CC BY
7УДК 577.25; 591.181; 611.018.8
КОНТРОЛЬ ИОНОТРОПНЫХ РЕЦЕПТОРОВ ГЛУТАМАТА С ПОМОЩЬЮ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ФОТОПЕРЕКЛЮЧАТЕЛЕЙ
йО!
Николаев М. В.
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург, Россия г-таИ: fmedfstud@gmail.com
Аннотация. Ионные каналы — мембранные белки, которые играют ключевую роль в процессах передачи и обработки информации в нервной системе. Молекулярные фотопереключатели — это современные инструменты в арсенале экспериментальной нейрофизиологии для быстрого локального контроля активности ионных каналов. Мы разработали серию фотопереключателей лиганд-управляемых ионных каналов, рецепторов глутамата. Вещества представляют собой производные четвертичного аммония, содержащие в качестве светочувствительного элемента группу азобензола. Действие соединений охарактеризовано на нативных глутаматных рецепторах пирамидных клеток гиппокампа и гигантских интернейронов стриатума (метод пэтч-кламп, конфигурация «целая клетка», режим фиксации потенциала). В присутствии веществ в условиях комнатного освещения токи через ионные каналы угнетаются, но при облучении препарата монохроматическим светом (420—460 нм) активность соединений резко снижается. Фотопереключение быстрое и полностью обратимое. Непременным условием высокой антагонистической активности соединений является наличие одного или нескольких положительно заряженных атомов азота.
Вещества обладают различной избирательностью в отношении типа глутаматных рецепторов и молекулярным механизмом действия. Наиболее перспективные фотопреключатели NMDA рецепторов являются алло-стерическими модуляторами, а в случае AMPA рецепторов (кальций-проницаемый подтип) наблюдается светозависимый блок открытого ионного канала. Существование различных мод действия азобензол-содержащих аминов открывает возможность разработки фотопереключателей, нацеленных на конкретную популяцию рецепторов глутамата. Использование таких веществ позволит ввести на новый уровень изучение синаптической передачи и пластичности, и позволит лучше понять механизмы развития заболеваний нервной системы, сопровождающихся нарушением глутама-тергической передачи.
Ключевые слова: ионный канал, фотопереключатель, азобензол, синапс, нейрон
Введение.
Оптический контроль ионных каналов с помощью молекулярных фотопереключателей — это современный экспериментальный подход для изучения физиологии нервной системы в норме и патологии. Эти вещества изменяют химические свойства и сродство к ионному каналу при освещении светом определенной длины волны, за счет чего достигается эффект «переключения». Важное преимущество фотопереключателей перед традиционными лиганда-ми-модуляторами ионных каналов состоит в том, что их активность может быть изменена локально, быстро и полностью обратимо [1]. Недавно мы обнаружили, что известные фотопереключатели потен-циалозависимых ионных каналов, азобензол-содержащие производные лидокаина, проявляют активность в отношении ионотроп-ного рецептора глутамата. Одно из таких соединений, DENAQ (diethylamine-azobenzene-quaternary ammonium), оказалось селективным светочувствительным антагонистом NMDA рецепторов. Эта находка послужила отправной точкой проекта, посвященного разработке фотохромных модуляторов глутаматных рецепторов.
Результаты исследования.
DENAQ — это производное азобензола, содержащее диэтила-миновую группу и четвертичную триэтиламиновую группу. Мы синтезировали серии соединений, в которых варьировали конкретные структурные компоненты DENAQ и изучили влияние таких изменений на эффективность и светозависимость угнетения глута-матных рецепторов. Действие веществ исследовали в электрофизиологических экспериментах пэтч кламп на нативных глутаматных рецепторах нейронов мозга крысы трех типов: NMDA, AMPA кальций-проницаемые и AMPA кальций-непроницаемые рецепторы.
Экстраклеточная подача веществ (30^M) вызывала быстрое светозависимое угнетение токов через глутаматные рецепторы в большинстве случаев. Вещества с высокой активностью преимущественно угнетали NMDA тип глутаматных рецепторов [2, 3]. При этом незначительные изменения в структуре, например, при замене диэтиламиногруппы DENAQ на диметиламиногруппу, вещество DMNAQ (dimethyl-azobenzene-quaternary ammonium) или на пи-ролидиновое кольцо, вещество PyrAQ (pyrrolidine-azobenzene-
quaternary ammonium), активность возрастала в 2 и 5 раз, соответственно. В случае AMPA рецепторов отдельного внимания заслуживает пара соединений, содержащих акриламидную группу, вещество AAQ (acrylamide-azobenzene-quaternary ammonium), и дополнительную четвертичную аминогруппу, вещество QAQ (quaternary ammonium-azobenzene-quaternary ammonium). Только эти вещества оказывали избирательное действие в отношении кальций-проницаемого подтипа рецепторов.
DMNAQ, PyrAQ, AAQ и QAQ обладают постоянным положительным зарядом при физиологических значениях pH. Поэтому в качестве возможного механизма угнетающего действия соединений можно предположить блокаду ионного канала. Характеристическим свойством блокаторов является зависимость их активности от мембранного потенциала. Измеряя активность соединений при фиксации мембранного потенциала в широком диапазоне (от -140 до +40 мВ, шаг 20 мВ) мы экспериментально проверили эту возможность.
Активность DMNAQ и PyrAQ не изменялась при варьировании мембранного потенциала фиксации как на NMDA, так и на AMPA рецепторах. Напротив, угнетение глутаматных рецепторов веществами AAQ и QAQ зависела от величины мембранного потенциала. В случае NMDA рецепторов активность веществ монотонно увеличивалась при гиперполяризации мембраны. Потенциалозависи-мость хорошо аппроксимировалась классической математической моделью, описывающей действие непроникающего блокатора ионного канала. На AMPA кальций-проницаемых рецепторах вещества проявляли потенциалозависимость действия, характерную для блокаторов, способных проникать через ионный канал в цитоплазму (феномен «проваливания»). Сравнение величин б, отражающих относительную глубину залегания участка связывания в полости канала, хорошо соотносится с современными представлениями о механизмах блокады глутаматных рецепторов. В случае NMDA рецепторов вещества QAQ и AAQ взаимодействуют с поверхностным участком связывания. В AMPA рецепторах связывание происходит глубоко в полости канала. Молекулярное моделирование с помощью метода Монте-Карло с минимизацией энергии полностью соотносится с экспериментальными данными.
Интересно, что при сильной деполяризации мембраны наблюдалось потенциал независимое угнетение AMPA рецепторов на уровне, которое может быть опосредовано дополнительным
участком вне полости канала. Это подтверждается хорошей аппроксимацией данных формулой, учитывающей независимое связывание QAQ и AAQ с потенциалозависимым и потенциалонеза-висмым участками связывания.
Для определения внеканального участка (-ов) связывания были проведены дополнительные эксперименты (зависимость действия от концентрации агониста, внеклеточного кальция, рН внеклеточной среды). В модельных экспериментах были получены наборы устойчивых комплексов с различными экстраклеточными частями рецепторов. Однако, ни один из найденных путем расчёта потенциальных сайтов связывания не соотносился полностью с набором экспериментальных данных.
Заключение.
Разработка фотопереключатели для ионных каналов является актуальной проблемой современной нейрофизиологии, однако набора специфических фотопереключателей для разных подтипов глутаматных рецепторов до сих пор не существует. В данном проекте мы представляем несколько высокоактивных фотоуправляе-мых антагонистов рецепторов глутамата, обладающих различной избирательностью и молекулярным механизмом действия. Вещества PyrAQ и DMNAQ являются селективными неконкурентными антагонистами NMDA рецепторов, их действие не связано с блокадой ионного канала. Напротив, экспериментальные данные о действии веществ QAQ и AAQ хорошо соотносятся с современными представлениями о блокаде ионных каналов глутаматных рецепторов. Дополнительные потенциалонезависимые эффекты AAQ и QAQ могут быть обусловлены наличием второго участка, расположенного в экстраклеточной части рецептора. Определение этого участка связывания и структурных детерминант, ответственных за развитие потенциалонезависимого угнетения рецепторов, требует отдельного исследования с привлечением методов направленного мутагенеза рецепторов.
В целом, существование различных участков связывания, обеспечивающих угнетение глутаматных рецептров, открывает возможность разработки новых фотопереключателей, нацеленных на конкретную популяцию рецепторов глутамата. Использование таких веществ позволит контролировать синаптическую передачу с высоким пространственным и временным разрешением, и позволит вывести на новый уровень возможности современной экспери-
ментальной нейрофизиологии в изучении функций нервной системы в норме и при патологических расстройствах.
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 23—24—00481.
Список литературы
1. A. Mourot, C. Herold, M. A. Kienzler, R. H. Kramer, Understanding and improving photo-control of ion channels in nociceptors with azobenzene photo-switches, Br J Pharmacol, 175 (2018) 2296—2311.
2. M. V. Nikolaev, D. M. Strashkov, M. N. Ryazantsev, D. B. Tikhonov, Optical Control of N-Methyl-d-aspartate Receptors by Azobenzene Quaternary Ammonium Compounds, ACS Chem Neurosci, 12 (2021) 3347—3357.
3. M. V. Nikolaev, D. M. Strashkov, M. N. Ryazantsev, D. B. Tikhonov, Development of a quaternary ammonium photoswitchable antagonist of NMDA receptors, European journal of pharmacology, 938 (2023) 175448.
CONTROL OF IONOTROPIC GLUTAMATE RECEPTORS WITH MOLECULAR PHOTOSWITCHES
Nikolaev M. V.
Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry of the Russian Academy of Sciences, Saint-Petersburg, Russia e-mail: fmedfstud@gmail.com
Annotation. Ion channels are membrane proteins that play a major role in the regulation of cellular excitability and in the processes of transmission and processing of information in the nervous system. Molecular photoswitches are novel pharmacological tools for rapid, local, and reversible control of ion channels. We have developed a series of photoswitches for ligand-gated glutamate ion channels. The substances are quaternary ammonium derivatives containing an azobenzene group. The action of the compounds was characterized on native glutamate receptors of pyramidal cells of the hippocampus and giant striatal interneurons (whole-cell patch clamp, voltage clamp mode). In the presence of substances in the dark, the currents through the ion channels suppressed, but upon irradiation with monochromatic light (420—460 nm), the activity decreased. The photoswitch
effect was fast and completely reversible. High antagonistic activity requires the presence of one or more positively charged nitrogen atoms. Substances have different selectivity in relation to the type of glutamate receptors and the molecular mechanism of action. The most promising photoswitches of NMDA receptors are allosteric modulators, and in the case of AMPA receptors, a light-dependent open channel block may be present. The existence of different modes of action of azo-benzene-containing amines opens the possibility for developing photoswitches for a specific population of glutamate receptors. The use of such substances is important for studying the functions of the glutamatergic system in normal conditions and in neurological diseases.
Key words: ion channel, photoswitch, azobenzene, synapse, neuron
