменен, поэтому устойчивость мембраны к действию гемолитических факторов также должна снизиться.
Нами была изучена динамика кислотного гемолиза эритроцитов экспериментальных живот-
Показатели
ных с помощью метода учитывания кинетики гемолиза на приборе агрегометр-фотометр 8Иарете1ег-01В. Принцип метода заключается в регистрации абсорбции суспензии отмытых эритроцитов. Измерения проводятся в условиях перемешивания клеток до и после добавления гемолитика. Изменение оптических свойств исследуемой системы происходит в процессе гемолиза за счет уменьшения общей рассеивающей поверхности клеток в результате их разрушения. Оптический сигнал после прохождения через высокочастотный фильтр дает два сигнала, основной оптический сигнал и второй сигнал, соответствующий флуктуациям основного сигнала. Второй сигнал усиливается в 20 — 30 раз. Амплитуда флуктуаций рассматривается как форма клеток. Оба сигнала обрабатываются программным обеспечением компьютера.
Таблица 2
имики гемолиза эритроцитов крыс с СД 2 типа, Х±вх, п=6+9
Условия эксперимента, группа Скорость гемолиза (tg A х 103 ) LAG - период (dT, сек) Индекс формы эритроцитов %
Контроль 2,54±016 143,9± 2,85 100
Диабет, Д1 3,05±0,25 106,51±3,8* 45
Диабет + экстракт из мидий, Д2 2,22±015 162,46±1,35* 88
Диабет + метформин, Д3 2,6±0,24 140,39±1,92 77
Диабет + экстракт из мидий + метформин, Д4 1,9±0,30 141,13±3,86 92
** - достоверно относительно контроля, р<0,05
В1СНИК Украгнсъког медичног стожатологЬчног академш
Как видно из данных таблицы 2, устойчивость эритроцитарной мембраны при СД 2 типа снижается, что выражается в тенденции к увеличению скорости гемолиза, уменьшении лаг-периода (р<0,05) по сравнению с контролем, и, в конечном итоге, все это приводит к преобладанию сфероцитов в популяции лимфоцитов диабетических крыс, не получавших никаких корре-гирующих средств (группа Д1). На последний факт указывает величина индекса сферичности клеток, рассчитанная двумя способами: по эритрограммам, полученным на агрегометре-фотометре (см. табл. 2), а также с помощью цифрового голографического интерференционного микроскопирования (см. табл. 3). В первом случае за 100 процентов принят индекс формы, который наблюдался в контрольной группе и отвечал дискоидному состоянию эритроцита; во втором случае, наоборот, за 1 принят индекс формы, который отвечал сфероидному состоянию эритроцита.
Применение различных способов коррекции патологии приводит к положительной динамике пула эритроцитов и улучшению устойчивости их мембран, правда, в разной степени. Как видно из данных таблицы 2, по совокупности показателей динамики гемолиза эритроцитов наиболее приближены к значениям контроля эритроциты группы Д3 (СД 2 типа + метформин). В группе животных, получавших экстракт из мидий в сочетании с метформином (Д4), имеется тенденция к снижению скорости гемолиза по сравнению с контролем, но лаг-период одинаков с контролем. В группе Д2 (СД + экстракт из мидий) значительно длиннее по сравнению с контролем лаг-период, тогда как скорость гемолиза близка к контрольной. Вместе с тем, по показателям индекса формы наиболее близки к контролю эритроциты группы Д4 (комплекс меформина с экстрактом из мидий).
Из данных результатов можно сделать выводы об изменении под действием различных корректоров при СД 2 типа структуры мембран эритроцитов и их цитоскелета в целом с учетом процессов, происходящих в эритроците при СД 2 типа. Течение патологии характеризуется количественными и качественными изменениями липидного спектра мембраны эритроцитов; повышением микровязкости глубоких и модификацией наружных слоев мембраны, нарушением белок-липидных взаимодействий; уменьшением содержания спектрина при возрастании количества белков фракций 7,8 и агрегированного материала в мембране. Степень выраженности
изменений структурно-метаболического статуса и функциональных свойств эритроцитов при СД 2 типа зависит от уровня метаболической компенсации, длительности течения патологического процесса. Наряду с этим, повышенное глико-зилирование белков мембраны эритроцитов сопровождается нарушениями их третичной структуры, в том числе разрывом дисульфидных связей и экспонированием сульфгидрильных групп наружу, изменением белок-липидных взаимодействий, что в конечном итоге может привести к гемолизу эритроцитов [5,6,7,10]. Получение животными метформина устраняет гипергликемию и снижает степень гликозилирования белков мембраны эритроцита, делая мембрану более эластичной. Но максимальную эластичность (о чем свидетельствует снижение скорости гемолиза и индекс формы) эритроциты приобретают при комплексной коррекции сахаросни-жающим препаратом и экстрактом из мидий. Последний, вероятно, снимает действие окси-дативного стресса при СД 2 типа, повышая эффективность антиоксидантных систем эритроцита за счет высокого уровня аминокислот с тио-ловыми группами в своем составе, восстанавливая утраченные мембраной полиненасыщенные жирные кислоты, которыми также богат.
Качественной иллюстрацией сделанных выводов являются голографические фотографии эритроцитов, полученные с помощью цифрового интерференционного микроскопа, представленные в таблице 3.
На фотографиях видно, что при СД 2 типа эритроциты крыс утрачивают свою дискоид-ность, приближаясь по форме к сфероцитам. Применение на фоне диабета различных метаболических корректоров «исправляет» картину, причем, животные, получавшие экстракт из мидий, как сам по себе, так и в комбинации с метформином, имеют по форме даже более совершенные диски, чем в контроле.
Все сделанные в данной работе наблюдения указывают на то, что в гетерогенном пуле эритроцитов при СД 2 типа изменению подвергаются прежде всего старые клетки, более склонные к гемолизу, чем молодые [2]. Кроме того, возможно, при СД 2 типа наряду со структурно-функциональными изменениями мембраны клеток, уменьшается время жизни эритроцита. Применение исследуемых корректоров благоприятно действует на структурно-функциональные показатели красных кровяных клеток.
Таблица 3
Характеристика формы и индекса сферичности эритроцитов крыс при коррекции СД 2 типа по данным цифрового голо-
графического интерференционного микроскопирования
Группа
Контроль
Диабет+ метфор-мин
К сферичности = 0,8
К сферичности =0,8
Диабет
Диа-бет+мет-фор-мин+ экстракт из мидий
К сферичности =0,48
К сферичности = 1,061
Диабет +экстракт из мидий
Примечание.
Шкала на фотографиях не несет информации о масштабе клеток, а относится к окуляру микроскопа. Невозможность ее ликвидации на фото относится к мелким недостаткам метода.
К сферичности = 0,45
Таким образом, полученные в модельном эксперименте на животных результаты позволяют сделать следующие выводы:
1. Сахарный диабет 2 типа приводит к изменению структуры эритроцита, меняется его архитектоника, снижается эластичность, что препятствует выполнению клеткой функции газотранспортировки.
2. Применение для терапии СД 2 типа метформина при водит к коррекции выявленных нарушений.
3. Получение животными с СД 2 типа экстракта из мидий вызывает улучшения структуры эритроцита не менее выраженные, чем при использовании метформина, что, учитывая отсутствие токсичности у данного состава, делает его перспективным для терапии данной патологии. В основе положительных эффектов действия экстракта из мидий лежит его состав и способность улучшать ан-тиоксидантные свойства клеток.
4. Комплексное применение метформина и
BÎCHHK Украгнсъког медичног cm оматолог in ног' академИ'
экстракта из мидий при СД 2 типа приводит к достижению положительных эффектов на уровне системы красных кровяных клеток, что может быть основой для разработки схем применения комплекса в клинике, как позволяющего снизить дозу метформина при терапии данной патологии.
5. Применение методик измерения показателей кислотного гемолиза эритроцитов и цифрового голографического интерференционного микроскопирования целесообразно для оценки эффективности лечения СД 2 типа.
Литература
. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. - М.: Наука, 1972. - 252с.
:. Новицкий В. В., Рязанцева Н. В., Степовая Е. А. Физиология и патофизиология эритроцита.- М.: Издательство РАМН, 2004. - 143 с.
.. Пат. 60504 А UA, Ф (13), (51 )7А61 К35/56. BiononiMep з тканин молюсив, cnociö його видтення та бюлопчж вла-стивост1 / O.G. Бпготська, T.M. Овсяныкова, А. Г. Губанова та GH.. (UA); Пшденний НД1 морського рибного госпо-дарства та океанографп (UA). ;№ 2002108573; заявл. 29.10.02; опубл. 15.10.03, Бюл. № 10. - 18 стр.
.. Шведова A.A., Полянский Н.Б. Метод определения конъюгатов гидроперекисей в экстрактах из тканей // Ис-
Реферат
10.
11.
12.
следование синтетических и природных антиоксидантов iu vitro и in vivo. - M. : Наука, 1992. - C.74-75. Absence of correlation between glycated hemoglobin and lipid composition of erythrocyte membrane in type 2 diabetic patients / Mawatari S., Saito K., Murakami K. et al. // Metabolism. - 2004. - Vol. 53, № 1. - P. 123-127. An altered oxidant defense system in red blood cells affects their ability to release nitric ixide-stimulating ATP / Carroll J., Raththagala M., Subasinghe W. et al. // Mol. Biosyst. -2006. - Vol. 2 , № 6-7. - P. 305-311. Antioxident status and lipid peroxidation in type II diabetes mellitus / Metisogullari R., Taysi S., Bakan E. et al. // Cell Biochem. Funct. - 2003. - Vol. 21, № 3. - P. 291-296. Babu N., Singh M. Influence of hyperglycemia on aggregation, deformability and shape parameters of erythrocytes // Clin. Hemorheol. Mocrocirc. - 2004. - Vol. 31, № 4. - P. 273-280.
Keenoy B., Vertommen J., De Leeuw I. Divergent effects of different oxidants on glutathione homeostasis and protein damage in erythrocytes from diabetic patients effects of high glucose // Mol. Cell Biochem. - 2001. - Vol. 225, № 1. - P. 59-73.
Protein glutathionylatio in erythrocytes / Giustarini D., Dalle-Donne I., Colombo R. Et al. // Clin. Chem. - 2003. - Vol. 49, № 2. - P.327-330.
Rudenko S. V., Crow J. H., Tablin F. Determination of time-depend shape changes in blood cells //Byochemistry (Moskow).- 1998- № 3. - P. 21-29.
Tishko T.V., Titar V.P., Tishko D.N.. Holographic methods of three- dimentional visualization of microscopic phase objects // J. Opt. Tech - 2005 - Vol. 72, No. 2. -P. 203-209.
КОРЕКЦ1Я ВЛАСТИВОСТЕИ МЕМБРАНИ ЕРИТРОЦИТ1В ЩУР1В 3 ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИМ ЦУКРОВИМ Д1АБЕТОМ ЗА ДОПОМОГОЮ ЕКСТРАКТУ 13 М1Д1Й
Шумейко О.Г., Овсяныкова T.M., ЗабелЫа I.A., Буркша B.C., Тишко Д.М. Ключов1 слова: мембрана, еритроцит,д1абет,екстракт,мщт.
Вивчались структурно-функцюнальы характеристики еритроцитш щурю з експериментальним цукровим дебетом 2 типу при використаны рЬних корегуючих засобш: метформЫу, екстракту ¡з мщш чорноморських. Визначеы показники динамки кислотного гемолгау та ¡ндекс форми (на агрегометрьфотометр1 Shapemeter-01 В), рщень продуктш перекисного окисления ninifliB ерит-роцитш (спектрофотометричним методом), зроблеы об'емы зображення еритроцитщ за допомогою цифрового голографнного ¡нтерференцшного м1кроскопу. Встановлено позитивний ефект застосування метформшу та екстракту з м1д1й при СД 2 типу, що може бути основою для розробки схем упровадження комплексу в кл1нЩ1, який дозволяе знизити дозу метформЫу при Tepanii даноТ патологи.
Summary
CORRECTION OF ERYTHROCYTE MAMBRANE PROPERTIES IN RATS WITH EXPERIMENTAL DIABETES MELLITUS BY MUSSEL EXTRACT
Shumeyko A.G., Ovsiannikova T.N., Zabelina I.A., Burkina V.S., Tyshko D.N. Key words: membrane, erythrocyte, diabetes, mussel.
The research investigates the structural and functional characteristics of erythrocytes in rats with experimental diabetes mellitus II type under the application of some corrective medicines: metformin, mussel (Mytilus) extract. We have determined the indices of acid erythrolysis dynamics and shape index (by using aggregometer-photometer Shapemeter-01 B), the level of lipid peroxidation products in erythrocytes (by spectrophotometry), as well as we have prepared 3-dimentional film images of erythrocytes by digital holographic interference microscope. The positive effect of methformine and mussel extract under diabetes mellitus II type has been established, so this makes is possible to develop the scheme of clinical application of mussel extract and at the same time to reduce the metformin dosage under the above mentioned pathology.
