Конъюгаты хитозана и альдегидпроизводных фенолов Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

УДК 547.99:541.12 Вестник СПбГУ. Сер. 4, 2003, вып. 3 (№20)

А. Б. Погореленко, Н. С. Домнина, Э. В. ПоповаС. Л. Тютерев

КОНЪЮГАТЫ ХИТОЗАНА И АЛЬДЕГИДПРОИЗВОДНЫХ ФЕНОЛОВ

Природный полимер хитозан, представляющий собой полимер со звеньями /?-Д-глюкозамина и 1Ч-ацетил-/3-Д-глкжозамина, применяется в медицине, пищевой и косметической отраслях промышленности, в сельском хозяйстве [1]. Его распространение обусловлено ценными свойствами (биодеградируемость, биосовместимость, способность к пленкообразованию и т.д.) и широким спектром биологической активности. Например, хитозан известен как регулятор различных физиологических процессов, происходящих в растениях [2]. Усилить действие хитозана можно, используя его в виде смесевых композиций или конъюгатов с биологически активными соединениями (БАВ). Среди БАВ большой интерес представляют фенольные, обладающие антиокси-дантными свойствами и зарекомендовавшие себя как эффективные регуляторы роста и развития растений [3].

Данная работа посвящена созданию конъюгатов хитозана с альдегидпроизводными фенолов, изучению процесса гидролиза полученных полимерных продуктов, а также их ростостимулирующих и фунгистатических свойств.

Экспериментальная часть. Реагенты. Для синтеза конъюгатов использовали хитозан с молекулярными массами (ММ) 9000 (Хитэооо) и 50 000 (Хитвоооо).

Синтез 4-гидрокси-3,5-дитрет.бутилбензальдегида (АлФ) проводили по методике [4]. Тпл = 188°С (Тпл. лит = 188 - 189°С).

4-Гидрокси-З-метоксибензальдегид (ванилин) марки «х.ч.» применяли без дополнительной очистки.

Модификация хитозана. Исходный хитозан предварительно активировали переосаждением из солянокислого раствора щелочью (опыт 3 —табл. 1 и опыт 2 —табл. 2) или набуханием в растворителе в течение 1 ч (все остальные опыты). Реакцию модификации хитозана альдегидпроизводными фенолов вели при перемешивании при температуре эксперимента. По окончании реакции продукт отделяли на фильтре Шотта, промывали этанолом и хлороформом, сушили на воздухе. Отсутствие в модифицированном хитозане исходных альдегидпроизвод-ных фенолов контролировалось по УФ-спектрам хлороформенных экстрактов полимерных продуктов.

Восстановление иминной связи в конъюгатах осуществляли путем добавления в их водную суспензию 2-кратного избытка NaBH4, после чего реакционную смесь оставляли на 18 ч при комнатной температуре. Продукт отделяли на фильтре Шотта, промывали водой и ацетоном, сушили на воздухе. Ряд конъюгатов с восстановленной иминной связью были получены без выделения промежуточного продукта.

Получение комплексов хитозана и конъюгатов с ионами Си2+. Хитозан или конъюгат помещали на 6 ч в водный раствор 4 • Ю-2 моль/л СиЭО^бНгО. Содержание меди в полимере определяли по разности исходной и конечной концентраций ионов Си2+ в водном растворе фотометрическим методом.

УФ-спектры. УФ-спектры конъюгатов были сняты на спектрофотометре СФ-56 в диапазоне длин волн 230-450 нм. Содержания присоединенных фрагментов фенолов в конъюгатах (X, масс.%) определяли согласно методике [5].

ИК-спектры. ИК-спектры исходных альдегидпроизводных фенолов и конъюгатов были сняты в диапазоне 3600-1100 см-1 в таблетках КВг на приборе IR-78.

•'Лаборатория фитотоксикологии Всерос. науч.-исслед. ин-та защиты растений (г. Пушкин).

© А. Б. Погореленко, Н. С. Домнина, Э. В. Попова, С. JI. Тютерев, 2003

Таблица 1. Условия и характеристика продуктов модификации хитозана 4-гидрокси-З-метоксибензальдегидом (HjO/EtOH, 20°С)

№ ММ Время, До восстановления После восстановления

опыта хитозана мин Продукт X, масс.% Продукт масс.%

1 50 000 3 Хит-В 1 2,6 — —

2 10 Хит-В2 9,4 — —

3 90 Хит-ВЗ 20,5 — —

4 180 Хит-В4 22,8 Хит-Вв4 23,0

5 9000 10 Хит-В5 7,1 Хит-Вв5 7,5

6 20 — — Хит-Вв6 11,8

7 90 Хит-В7 20,7 Хит-Вв7 18,9

8 120 — — Хит-Вв8 21,2

Примечание. Соотношение реагентов хитозан : ванилин =1:1 (моль : моль).

Таблица 2. Условия и характеристика продуктов реакции хитозана с 4-гидро-кси-3,5-дитрет.бутилбензальдегидом

№ ММ Условия реакции До восстановления После восстановления

опыта хитозана Г,°С Время, мин Растворитель Продукт масс.% Продукт масс.%

1 50 000 20 120 ДМСО/EtOH 1/1 Хит-А 1 1,3 Хит-Ав1 1,3

2 180 Хит-А2 1,6 — —

3 50 180 ДМСО Хит-АЗ 5,8 — —

4 240 — — Хит-Ав4 6,6

5* 180 Хит-А5 7,7 Хит-Ав5 7,7

6* 240 — — Хит-Авб 11,0

Г 300 - — Хит-Ав 7 12,8

8 9000 20 60 ДМСО/ЕЮН 1/1 Хит-А8 0,7 — —

9 90 Хит-А9 0,9 Хит-А„9 0,9

Примечания. Соотношение реагентов хитозан : АлФ =1:1 (моль :моль); * — опыт проводился в присутствии 2пСЬ (10%).

Гидролиз конъюгатов. Процесс выделения альдегидпроизводных фенолов из конъюгатов изучали при температурах 20 и 28°С в буферах при pH = 4,01 и 6,86. Для исследований использовали гетерогенные системы:

1) мелкодисперсный порошок конъюгата Хит-А помещали в буфер, через определенное время гидролиза добавляли хлороформ для извлечения выделившегося АлФ, количество которого находили по УФ-спектрам (Атах = 290 нм, е = 77 л/г-см);

2) мелкодисперсный порошок конъюгата Хит-В помещали в буфер, через выбранное время гидролиза продукт отделяли на фильтре Шотта, промывали водой и сушили на воздухе. По УФ-спектрам выделенных конъюгатов устанавливали содержание ванилина, оставшегося в конъюгате.

Первичные биологические испытания. Влияние продуктов модификации хитозана на вегетативный рост фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum изучали методом агаровых блоков [6, с. 272-274, 7, с. 59-60]. Испытания препаратов были проведены в трех концентрациях — 0,05; 0,4 и 1,5% по отношению к массе питательной среды.

Оценку ростостимулирующей активности продуктов модификации хитозана проводили путем анализа энергии прорастания и всхожести семян огурца сорта Феникс, обработанных по-

рошками препаратов, согласно ГОСТу 12038-84. Препараты исследовались в трех концентрациях: 0,5, 2 и 5% по отношению к массе инертного наполнителя (крахмал).

Результаты и их обсуждение. Выбор для синтеза конъюгатов хитозана с ММ 9000 и 50 000 обусловлен тем, что он применим для обработки как семян, так и вегети-рующих растений.

Реакцию модификации хитозана альдегидпроизводными фенолов проводили по схеме

+ R-C:

-О

н

(И)

н2о .

Восстановление иминной связи в конъюгатах осуществляли с помощью борогидрида натрия:

(II)

NaBH,

:Н2ОН

;н2он -о

Н NHCCH, II

О

оси.

-R= (\ />-ОН ; —/ /-°Н

\ /

\\_//

Выбор метода модификации хитозана через синтез оснований Шиффа определялся возможностью получения наряду с продуктами, имеющими гидролитически лабильную С=1М-связь между фенольным соединением и основной цепью полимера, продуктов с гидролитически инертной ковалентной С—N-связью, образующейся после восстановления иминной связи. Вполне естественно, что наличие различных по природе C=N- и С—N-связей в спейсере должно оказывать влияние на биологическую активность полимерной формы БАВ [8].

Выбранные в качестве модификаторов хитозана АлФ и ванилин различаются по степени экранирования фенольной группы и обладают разной антиоксидантной актив-

ностью. Особо следует отметить, что ванилин относится к природным соединениям, но получается в основном химическими методами.

Создание конъюгатов на основе хитозана осложняется трудностью подбора растворителя для проведения синтеза в гомогенной среде, поскольку хитозан растворяется только в разбавленных растворах органических или неорганических кислот. Синтез конъюгатов осуществляли гетерогенно, предварительно активируя хитозан переосаждением или набуханием. При проведении реакции варьировали температуру, растворитель, время реакции (см. табл. 1 и 2 и рис. 1).

X, масс.%

III

Вода Вода/ДМСО ДМСО

Растворитель

Рис. 1. Влияние растворителя на степень модификации хитозана 4-гидрокси-З-метокси-бензальдегидом (50°С, 180 мин).

Оказалось, что реакционная способность аминогрупп хитозана не зависит от метода подготовки полимера к синтезу. Увеличение температуры и времени реакции приводит к повышению степени замещения хитозана. Необходимо отметить, что ванилин реагирует с хитозаном даже при смешении в сухом виде (АГ120 мин = 2 масс.%), тогда как для АлФ необходим растворитель. Лучшей средой для модификации хитозана ванилином является вода (рис. 1), а для АлФ—ДМСО. Использование катализатора при синтезе конъюгатов с АлФ позволило достичь более высоких степеней модификации.

Таким образом, в результате изменения условий реакции модификации хитозана максимальное содержание фенольных фрагментов в конъюгатах составило около 30 масс.% для ванилина и около 8 масс.% для АлФ. Содержания присоединенного модификатора в продуктах с восстановленной иминной связью и в соответствующих продуктах с иминной связью удовлетворительно совпадают, что говорит о прохождении модификации по первичным аминогруппам хитозана.

Полученные продукты имеют различную растворимость. Так, конъюгаты с ванилином, так же как и исходный хитозан, растворяются в 4%-ной уксусной кислоте. Для растворения продуктов модификации хитозана АлФ требуется добавление к 4%-ной уксусной кислоте этанола в объемном отношении 1:1.

Для количественной оценки содержания присоединенных фенольных фрагментов в продуктах с иминной связью были сняты УФ-спектры. Исходный хитозан не имеет поглощения в области 230-450 нм. В УФ-спектрах полимерных продуктов наблюдаются максимумы поглощения, характерные для исходных альдегидпроизводных фенолов (рис. 2, а,6). Это связано с прохождением полного гидролиза иминной связи в использованном растворителе (рН~4) и, как следствие, высвобождением модификатора из конъюгата, что подтверждено контрольными опытами.

250 300 350 400 нм

Рис. 2. УФ-спектры.

а — растворитель 4%-ная СНзСООН: 1 — ванилин, Атах = 280, 309 нм, С = 1,8 • 10~3 г/л, £280 = 76 л/(г-см), 2 — Хит-В2, АШах = 280, 309 нм, С = 0,017 г/л, 3 — 4-метил-2-метоксифенол, Атах = 279 нм, С = 0,027 г/л (модель для расчета X, масс.%), ^ —Хит-Вв2, Атах = 278 нм, плечо ~ 306 нм, С = 0,11 г/л; б— растворитель — 4%-ная СНзСООН:ЕЮН=1:1: 1 — 4-гидрокси-3,5-дитрет.бутилбензальдегид, Атах = 294 нм, С = 2,6 ■ 10"3 г/л, £ = 67 л/(г-см), 2— Хит-А9, АШах = 294 нм, С = 0,5 г/л, 3 — 2,6-дитрет.бутил-4-метилфенол, Атах = 277 нм, С = 0,03 г/л (модель для расчета X, масс.%), ^ —Хит-Ав9, Атах = 274 нм, С = 0, 48 г/л.

Для доказательства ковалентного связывания альдегидпроизводных фенолов с первичными аминогруппами хитозана были сняты ИК-спектры в таблетке КВг. В спектрах полученных продуктов появляются полосы поглощения, типичные для иминной связи (при 1645 см-1 для конъюгатов Хит-А и при 1635 см-1 для конъюгатов Хит-В), и исчезают полосы поглощения альдегидной группы, присутствующие в спектрах исходных альдегидпроизводных фенолов (1665, 2730 см-1 — АлФ; 1665, 2740 см"1 — ванилин).

Продукты с восстановленной иминной связью были охарактеризованы УФ-спектрами (рис. 2, а,б). В спектрах конъюгатов Хит-Ав наблюдается гипсохромный сдвиг полосы

поглощения, тогда как для конъюгатов Хит-Вв свойственно не только смещение, но и изменение вида спектра. Обнаруженные изменения вполне естественны, поскольку в результате восстановления иминной связи в конъюгатах исчезает сопряжение этой связи с бензольным кольцом.

Как известно, одной из наиболее важных групп фунгицидов являются различные соединения меди, которые самостоятельно или в смеси с органическими препаратами широко применяются для борьбы с болезнями растений. Используя свойство хитоза-на образовывать прочные хелатные комплексы с переходными металлами, мы получили медные комплексы исходного хитозана с ММ 9000 и 50000, а также некоторых конъюгатов Хит-В с целью создания препаратов, сочетающих ростостимулирующие и фунгистатические свойства. Характеристика продуктов представлена в табл. 3.

Таблица 3. Характеристика комплексов Хит-Си

Исходный ММ Комплекс Содержание CuJ' ,

хитозан мг-экв./г

ХиТ50 ООО 50 000 Хитбо ооо-Си 14,4

Хитэооо 9000 Хитэооо-Си 14,8

Хит-В4 50 000 Хит-В4-Си 10,1

Хит-В7 9000 Хит-В7-Си 9,4

Установлено, что биологическая активность фитоактивных полимеров зависит от скорости гидролиза спейсера—функциональной группы, связывающей регулятор роста и полимерный носитель [8]. В связи с этим представлялось целесообразным изучить процесс гидролиза конъюгатов с гидролитически лабильной иминной связью. Полученные экспериментальные данные представлены на рис. 3, а-в. Скорость гидролиза возрастает при увеличении температуры, что видно при сравнении кривых 1 и 2 (рис. 3, в), а также кривых 1 и 3 (рис. 3, а). Кроме того, к большей скорости гидролиза приводит снижение pH среды (рис. 3, в, кривые-1 а 3). Сравнение скорости гидролиза продуктов Хит-В4 (рис. 3, е, кривая 1) и Хит-В7 (рис. 3,5, кривая 2), имеющих близкие степени модификации, но различающиеся ММ хитозана, позволяет сказать о повышении скорости процесса при уменьшении ММ полимера. Кроме того, выявлена тенденция к ускорению процесса гидролиза при снижении степени модификации хитозана (ср. кривые 1 и 2 рис. 3, а, кривые 1 и 2 рис. 3, б).

Были проведены первичные биологические испытания некоторых из полученных конъюгатов. Обработка семян препаратами на основе как исходного, так и модифицированного хитозана привела к увеличению всхожести семян, а также к развитию более мощной корневой системы растения по сравнению с контролем (семена без препарата). В табл. 4 представлены результаты по исследованным конъюгатам в концентрациях, в которых они проявили наибольшую эффективность. Следует отметить, что эти концентрации были в 5-10 раз ниже, чем для исходного хитозана.

Фунгистатическая активность конъюгатов была оценена по отношению к фитопато-генному грибу Fusarium Oxysporum (табл. 5). Полученные данные свидетельствуют, что исходные хитозаны не обладают фунгистатической активностью по отношению к данному грибу. Конъюгаты показали достаточно высокую фунгистатическую активность в максимальной из трех испытанных концентраций (1,5 масс.%).

Сопоставляя полученные результаты для продуктов на основе хитозанов с разной ММ, можно сказать, что наблюдается корреляция между скоростью гидролиза и прояв-

Рис. 3. Изменение относительного содержания модификатора в процессе гидролиза различных конъюгатов.

а — Хит-А (выделение АлФ): 1 — Хит А 1 (рН = 6,86, 28°С), 2— Хит-АЗ (рН = 6,86, 28ЧС), 3 — Хит-А1 (рН = 6,86, 20°С); б-Хит-В, рН = 6,86, 28°С (убыль содержания ванилина): 1 — Хит-В5, 2 — Хит-В7; в — Хит-В4 (убыль содержания ванилина): 1 — рН = 6,86, 28° С, 2 —рН = 6,86, 20° С, 3— рН = 4,01, 28° С.

35 -1-1-1-1_

0 5 10 15 20

Время, мин

Таблица 4- Ростостимулирующая активность конъюгатов

Препарат ММ Концентрация, Энергия Всхожесть, Длина

хитозана масс.% прорастания, % % корня, мм

Контроль — — 67 80 37

ХиТ50 ООО 50 000 5 93 100 57

Хитэооо 9000 5 87 93 56

Хит-В4 50 000 0,5 80 93 57

Хит-Вв4 0,5 73 87 38

Хит-В4-Си 2 87 93 47

Хит-В7 9000 2 80 87 68

Хит-Вв7 2 87 93 65

Хит-В7-Си 0,5 80 87 57

Хит-А1 50 000 0,5 80 87 46

Хит-Ав1 5 73 100 56

Хит-А9 9000 0,5 87 93 57

Хит-Ав9 5 93 100 61

Таблица 5. Фунгистатическая активность хитозана и его производных против Fusarium oxys-porum (опыт in vitro)

Препарат, концентрация 1,5 масс.% Ингибирование роста мицелия, % к контролю

3-й день 6-й день

ХИТ50 000 9 0

Хитдооо 15 0

ХиТ50 ООО-Си 30 15

Хитэооо-Си 52 40

Хит-В4 42 15

Хит-В7 59 37

Хит-В4-Си 33 13

Хит-В7-Си 64 47

ляемой полимерным продуктом биологической активностью: скорость гидролиза и биологическая активность конъюгатов с ММ 9000 выше, чем для конъгатов с ММ 50 ООО.

Summary

Pogorelenko А.В., Domnina N.S., Popova E.V., Tjuterev S.L. Conjugates of chitosan and aldehyde derivatives of phenols.

Two series of chitosan conjugates and 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde or 4-hydroxy-3,5-di-tert-butylbenzaldehyde were obtained. The conjugates have different spacers, substitution degree of aminogroups and molecular weights. Hydrolysis of conjugates at various conditions was investigated. Cu(II) complexes with chitosan or conjugates were synthesized. It was found that polymer products on the chitosan basis possess plant growth stimulation and fungistatic activities.

Литература

1. Плиско A.E., Нудьга Л.А., Данилов С.Н. ,// Успехи химии. 1977. Выи. 8. С. 1470-1483. 2. Тютерев С.Л. Научные основы индуцированной болезнеустойчивости растений. СПб., 2002. 3. 6-я Международная конференция «Биоантиоксидант»: Тез. докл. Москва, 16-19 апреля 2002 г. М., 2002. 4. Ершов В.В., Никифоров Г.А., Володъкин А.А. Пространственно-затрудненные фенолы. М., 1972. 5. Домнина Н.С., Комарова Е.А., Арефьев Д.В., Назарова О.В. и др. // Высокомол. соединения. 1997. Т. 70, № 6. С. 1022-1026. б.Билай В.И. Методы экспериментальной микологии: Справочник. Киев, 1982. 7. Методические указания по государственным испытаниям фунгицидов, антибиотиков и протравителей сельскохозяйственных культур. М., 1985. 8.Штпилъман М.И., Лоттер М.М. //Высокомол. соединения. Сер. Б. 1999. Т. 41, №8. С. 1363-1376.

Статья поступила в редакцию 18 февраля 2003 г.