CC BY
67
№ 6 - 2014 г.
14.00.00 медицинские и фармацевтические науки
УДК 616.419:615.361]-092.9
КОРРЕКЦИЯ МИЕЛОСУПРЕССИИ У КРЫС С ПОМОЩЬЮ ИМПЛАНТАЦИИ МАТРИКСОВ, НЕСУЩИХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ
Н. Г. Абдулкина1. К. В. Зайцев1. И. А. Хлусов1. О. Б. Жукова1. С. А. Межерицкий1. А. А. Гостюхина1. С. И. Твердохлебов1. В. А. Воробьев2
1Филиал «Томский научно-исследовательский институт курортологии и физиотерапии» ФГБУ «Сибирский федеральный научно-клинический центр Федерального
медико-биологического агентства» (г. Томск) 2ФГБУ «Сибирский федеральный научно-клинический центр Федерального медико-биологического агентства» (ЗАТО Северск)
Оценка возможности восстановления костномозгового кроветворения с помощью трансплантации мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, культивированных на трехмерных биодеградируемых матриксах из полимолочной кислоты, была выполнена на модели хронической миелосупрессии под действием цитостатического препарата циклофосфан у 30-ти крыс. С помощью гематологического анализа установлено, что подкожное введение тестируемых скеффолдов с мезенхимальными стволовыми клетками на фоне миелосупрессии приводит к более быстрому восстановлению всех ростков кроветворения, а также предотвращает возникновение вторичной гипоплазии костного мозга.
Ключевые слова: регенеративная медицина, хроническая миелосупрессия, система крови, мезенхимальные стволовые клетки, биодеградируемые полилактидные матриксы.
Абдулкина Наталья Геннадьевна — доктор медицинских наук, заместитель директора по научной работе Филиала «Томский научно-исследовательский институт курортологии и физиотерапии» ФГБУ «Сибирский федеральный научно-клинический центр Федерального медико-биологического агентства», г. Томск, рабочий телефон: 8 (3822) 51-53-88, е-mail: nauka@niikf.tomsk.ru
Зайцев Константин Васильевич — кандидат медицинских наук, руководитель экспериментальной лаборатории биомедицинских технологий Филиала «Томский научно-исследовательский институт курортологии и физиотерапии» ФГБУ «Сибирский федеральный научно-клинический центр Федерального медико-биологического агентства», г. Томск, рабочий телефон: 8 (3822) 90-65-17, е-mail: limdff@yandex.ru
Хлусов Игорь Альбертович — доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный
сотрудник экспериментальной лаборатории биомедицинских технологий Филиала «Томский научно-исследовательский институт курортологии и физиотерапии» ФГБУ «Сибирский федеральный научно-клинический центр Федерального медико-биологического агентства», г. Томск, е-mail: khlusov63@mail.ru
Жукова Оксана Борисовна — доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник экспериментальной лаборатории биомедицинских технологий Филиала «Томский научно-исследовательский институт курортологии и физиотерапии» ФГБУ «Сибирский федеральный научно-клинический центр Федерального медико-биологического агентства», г. Томск, е-mail: limdff@yandex.ru
Межерицкий Станислав Александрович — младший научный сотрудник экспериментальной лаборатории биомедицинских технологий Филиала «Томский научно-исследовательский институт курортологии и физиотерапии» ФГБУ «Сибирский федеральный научно-клинический центр Федерального медико-биологического агентства», г. Томск, рабочий телефон: 8 (3822) 90-65-17, е-mail: limdff@yandex.ru
Гостюхина Алена Анатольевна — младший научный сотрудник экспериментальной лаборатории биомедицинских технологий Филиала «Томский научно-исследовательский институт курортологии и физиотерапии» ФГБУ «Сибирский федеральный научно-клинический центр Федерального медико-биологического агентства», г. Томск, рабочий телефон: 8 (3822) 90-65-17, е-mail: limdff@yandex.ru
Твердохлебов Сергей Иванович — кандидат физико-математических наук, научный сотрудник экспериментальной лаборатории биомедицинских технологий Филиала «Томский научно-исследовательский институт курортологии и физиотерапии» ФГБУ «Сибирский федеральный научно-клинический центр Федерального медико-биологического агентства», г. Томск, рабочий телефон: 8 (3822) 90-65-17, е-mail: tverd@tpu.ru
Воробьев Виктор Александрович — генеральный директор ФГБУ «Сибирский федеральный научно-клинический центр Федерального медико-биологического агентства», ЗАТО Северск, рабочий телефон: 8 (3823) 54-37-03, е-mail: kb81@med.tomsk.ru
Введение. Одним из наиболее серьезных последствий радиационного и токсического воздействий является угнетение гемопоэза. Миелосупрессия связана с истощением пула кроветворных клеток, что приводит к снижению иммунологической резистентности и регенераторной способности, преждевременному старению организма, а также к повышению риска развития онкогематологических заболеваний в отдаленном периоде [4].
Решением этой проблемы, с точки зрения медикаментозной терапии, является введение фармакологических препаратов и биологически активных веществ, стимулирующих костномозговое кроветворение и мобилизацию выхода клеток в кровь. В условиях гипоплазии костного мозга и повреждения прогениторных клеток этот метод может оказаться неэффективным или иметь негативные последствия.
С помощью регенеративной медицины появляется возможность возмещения отсутствующих клонов специализированных клеток в поврежденных органах, увеличения пула функционирующих клеток, а также активизации в сохранившихся клетках поврежденного органа собственного резерва регенерации и пролиферации [1]. Однако
применение клеточных технологий при вышеописанных ситуациях связано с необходимостью решения многочисленных проблем, в частности, трансплантации большого количества стволовых клеток; консервации и длительного криохранения аутологичного костного мозга; трудности забора достаточного количества аутологичных клеток для трансплантации; осложнений в случае потенциального применения аллогенных трансплантатов. В связи с этим требует изучения и развития подход, связанный с применением тканеинженерных матриц, несущих искусственные микротерритории для стволовых клеток [6].
Целью настоящего исследования явилось экспериментальное обоснование возможности коррекции миелосупрессии у крыс с помощью трансплантации мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, культивированных на трехмерных биодеградируемых матриксах из полимолочной кислоты.
Материалы и методы исследования. Экспериментальное исследование было выполнено на 30-ти половозрелых крысах-самцах породы Wistar массой 270-305 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария на обычном пищевом рационе со свободным доступом к воде. Все процедуры с животными выполняли в соответствии с международными правилами и нормами (European Communities Council Directives of 24 November 1986, 86/609/EEC).
Модель хронической миелосупрессии была воспроизведена с помощью внутрибрюшинного введения цитостатического препарата циклофосфан по 20 мг/кг (1/10 LD50) в течение 10-ти дней. На 11-е сутки крысам опытной группы под наркозом подкожно в правую подмышечную область был имплантирован скеффолд с культивированными на нем мезенхимальными стволовыми клетками (МСК) костного мозга; 10-ти животным таким же операционным путем вводили аналогичный скеффолд без клеточного материала (контроль). Вторую контрольную группу составили 10 ложно-оперированных крыс, которым проводили манипуляции по формированию «кармана» под кожей в правой подмышечной области без введения скеффолда.
Тестируемые образцы трехмерных нетканых матриксов (скеффолды) были изготовлены в Национальном исследовательском Томском политехническом университете методом аэродинамического формования в турбулентном газовом потоке [9]. Для приготовления биоинженерной матрицы первоначально из костного мозга крыс были выделены мезенхимальные стволовые клетки [2]. Далее полученные МСК в концентрации 4 х 104 жизнеспособных клеток культивировали со стерильным полилактидным матриксом (размер 10 х 10 мм, толщина не более 1 мм) в полной культуральной среде при 37 °С и 5 % СО2 в течение 120 ч. Оценку жизнеспособности полученных клеток выполняли в тесте с трипановым синим, который не может проникать через цитоплазму живых клеток (ISO 10993-5).
Забор периферической крови экспериментальных животных для анализа гематологических показателей проводили до начала эксперимента (1-е сут.), перед операцией (11-е сут.), на 21, 34, 65 и 89-е сутки. Определение содержания эритроцитов, лейкоцитов и их субпопуляций выполняли на ветеринарном гематологическом анализаторе PCE-90 Vet («High Technology», США). Результаты выражали в процентах относительно исходного уровня. По окончании эксперимента у всех крыс из бедренной кости был выделен костный мозг для подсчета общего количества ядросодержащих клеток [2].
При обработке полученных данных были использованы методы статистического описания,
а также методы проверки статистических гипотез, включая внутри- и межгрупповое сравнения выборок, не подчиняющихся нормальному распределению, с помощью непараметрических критериев Вилкоксона и Манна-Уитни (U-тест) соответственно. Различия считали статистически значимыми при уровне р < 0,05.
Результаты исследований и обсуждение. Полимолочная кислота, ее сополимеры и композиты входят в современный класс биодеградируемых материалов и широко применяются для изготовления различных имплантатов [3]. Новым направлением приложения полимеров в области регенеративной медицины является разработка трехмерных волокнистых структур (нетканых скеффолдов), имеющих высокое отношение площади поверхности к общему объему, имитирующих межклеточное вещество различных тканей [8]. Как показали проведенные нами ранее исследования, использованные в настоящем эксперименте образцы полимолочных матриксов характеризовались биосовместимостью, средней скоростью биодеградации, отсутствием цитотоксических свойств как в условиях in vitro, так и in vivo [5, 9]. Однако известно, что биоматериалы способны влиять на организм не только за счет свойств поверхности, но и через продукты деградации полимера, которые предположительно могут задавать определенный вектор дифференцировки мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток [7].
Для оценки влияния биоинженерной матрицы из полимолочной кислоты на систему крови и на жизнеспособность клеток костного мозга нами была использована модель хронической миелосупрессии, вызванной введением цитостатического препарата. После окончания десятидневного курса циклофосфана у животных отмечалось значительное снижение всех оцениваемых гематологических показателей (см. рис.), обусловленное развитием миелосупрессии [4].
Восстановление общего количества лейкоцитов у животных с имплантированным матриксом, несущим МСК костного мозга, происходило быстрее, чем у ложно-оперированных и у крыс с имплантатом без клеточного материала (см. рис. А). При этом изменение содержания лейкоцитов и лимфоцитов в этой группе имело выраженный положительный характер и не снижалось ниже исходного уровня. В то время как у крыс контрольных групп происходил вторичный спад общего количества клеток белой крови, связанный, вероятно, с истощением костномозговых резервов и проявляющийся умеренной лимфоцитопенией (см. рис. А, Г). Стоит отметить, что быстрое восстановление популяции лейкоцитов происходило преимущественно за счет гранулоцитов (см. рис. Б). Уровень эритроцитов у животных контрольной группы восстанавливался до исходных значений только к концу эксперимента. График динамики уровня красных клеток крови при имплантации биоинженерной матрицы с культивированными на ней МСК более ровный и без «провала» на 34-65-е сутки (см. рис. Д), связанного с истощением костномозгового резерва стволовых гемопоэтических клеток [4].
Динамика изменения гематологических показателей у крыс в эксперименте: А — общего количества лейкоцитов, Б — содержания гранулоцитов, В — содержания моноцитов, Г — числа лимфоцитов, Д — количества эритроцитов (результаты представлены относительно
исходного уровня)
Сравнительный анализ клеточности костного мозга показал, что при введении скеффолда, несущего МСК, численность миелокариоцитов статистически значимо (р < 0,001) превышала контрольные значения (17,5 (11,0—21,6)-107/мл) более чем в 2 раза, достигая в среднем 46,4 (38,8—49,9)-107/мл, при среднем уровне жизнеспособности 94,4 %. Имплантация матрикса без клеточного материала не позволяла восстановить клеточность костного мозга у крыс с моделью хронической миелосупрессии (9,1 (8,9—10,6)-107/мл, р = 0,05).
Таким образом, полученные результаты продемонстрировали возможность восстановления костномозгового кроветворения, угнетенного цитостатическим препаратом, посредством имплантации матриксов, несущих клеточный материал.
Выводы
1. Полимерные матриксы из полимолочной кислоты являются биосовместимыми изделиями, обладающими биоактивными свойствами в отношении регенераторных
процессов и реакций системы крови при подкожной имплантации лабораторным крысам.
2. Имплантация скеффолдов с мезенхимальными стволовыми клетками на фоне
миелосупрессии, возникшей в результате цитостатического действия циклофосфана, приводит к более быстрому восстановлению всех ростков кроветворения, а также предотвращает возникновение вторичной гипоплазии костного мозга.
Список литературы
1. Аскаров М. Б. Коррекция цитокинового дисбаланса и стимуляция регенерации длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка при трансплантации стромальной фракции клеток аутологичного костного мозга / М. Б. Аскаров,
И. Е. Трубицына, Н .А. Онищенко// Патол. физиология и эксперим. терапия. — 2008.
— № 4. — С. 26-28.
2. Введение в методы культуры клеток, биоинженерии органов и тканей / В. П. Шахов [и др.]. — Томск : STT, 2004. — 386 с.
3. Волова Т. Г. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии: учебное пособие [Электронный ресурс] / Т. Г. Волова, Е. И. Шишацкая, П. В. Миронов.
— Красноярск, 2009. — Режим доступа : http://nashaucheba.ru/docs/18/17894/conv_1/file1.pdf.
4. Гольдберг Е. Д. Роль стволовых клеток в восстановлении кроветворения при цитостатических и лучевых миелосупрессиях / Е. Д. Гольдберг, А. М. Дыгай, В. В. Жданов // Бюл. сиб. медицины. — 2006. — № 2 — С. 35-43.
5. Динамика in vitro деградации нетканых матриксов из полимолочной кислоты
в модельной биологической жидкости / И. А. Хлусов, К. В. Зайцев, О. Б. Жукова [и др.] // Бюл. сиб. медицины. — 2013. — Т. 12, № 6. — С. 73-81.
6. Концепция «ниша-рельеф» для стволовых клеток как основа биомиметического подхода к инженерии костной и кроветворной тканей / И. А. Хлусов, Н. М. Шевцова, М. Ю. Хлусова [и др.] // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. — 2011.— Т. VI, № 2.— С. 55-64.
7. Biomaterials science: an introduction to materials in medicine / B. D. Ratner [et al.]. — San Diego, California: Elsevier Inc., 2004. — 851 p.
8. Lee Y.-Sh. Electrospun Nanofibrous Materials for Neural Tissue Engineering / Y.-Sh. Lee, T. L. Arinzeh // Polymers. — 2011. — Vol. 3, N 1. — P. 413-426.
9. Nonwoven Polylactide Scaffolds Obtained by Solution Blow Spinning and the In Vitro Degradation Dynamics / S. I. Tverdokhlebov, K. S. Stankevich, E. N. Bolbasov [et al.] // Advanced Materials Research. — 2014. — Vol. 872. — P. 257-262.
— (doi:10.4028/www.scientific.net/AMR.872.257).
MYELOSUPPRESSION CORRECTION AT RATS BY MEANS OF IMPLANTATION OF THE MATRIXES CARRYING MESENCHYMAL STEM CELLS
N. G. Abdulkina-. K. V. Zaytsev-. I. A. Khlusov-. O. B. Zhukova-. S. A. Mezheritskiy-. A. A. Gostyukhina-. S. I. Tverdokhlebov1. V. A. Vorobyev2
-Branch «Tomsk scientific research institute of balneology and physiotherapy» FSBE «Siberian federal scientific and clinical center of Federal medical biological agency» (Tomsk c.) 2FSBE «Siberian federal scientific and clinical center of Federal medical biological agency»
(CATU Seversk)
The assessment of possibility of medullar hemopoiesis restoration by means of transplantation of mesenchymal stem cells of marrow cultivated on the three-dimensional biodegraded matrixes from polylactic acid was performed on model of chronic myelosuppression under the influence of cytostatic preparation Cyclophosphanum at 30 rats. By means of hematological analysis it is established that hypodermic introduction of the tested scaffold with mesenchymal stem cells against myelosuppression leads to faster restoration of all sprouts of hemopoiesis, and also prevents emergence of secondary hypoplasia of marrow.
Keywords: regenerative medicine, chronic myelosuppression, blood system, mesenchymal stem cells, biodegraded polylactide matrixes.
About authors:
Abdulkina Natalya Gennadyevna — doctor of medical sciences, deputy director on scientific work at Branch «Tomsk scientific research institute of balneology and physiotherapy» FSBE «Siberian federal scientific and clinical center of Federal medical biological agency», office phone: 8 (3822) 51-53-88, e-mail: nauka@niikf.tomsk.ru
Zaytsev Konstantin Vasilyevich — candidate of medical science, principal of experimental laboratory of biomedical technologies at Branch «Tomsk scientific research institute of balneology and physiotherapy» FSBE «Siberian federal scientific and clinical center of Federal medical biological agency», office phone: 8 (3822) 90-65-17, e-mail: limdff@yandex.ru
Khlusov Igor Albertovich — doctor of medical science, professor, leading research associate of experimental laboratory of biomedical technologies at Branch «Tomsk scientific research institute of balneology and physiotherapy» FSBE «Siberian federal scientific and clinical center of Federal medical biological agency», e-mail: khlusov63@mail.ru
Zhukova Oksana Borisovna — doctor of medical science, leading research associate of experimental laboratory of biomedical technologies at Branch «Tomsk scientific research institute of balneology and physiotherapy» FSBE «Siberian federal scientific and clinical center of Federal medical biological agency», office phone: 8 (3822) 90-65-17, e-mail: limdff@yandex.ru
Mezheritskiy Stanislav Aleksandrovich — junior research associate of experimental laboratory of biomedical technologies at Branch «Tomsk scientific research institute of balneology and physiotherapy» FSBE «Siberian federal scientific and clinical center of Federal medical biological agency», office phone: 8 (3822) 90-65-17, e-mail: limdff@yandex.ru
Gostyukhina Alyona Anatolyevna — junior researcher of experimental laboratory of biomedical technologies at Branch «Tomsk scientific research institute of balneology and physiotherapy» FSBE «Siberian federal scientific and clinical center of Federal medical biological agency», office phone: 8 (3822) 90-65-17, e-mail: limdff@yandex.ru
Tverdokhlebov Sergey Ivanovich — candidate of physical and mathematical science, researcher of experimental laboratory of biomedical technologies at Branch «Tomsk scientific research institute of balneology and physiotherapy» FSBE «Siberian federal scientific and clinical center of Federal medical biological agency», office phone: 8 (3822) 90-65-17, e-mail: tverd@tpu.ru
Vorobyov Victor Aleksandrovich — CEO of FSBE «Siberian federal scientific and clinical center of Federal medical biological agency», office phone: 8 (3823) 54-37-03, e-mail: kb81@med.tomsk.ru
List of the Literature:
1. Askarov M. B. Correction of cytokine imbalance and stimulation of neogenesis hard-to-heal autoimmune stomach ulcers at transplantation of stromal fraction of cells of autologous marrow / M. B. Askarov, I. E. Trubitsyna, N. A. Onishchenko // Pathol. physiology and exper. therapy. — 2008. — № 4. — P. 26-28.
2. Introduction to methods of culture of cells, bioengineering of organs and tissues / V. P. Shakhov [etc.]. — Tomsk: STT, 2004. — 386 P.
3. Volova T. G. Materials for medicine, cellular and fabric engineering: guidance [electron resource] / T. G. Volova, E. I. Shishatskaya, P. V. Mironov. — Krasnoyarsk, 2009. — Access mode: (http://nashaucheba.ru/docs/18/17894/conv_1/file1.pdf).
4. Goldberg E. D. Role of stem cells in restoration of hemopoiesis at cytostatic and radial myelosuppression / E. D. Goldberg, A. M. Dygay, V. V. Zhdanov // Bulletin Sib. medicine.
— 2006. — № 2 — P. 35-43.
5. In the vitro loudspeaker of degradation of nonwoven matrixes from polylactic acid in model biological liquid / I. A. Khlusov, K. V. Zaytsev, O. B. Zhukova [etc.] // Bulletin of Sib. medicine. — 2013. — V. 12, № 6. — P. 73-81.
6. The concept «niche relief» for stem cells as a basis of biomimetic approach to engineering of osteal and hemopoietic tissues / I. A. Khlusov, N. M. Shevtsova, M. Y. Khlusova [etc.] // Cellular transplantology and fabric engineering. — 2011. — V. VI, № 2. — P. 55-64.
7. Biomaterials science: an introduction to materials in medicine / B. D. Ratner [et al.]. — San Diego, California: Elsevier Inc., 2004. — 851 p.
8. Lee Y.-Sh. Electrospun Nanofibrous Materials for Neural Tissue Engineering / Y.-Sh. Lee, T. L. Arinzeh // Polymers. — 2011. — Vol. 3, N 1. — P. 413-426.
9. Nonwoven Polylactide Scaffolds Obtained by Solution Blow Spinning and the In Vitro Degradation Dynamics / S. I. Tverdokhlebov, K. S. Stankevich, E. N. Bolbasov [et al.] // Advanced Materials Research. — 2014. — Vol. 872. — P. 257-262.
— (doi:10.4028/www.scientific.net/AMR.872.257).
