CC BY
28
УДК 619:616.98:578.842.1:577.2
Варенцова А.А.1, Шевченко И.В.2, Зиняков Н.Г.3, Власова Н.Н.4, Груздев К.Н.5, Дрыгин
В.В.6 ©
1,2 Аспирант; 3кандидат биологических наук, 4,5,6доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный центр охраны здоровья
животных», г. Владимир
КОНСТРУИРОВАНИЕ БИБЛИОТЕКИ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ ИММУНОЛОГИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫЕ БЕЛКИ ВИРУСА АЧС ИЗОЛЯТА KRASNODAR
06/12
Аннотация
Статья посвящена созданию клонотеки и анализу нуклеотидных последовательностей генов B646L (p72), CP204L (p30), KP177R (p22), O61R (p12), EP402R (CD2v), CP530R (pp62), CP2475L (pp220) и E183L (p54) вируса африканской чумы свиней. Нуклеотидные
последовательности генов B646L (KJ195685), CP204L (KJ195684), KP177R (KJ380912), O61R (KJ380913), EP402R (KJ195682), CP530R (KJ380911), CP2475L (KJ195683) и E183L (KJ380910) вируса АЧС изолята Krasnodar 06/12 опубликованы в базе данных GenBank впервые.
Ключевые слова: африканская чума свиней, иммунодоминантные белки, секвенирование, клонотека генов.
Keywords: African swine fever, immunodominant proteins, sequence, gene library.
I. Введение
С 2007 года на территории Российской Федерации (РФ) регистрируют вспышки африканской чумы свиней (АЧС) и на протяжении 6 лет страна является зоной стационарного неблагополучия по данному заболеванию [1;2].
Возбудитель АЧС - крупный ДНК-содержащий оболочечный вирус диаметром приблизительно 200 нм. Наружный слой вириона представляет липопротеидная оболочка, приобретаемая почкованием в процессе выхода из клетки. Под ней находится капсид икосаэдрической формы, затем внутренняя липидная оболочка, в которую заключен кор вируса. [4;20]. Кор окружает электронно-плотный нуклеоид, который содержит двухцепочечную ДНК размером около 200 тыс.п.о. [3]
На настоящий момент определены полные нуклеотидные последовательности 13 изолятов вируса АЧС (по данным GeneBank на 2013 год). Первая полноразмерная нуклеотидная последовательность была определена для изолята, адаптированного к росту в перевиваемой культуре клеток BA71V. Буквенное обозначение генов вируса АЧС дано в зависимости от их местоположения во фрагментах генома, полученных в результате рестрикционного расщепления по сайту узнавания рестриктазы EcoRI. Геном содержит 151-167 открытых рамок считывания (ОРС) и различается по длине ОРС и количеству генов в мультигенных семействах. Уменьшение длины генома наблюдается также как результат варьирования количества тандемных повторов в пределах генов или интергенных регионов [17].
Проведенные зарубежными учеными исследования подтвердили активное воздействие вируса на основные этапы внутриклеточного синтеза [5]. Структурные белки, синтезируемые при репликации вируса АЧС, активно воздействуют на репродукцию клеточных белков и перестраивают работу ферментативного аппарата клетки на синтез вирусных белков, нуклеиновых кислот и ферментов. Существует также группа белков, супрессирующая синтез иммуноглобулинов и снижающая активность Т-клеток [7].
© Варенцова А.А., Шевченко И.В., Зиняков Н.Г., Власова Н.Н., Груздев К.Н., Дрыгин В.В.
Работы по изучению протеинов вируса АЧС показали, что поверхностные белки р30, p54, p22, CD2v, и p12 играют значительную роль в процессах вирус-клеточного
взаимодействия, а синтез белков рр220, рр62 и р72 активно воздействует на морфогенез вируса.
Основным капсидным белком является продукт гена B646L р72, при участии которого происходит проникновение вируса в клетку. Этот белок синтезируется на поздних стадиях инфекции и локализуется между двумя слоями липопротеидной оболочки во внеклеточных вирусных частицах [20;21].
Структурный белок р22 (с молекулярной массой 22 kDa) расположен во внешней мембране вирусной частицы. Он содержит гидрофобный трансмембранный регион с сигнальным пептидом на N-конце. Обнаруживается на ранних этапах вирусной инфекции в плазматической мембране [8].
Белок р 12, кодируемый геном O61R, является основным белком прикрепления, формирует димеры с молекулярной массой 17 кДа [9,10,11]. Анализ данных по изучению нуклеотидных последовательностей ДНК фрагмента, содержащего ген O61R, показал, что его 5’-концевой регион является практически идентичным у всех изученных вирусных изолятов, в то время как интергенный регион, расположенный далее за рамкой считывания гена, сильно варьирует у различных изолятов [12].
Ген EP402R кодирует белок CD2v, имеющий большое структурное и функциональное сходство с мембранным антигеном лимфоцитов CD2, который участвует в адгезии клеток и модуляции иммунного ответа. Установлено, что CD2v отвечает за способность вируса АЧС к гемадсорбции и играет важную роль в ускользании от воздействия эффекторов иммунной системы хозяина [13].
Фосфопротеин р30, кодируемый геном CP204L, является белком проникновения и выполняет регуляторную роль [14]. Установлена ведущая роль p30 на первых стадиях вирусной инфекции, так как антитела к p30 способны ингибировать процесс интернализации вируса в клетку [22].
Белок р54 является поздним белком и локализуется в вирусных фабриках, отвечает за прикрепление вируса АЧС к клетке хозяина. Его размеры варьируют между 24 и 28 кДа у различных вирусных изолятов. По данным Gomez-Puertas Р. е! al. (1996), гликопротеин р54, наряду с фосфопротеином р30, ответственен за формирование защитного иммунного ответа у иммунизированных свиней.
Полипротеин рр220, кодируемый геном CP2475L, представляет собой N-миристилированный полипептид, который после протеолитического процессинга дает р 150, р37, р34 и р 14. Эти белки присутствуют в зрелых вирионах в эквимолярных количествах и составляют около 1/4 общей массы белков вирионов. Они являются основными компонентами коровой оболочки вириона вируса АЧС [16].
Результаты, представленные в работе Suares C. ейа1., (2010) доказали, что полипротеин pp62 играет существенную роль в сборке вириона вируса АЧС. Репрессия синтеза полипротеина рр62 оказывает существенное влияние на формирование кора в икосаэдрических вирионах [18]. Полипротеин рр62 находится в центре коровой оболочки нуклеоида, взаимодействуя с двумя противолежащими слоями полипротеина pp220 [19].
Выявлена четкая корреляция между количеством полипротеина рр62, количеством полипротеина pp220 и формированием кора вирионов. Низкий уровень полипротеинов рр62 и pp220 приводил к формированию полых вирионов, которые практически лишены геномной ДНК [19].
Данная работа посвящена созданию репрезентативной клонотеки генов вируса АЧС, кодирующих белки p72, p30, p22, p12, CD2v, pp62, pp220 и p54, которые участвуют в процессе формирования вириона, или являются белками прикрепления и проникновения.
II. Материалы и методы
Для выделения ДНК вируса АЧС использовали пробы 10% суспензии селезенки свиней, павших от АЧС, изолята Krasnodar 06/12. Общий пул ДНК экстрагировали фенольно-детергентным методом.
Для получения и накопления ПЦР-продукта использовали: матричную ДНК с
концентрацией 100 мкг/мл по 1 мкл на реакцию, Taq- и Pfu- ДНК-полимеразы, буфер с (NH4)2SO4, 2,5мМ MgCl2, смесь трифосфатов 10мМ, (Fermentas), праймеры, фланкирующие гены (по 10пМ каждого). Общий объем реакционной смеси 20 мкл.
В работе были использованы следующие праймеры, приведенные в таблице 1.
Таблица 1
Нуклеотидные последовательности праймеров, использованных для амплификации генов вируса
АЧС
Назва- ние гена Назва- ние прай- мера Последовательность 5’ - > 3’ Дли- на п.о. Сайты рестрик -таз Источник
O61R Fp12/24 GCGGATCCTTGAATAAGCGTTAAC 24 BamHI Angulo A. et al., 1992
Rp12/25 GCGGATCCGACATCATTATGGATGA 25 BamHI
CP2475 L Fp220/26 TATGGTACCAATCATATAAGAATAAC 26 Kpnl Andres G. et al., 2002
Rp220/2 7 CGGCGGCCGCGACCAGGACTGCTTCTC 27 Notl
B646L Fp72/27 TATCAGGATCCTTCGCATAAACCGCCA 27 BamHI Neilan J.G. 2004
Rp72/27 GGAAGCCCACAGATCTAACCCATTGTG 27 BglII
CP204L Fp30/28 AGAGGTTGAAGATCCATGGTTACCCATT 28 NcoI J.G. Neilan et al., 2004
Rp30/28 CTAATAAATCTGGATCCTGCTGCTGCAG 28 BamHI
E183L Fp54/28 TTCTTGAGGATCCTTGGAAAGTTGGTCC 28 BamHI J.G. Neilan et al., 2004
Rp54/28 CTTATAATATACTGCAGTATGTTGAGTC 28 PstI
KP177R Fp22/27 CAGAAAGGATCCAATATTATGTAGACC 27 BamHI J.G. Neilan et al., 2004
Rp22/29 CGATGCACAATATTATAAGCTTTAAACC G 29 HindIII
CP530R pp62F ATAAGAATTCGATGCCCTCTAACATGAA A 29 EcoRI Казакова А.С, 19.01.2012
pp62R AGGAAGTCGACAGGTAAAACACACCAC AG 29 SalI
EP402R CD2vF2 ATAAAACGGATCCTGATAAAATGATAAT AC 30 BamHI
CD2vR2 TAGGAATTCTTAAATAATTCTATCTACGT G 30 EcoRI
Температуру отжига праймеров подбирали постановкой реакции с градиентом температур от 42 до 62°С с шагом 1°С на амплификаторе «Терцик» (ДНК-технологии, Россия). Учет результатов проводили методом электрофоретического разделения в 1,5%-ном агарозном геле с детектированием в УФ свете после окраски бромистым этидием.
Для проведения секвенирования выделили ПЦР-продукт из агарозного геля с помощью набора реагентов для элюции ДНК из агарозных гелей (Fermentas).
Web-ресурсы: для анализа нуклеотидных последовательностей генома штаммов и изолятов вируса АЧС использовали ресурсы международных баз данных NCBI, EMBL; сравнительный анализ гомологии нуклеотидных последовательностей генов проводили с помощью программ BioEdit 6.0.7 и MEGA 5.05.
Клонирование ПЦР-продуктов проводили согласно руководству T. Maniatis [23] в прокариотическом векторе pJET1.2 с использованием клеток Е. coli штамма DH5a.
III. Результаты и обсуждение
Нуклеотидные последовательности используемых нами праймеров содержат в себе сайты рестрикции для дальнейшего клонирования в экспрессирующих плазмидах.
Проведенный анализ расположения генов позволил определить места посадки праймеров на физической карте генома изолята Georgia 2007/1 вируса АЧС (Рисунок 1).
Рис. 1. Схема полноразмерного генома вируса АЧС штамма Грузия 2007/1 с расположением ОРС генов B646L, CP204L, KP177R, O61R, EP402R, CP530R, CP2475L и E183L (стрелками указано направления считывания клонированных генов, а в скобках отмечены позиции их локализации)
На основе предварительного анализа в ПЦР с диагностическими праймерами к p72FR и p12FR, были отобраны матрицы для оптимизации условий ПЦР и синтеза копий полноразмерных генов вируса АЧС.
Поскольку в ранее проведенных исследованиях были оптимизированы условия синтеза для генов, кодирующих белки р72, р30, р54 (Казакова А.С., 2013), р12 и р22 (Варенцова А.А., 2011), то подбор режимов амплификации проводили только для генов, кодирующих белки CD2v, pp220 и pp62.
Оптимизация условий синтеза проходила по подбору температурного режима отжига праймеров, концентрации ионов магния и количества циклов. В результате испытаний выбраны следующие режимы амплификации (таблица 2):
Таблица 2
Режим амплификации полноразмерной копии генов O61R, EP402R, CP2475L и CP530R
Параметры Кол-во циклов Температурный режим
EP402R CP2475L CP530R
Предварительный цикл 1 980С - 2 мин 980С - 2 мин 980С - 2 мин
Денатурация Отжиг праймеров Элонгация 35 950С - 30 сек 470С - 30 сек 720С - 120 сек 950С - 30 сек 500С - 30 сек 720С - 120 сек 950С - 30 сек 550С - 30 сек 720С - 120 сек
Завершающий цикл 1 720С - 5 мин 720С - 5 мин 720С - 5 мин
Подобранные праймеры и оптимизированные условия амплификации (таблица 2) позволили получить полноразмерные копии генов, пригодные для клонирования в прокариотическом векторе pJET1.2, и трансфецировать полученные конструкции в клетки Е. coli. В среднем, для проведения одной реакции лигирования ПЦР-продуктов размером более 1000 п.о. использовали от 50 до 100 нг ДНК вектора, для ПЦР-продуктов менее 1000 п.о. - от 20 до 50 нг ДНК вектора. Для трансформации использовали компетентные клетки E. coli штамма DH5a в концентрации 106 в 50 мкл.
Прокариотический вектор pJET1.2 подходит для клонирования ПЦР-продуктов, минуя стадию очистки ПЦР-продуктов от реакционной смеси. Использование данного вектора позволяет провести клонирование с возможностью получения до 100% положительных клонов, избавляя от необходимости проведения скрининга колоний. Данный вектор является производной высококопийной плазмиды рUC, которая содержит ген эндонуклеазы, продукт экспрессии которого ограничивает рост бактерий штаммов E.coli, которые обычно используют для клонирования.
ДНК полученных клонов была проанализирована в ПЦР на наличие встроек, которые были секвенированы. Для каждого гена были отобраны по 3 клона, содержащие гомологичную встройку.
Таким образом, была сконструирована клонотека из 24 клонов для 8 генов вируса АЧС: рекомбинантная плазмида pJET1CD2vKrasnodar06/12 содержит встройку размером 1134 п.о., плазмида pJET^^Krasnoda^/^ содержит встройку размером 421 п.о. (рисунок 2); плазмида pJET1р22Krasnodar06/12 содержит встройку размером 754 п.о., плазмида
pJET1р30Krasnodar06/12 содержит встройку размером 1134 п.о. (рисунок 3); плазмида pJET1р54Krasnodar06/12 содержит встройку размером 717 п.о., плазмида
pJET1рр62Krasnodar06/12 содержит встройку размером 1645 п.о. (рисунок 4); плазмида pJET1р72Krasnodar06/12 содержит встройку размером 1981 п.о., плазмида
pJET1рр220Krasnodar06/12 содержит встройку размером 1042 п.о. (рисунок 5).
Рис. 2. Схема рекомбинантной плазмиды pJET1.2, несущей ген EP402R (А) и ген O61R (Б) вируса
АЧС изолята Krasnodar 06/12.
Примечание: 1 - изображена встройка клонированного гена; 2 - полилинкер плазмиды pJET1.2; 3 -изображен ген Р-лактамазы. В центре изображены название и размер рекомбинантной плазмиды.
Рис.3. Схема рекомбинантной плазмиды pJET1.2, несущей ген KP177R (А) и ген CP204L вируса
АЧС изолята Krasnodar 06/12.
Примечание: 1 - изображена встройка клонированного гена; 2 - полилинкер плазмиды pJET1.2; 3 -изображен ген Р-лактамазы. В центре изображены название и размер рекомбинантной плазмиды.
Рис. 4. Схема рекомбинантной плазмиды pJET1.2, несущей ген E183L (А) и фрагмент гена CP530R
(Б) вируса АЧС изолята Krasnodar 06/12.
Примечание: 1 - изображена встройка гена, кодирующего р54; 2 - полилинкер плазмиды pJET1.2; 3 -изображен ген Р-лактамазы. В центре изображены название и размер рекомбинантной плазмиды.
Рис. 5. Схема рекомбинантной плазмиды pJET1.2, несущей ген B646L (А) и фрагмент гена CP2475L
(Б) вируса АЧС изолята Krasnodar 06/12.
Примечание: 1 - изображена встройка гена, кодирующего р72; 2 - полилинкер плазмиды pJET1.2; 3 -изображен ген Р-лактамазы. В центре изображены название и размер рекомбинантной плазмиды.
В результате проведенных работ создана клонотека, которая представляет собой набор генов (B646L, CP204L, KP177R, O61R, EP402R, CP530R, CP2475L и E183L), кодирующих структурные и иммунологически значимые белки вируса АЧС изолята Krasnodar 06/12, клонированных в составе векторной молекулы pJET 1.2. Объем клонированных генов вируса АЧС составляет 5,2% от полноразмерного генома изолята Krasnodar 06/12.
Нуклеотидные последовательности генов B646L(p72), CP204L(p30), KP177R, O61R, EP402R, CP530R, CP2475L и E183L вируса АЧС изолята Krasnodar 06/12 опубликованы в GenBank впервые.
Анализ нуклеотидных последовательностей клонированных генов показал, что нуклеотидные последовательности полноразмерных генов O61R, KP177R, CP204L, E183L и B646L и фрагментов генов CP530R и CP2475L изолятов Krasnodar 06/12 и Грузия 2007/1 идентичны.
Для нуклеотидных последовательностей клонированного фрагмента гена EP402R изолята Krasnodar 06/12 и аналогичного фрагмента изолята Грузия 2007/1 была установлена ~98,2%-ная гомология: были найдены две нуклеотидные замены в положениях нуклеотидов 990 и 994 аденин на цитозин и аденин на тимидин, соответственно.
1У.Заключение
Неудачи традиционных подходов к созданию вакцины против АЧС, стимулировало развитие других направлений создания средств специфической профилактики, таких как ДНК-вакцинация. Argilaguet J.M. et.al. (2012) показали, что иммунизация сплит-белком содержащим внеклеточный домен CD2v (sHA), p54 и p30, экспоненциально повышает гуморальный и клеточный ответ у свиней [6].
Создание репрезентативных клонотек ДНК последовательностей является эффективным подходом в разработке современных диагностических средств и рекомбинантных вакцин.
Таким образом, плазмидные конструкции pJET1CD2vKrasnodar06/12, pJET 1 р 12Krasnodar06/12, pJET 1 р22Krasnodar06/12, pJET 1 р3 0Krasnodar06/12,
pJET1р54Krasnodar06/12, pJET 1 р72Krasnodar06/12, pJET 1 рр62Krasnodar06/12,
pJET1рр220Krasnodar06/12, входящие в состав представленной в данной работе клонотеки, могут быть использованы для определения структуры отдельных генов, создания альтернативных источников генетического материала, как положительный контроль в ПЦР-диагностике, а также для получения рекомбинантных вирусов и ДНК-вакцин.
Литература
1. Arias, M. African Swine Fewer Eradication: The Spanish model // Trends in Emerging Viral Infections of Swine. 1st edn. Ed. A. Morilla, K. Jin and J. Zimmerman. - Ames (Iowa, USA): Iowa State University Press, 2002. - P.133-139.
2. Эпизоотическая ситуация по АЧС на территории Российской Федерации в 2012 г. (по данным на 15.10.2012 г.)/ Официальный сайт Россельхознадзора// [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.fsvps .ru/fsvps-docs/ru/iac/asf/2012/15102012/06.pdf.
3. Nunes M. J.F., Vigario J.D., Terrinha A.M.(1975) Ultrastructural study of African swine fever virus replication in cultures of swine bone marrow cells. Arch. Virol. 49:59-66
4. Carrascosa A.L., Sastre I., Vinuela E. (1991) African swine fever virus attachment protein. J. Viro.l 65:2283-2289
5. Carvalho ZG, Rodrigues-Pousada C (1986) African swine fever virus gene expression in infected Vero cells// J Gen Virol 67:1343-1350
6. DNA Vaccination Partially Protects against African Swine Fever Virus Lethal Challenge in the Absence of Antibodies/ J.M. Argilaguet, E. Perez-Martin, M. Nofrarias, C. Gallardo, F. Accensi, A. Lacasta, M. Mora, M. Ballester, I. Galindo-Cardiel, S. Lopez-Soria, J.M. Escribano, P.A. Reche, F. Rodriguez// PLoS One [Электронный ресурс]. - 2012. - Vol.7(9): e40942. - Шифр Информрегистра: doi: 10.1371/ journal.pone.0040942. - Режим доступа: www.plosone.org
7. Dixon LK, Abrams CC, Bowick G, Goatley LC, Kay-Jackson PC, Chapman D, Liverani E, Nix R, Silk R, Zhang F (2004) African swine fever virus proteins involved in evading host defence systems//Vet Immunol Immunopathol 100:117-134
8. Camacho A, Vinuela E (1991) Protein p22 of African swine fever virus: an early structural protein that is incorporated into the membrane of infected cells. Virology 181:251-257
9. Alcami A, Angulo A, Lopez-Otin C, Munoz M, Freije JM, Carrascosa AL, Vinuela E (1992) Amino acid sequence and structural properties of protein p12, an African swine fever virus attachment protein. J Virol 66:3860-3868
10. Almazan F, Rodriguez JM, Angulo A, Vinuela E, Rodriguez JF (1993) Transcriptional mapping of a late gene coding for the p12 attachment protein of African swine fever virus. J Virol 67:553-556
11. Angulo A, Vinuela E, Alcami A (1993) Inhibition of African swine fever virus binding and infectivity by purified recombinant virus attachment protein p12. J Virol 67:5463-5471
12. Angulo, A. Vinuela E., Alcami A. (1992) Comparison of the sequence of the gene encoding African swine fever virus attachment protein p12 from field virus isolates and viruses passaged in cell culture // J. Virol. -66: 3869-3872.
13. Borca M.V., Kutish G.K., Afonso C.L., Irusta P., Carrillo C., Brun A., Sussman M, Rock D.L. (1994b) An African swine fever virus gene with similarity to the T-lymphocyte surface antigen CD2 mediates hemadsorption //Virology 199:463-468.
14. Afonso C.L., Alcaraz C., Brun A., Sussman M.D., Onisk D.V., Escribano J.M., Rock D.L. (1992)Characterization of p30, a highly antigenic membrane and secreted protein of African swine fever virus//Virology 189:368-373.
15. Gomez-Puertas P., Rodriguez F., Oviedo J.M., Ramiro-Ibanez F., Ruiz-Gonzalvo F., Alonso C. Escribano
J.M. (1996) Neutralizing antibodies to different proteins of African swine fever virus inhibit both virus attachment and internalization// J. Virol. 70:5689-5694.
16. Andres, G., Simon-Mateo C., Vinuela E. (1993) Characterization of two african swine fever virus 220-kDa proteins: a precursor of the major structural protein p150 and an oligomer of phosphoprotein p32 // Virology. --194:284-293.
17. Dixon, L.K. The structure and function of the african swine fever genome/ L.K. Dixon// Rev. Sci. tech. Off. int. Epiz. - 1986. - Vol.5. - № 2. - P.469-475.
18. Suarez, C., Salas, M.L., Rodriguez, J.M., 2010b. African swine fever virus polyprotein pp62 is essential for viral core development// Journal of Virology 84 (1): 176-187.
19. Andres G, Alejo A, Salas J, Salas ML (2002) African swine fever virus polyproteins pp220 and pp62 assemble into the core shell. J Virol 76:12473-12482
20. General morphology and capsid fine structure of african swine fever virus particles/ J.L. Carrascosa, J.M. Carazo, A.L. Carrascosa [et al.]// Virology. - 1984. - Vol.132. - Р. 160-172.
21. Escudero, R.G. Inducible Gene Expression from African Swine Fever Virus Recombinants: Analysis of the Major Capsid Protein p72/ R.G. Escudero, G. Andres, F. Almazan, E. Vinuela// J. Virol. - 1998. -Vol.72. - № 4. - P.3185-3195.
22. Characterisation of p30 a highly antigenic membrane and secreted protein of african swine fever virus / C.L. Afonso, C. Alcaraz, A. Brun [et al.]// Virology. - 1992. - Vol.189(1). - P.368-373.
23. Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual/ J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis. - New York: Cold Spring Harbor. - 1989. - 1nd [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http:// www.genome.ou.edu/protocol_book/protocol_partII.html#II.F.
