CC BY
60
медицинским совет 2014 | № 17
В.И. КИСЕЛЕВ 1, д.б.н., чл.-корр. РАН, В.М. ДРУХ 1, к.м.н., И.Н. КУЗНЕЦОВ 2, к.б.н., ЕЛ. МУЙЖНЕК 3, к.б.н., И.А. АПОЛИХИНА 4, д.м.н., профессор, Е.А. ГОРБУНОВА 4, О.И. ПЧЕЛИНЦЕВА 1
1 Российский университет дружбы народов, Москва 2 Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова 3 ЗАО «МираксБиоФарма», Московская обл. 4 Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова, Москва
КОНСЕРВАТИВНАЯ ТЕРАПИЯ CIN I-II
ВАГИНАЛЬНЫМИ СУППОЗИТОРИЯМИ ЦЕРВИКОН-ДИМ
(ПРОМЕЖУТОЧНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ КЛИНИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ)
CIN наиболее распространена у женщин репродуктивного возраста. Существующие стандарты лечения CIN I и/или CIN II инвазивны и агрессивны, что порой приводит к нарушению репродуктивной функции.
В то же время длительное динамическое наблюдение и тактика невмешательства могут повлечь за собой дальнейшее прогрессирование процесса. Поэтому поиск консервативного метода лечения CIN I-II остается актуальным. Проведенное нами многоцентровое рандомизированное плацебо-контролируемое
двойное слепое исследование в параллельных группах показало, что применение вагинальных суппозиториев Цервикон-ДИМ в течение 90 дней в дозе как 200 мг/сут, так и 100 мг/сут сопровождается улучшением гистологической картины течения CIN I-II и даже ее излеченностью.
Ключевые слова: цервикальная интраэттелиальтя нео-птзия, CIN I, CIN II, ВПЧ, дииндолилметан, ДИМ, Цервикон-ДИМ, клиническое исследование
Jля цервикальной интраэпителиальной неоплазии (CIN) характерна интенсивная пролиферация атипических клеток с нарушением нормального расположения слоев эпителия шейки матки. Эти изменения предшествуют развитию рака шейки матки (РШМ), поэтому цель лечения CIN - предупредить озлокачествление. Персис-тирующая инфекция онкогенными типами вируса папилломы человека (ВПЧ) может привести к развитию CIN, а в 15-20% - к РШМ [1]. Но продуктивная репликация ВПЧ возможна лишь в клетках, находящихся в стадии необратимой дифференцировки, иначе инфекция приобретает абортивный характер. Поэтому в процессе формирования CIN ВПЧ поражает стволовые клетки не под многослойным плоским эпителием, а в переходной зоне, под цилиндрическим эпителием зоны трансформации (ЗТ) и эндоцервикальных крипт. Репликация ДНК ВПЧ начинается с образования онкопроте-инов Е6 и Е7, приводящих к трансформации вирус-инфици-рованных клеток [2]. Онкобелок Е7 выявляется во всех клетках, инфицированных ВПЧ и начавших неопластическую трансформацию вплоть до развития РШМ [3]. Вышеизложенное определяет необходимость терапии CIN и вирусных цервицитов, нацеленной на снижение персистенции ВПЧ как предикции РШМ [4].
Изменения на шейке матки, вызванные ВПЧ, локализуются в эстроген-чувствительных зонах. Постоянство пролифе-ративной активности клеток в эстроген-чувствительных тка-
нях контролируется механизмами, конвертирующими эстра-диол в его биологически активные производные: 1ба-гидро-ксиэстрон (1ба-ОНЕ1) и 2-гидроксиэстрон (2-ОНЕ1). 16а-ОНЕ1 является «агрессивным» гормоном с канцерогенным эффектом [5]. 2-ОНЕ1, напротив, нормализует клеточный рост: при повышении его концентрации наблюдается гибель опухолевых клеток и профилактика их образования [6, 7]. В здоровых эпителиальных клетках шейки матки эстрадиол не превращается в 1ба-ОНЕ1. Там же, где активно экспрессиру-ют белки ВПЧ, выявлен высокий уровень 1ба-ОНЕ1 - почти как в клетках рака молочной железы. Таким образом, активная репродукция ВПЧ катализирует синтез «агрессивного» метаболита в инфицированных клетках [8]. При этом онкобелок Е7 и 1ба-ОНЕ1 взаимно усиливают продукцию друг друга, образуя порочный патогенетический круг, что приводит к опухолевой трансформации [8].
3,3'-дииндолилметан (ДИМ) - продукт физиологической конверсии индол-3-карбинола (И3К) с широким спектром противоопухолевой активности, что подтверждено в экспериментах на животных моделях и в клинических исследованиях [9]. В опухолевых клетках ДИМ блокирует синтез онкобелка Е7, препятствует конверсии эстрадиола в 1ба-ОНЕ1, индуцирует процессы избирательного апоптоза вирус-инфицированных клеток [10-13], также ДИМ препятствует миграционной, инва-зивной и ангиогенной активности опухолевых стволовых клеток [14, 15], которые, согласно современным представлениям, выступают главной причиной рецидивов и метастазов [16].
В настоящее время существуют фармацевтические композиции на основе ДИМ для перорального применения: форму-ляция ВюКе8роше^1М (ВМШ) на основе TPGS [17]; компо-
медицинский ^^^ совет 2014 | № 17
зиция в виде раствора из 150 мг ДИМ и вспомогательных компонентов органического происхождения [18]; формуля-ция на основе плюроника. Учитывая особенности размножения и персистенции ВПЧ в эпителии шейки матки, на основе ДИМ разработана композиция для вагинального применения (Цервикон-ДИМ), у которой за счет местного использования достигаются более высокие концентрации ДИМ в пораженной ткани, чем у пероральных лекарственных форм [19].
Исходя из вышесказанного, целью нашего исследования стала оценка эффективности 90-дневного курса консервативного лечения CIN I и/или CIN II у женщин репродуктивного возраста вагинальными суппозиториями Цервикон-ДИМ, содержащими 100 мг ДИМ в 1 суппозитории, в зависимости от суточной дозы ДИМ и при сравнении с группой плацебо.
Материал и методы исследования. В исследовании участвовало 78 пациенток репродуктивного возраста в соответствии со всеми нижеперечисленными критериями включения:
■ женщины от 18 до 39 лет с диагнозом CIN I и/или CIN II, верифицированным гистологически;
■ кольпоскопическая картина поражений шейки матки на фоне ЗТ I типа с площадью участков патологического эпителия не менее 1,5 см2;
■ информированное согласие пациентки на участие в исследовании и возможность прекратить лечение в случае побочных проявлений или других причин при устном отказе больной;
■ согласие использовать барьерный метод контрацепции (презерватив) в течение всего срока исследования.
Критериями невключения служил один из нижеперечисленных признаков:
■ беременность или кормление грудью;
■ CIN III или cancer in situ (CIS);
■ злокачественные новообразования любой локализации;
■ инфекции мочеполовой системы в фазе активного воспаления;
■ заболевания сердечно-сосудистой и нервной системы, сопутствующая почечная или печеночная недостаточность;
■ положительные тесты RW или ВИЧ;
■ злоупотребление алкоголем, наркотическая или лекарственная зависимость;
■ прием любого экспериментального препарата за 30 дней до применения первой дозы исследуемого препарата.
Данное клиническое исследование было многоцентровым рандомизированным плацебо-контролируемым двойным слепым и проводилось в параллельных группах. За 45 дней до его начала выполнялся скрининг, включающий сбор анамнеза, физикальный осмотр, клинический и биохимический анализы крови и мочи, ЭКГ, УЗИ органов малого таза, цитологическое исследование, расширенную кольпоскопию (РКС) с фотофиксацией изображения и биопсию шейки матки. После рандомизации женщин разделили на три группы. 1-я группа (n = 26) получала интравагинально ДИМ по 200 мг/сут, 2-я группа (n = 26) - ДИМ по 100 мг/сут и плацебо, 3-я группа получала 2 раза в сутки только плацебо. Лечение продолжалось 90 дней. Применялись вагинальные суппозитории Цервикон-ДИМ (ЗАО «ИльмиксГрупп», Россия), в состав каж-
дого входило активное вещество (химическая субстанция ДИМ 100 мг) и вспомогательные вещества (жир твердый 1,9795 г, кросповидон 0,02 г, краситель кармин красный 0,0005 г). Каждый суппозиторий с плацебо содержал жир твердый 2,0795 г, кросповидон 0,02 г, краситель кармин красный 0,0005 г [19]. Предусматривалось 3 визита: в начале исследования, через 30 и 90 дней от старта исследования, в течение которых проводили обследование: клинические анализы крови и мочи, цитологическое исследование, РКС с фотофиксацией изображения, биопсию выявленных при РКС пораженных участков с гистологическим исследованием. Качественный общий и качественный с типированием ВПЧ-тесты на вирусы 16-го и 18-го типов выполнялись в начале исследования и через 90 дней. Эффективность лечения оценивали по динамике эрадикации ВПЧ (ДНК) и данным РКС и морфологического исследования биоптатов шейки матки.
Забор ткани для гистологической оценки выполнялся под контролем кольпоскопа с помощью конхотомных биопсий-ных щипцов для исключения коагуляции краев биоптата и лишь при выявлении патологической ЗТ, атипичных сосудов, йоднегативного и ацетобелого эпителия с мозаикой и/или пунктацией. Морфологическое исследование как инвазив-ный метод было итоговым диагностическим этапом и выполнялось сначала в локальной лаборатории исследовательского центра, затем - в центральной лаборатории на базе ГБОУ ВПО «РМАПО». Эффективность терапии оценивали по доле пациенток с полной регрессией CIN через 90 дней лечения на основании данных гистологического исследования как золотого стандарта в диагностике CIN. Сохранение фокусов CIN в биоптатах считалось отрицательным ответом на лечение. О частичной регрессии CIN сообщалось в случае, если CIN II перешла в CIN I. Окончательный анализ данных будет сделан по окончании 6 мес. терапии.
■ Репликация ДНК ВПЧ начинается с образования онкопротеинов Е6 и Е7, приводящих к трансформации вирус-инфицированных клеток. Онкобелок Е7 выявляется во всех клетках, инфицированных ВПЧ и начавших неопластическую трансформацию вплоть до развития РШМ
Исследование было одобрено комитетом по этике при Федеральной службе по надзору в сфере здравоохранения и социального развития и локальными этическими комитетами исследовательских центров.
Статистическая обработка данных выполнена на компьютере с помощью пакета прикладных программ IBM® SPSS® Statistics версии 20.0.0 (IBM® Corporation). Для определения статистической значимости различий между группами использовались критерий хи-квадрат (с2) и точный критерий Фишера. Уровень значимости принимался не более 0,05 (двусторонний критерий). Оценка 95%-ных доверительных интервалов (ДИ) для показателя с бинарным типом шкалы выполнена по Клопперу - Пирсону.
медицинский совет 2014 | № 17
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ
В исследование включили женщин в возрасте от 19 до 39 лет, средний возраст пациенток в 1-й группе составил 26 лет, во 2-й и 3-й - 27 лет. Следовательно, у молодых женщин CIN
1-II встречалась чаще всего, что подтверждает результаты отечественных и международных исследований. Группы исследования не различались между собой по основным демографическим показателям: росту, массе тела, индексу массы тела, что позволило объединить их для анализа согласно цели исследования, считая выборку исследования гомогенной.
В соответствии с протоколом лечения исследование завершила 61 пациентка. Из них качественный общий ВПЧ-тест и качественный ВПЧ-тест на 16-й и 18-й типы вирусов были положительными у 49 пациенток (80,33%). Эрадикация ВПЧ через 90 дней лечения, согласно данным общего ВПЧ-теста, произошла в 70,59% в 1-й группе, в 58,82% во 2-й группе и в 46,67% в группе плацебо (95% ДИ). Значимых различий между числом пациентов с положительным ответом на лечение не выявлено между 1-й и 3-й группами: p = 0,155 (точный критерий Фишера); p = 0,169 (критерий с2-квадрат) и между
2-й и 3-й группами: p = 0,370 (точный критерий Фишера); p = 0,492 (критерий с2-квадрат).
При контрольном осмотре через 90 дней лечения нормальная кольпоскопическая картина выявлена в 45,83% в 1-й группе, в 36% во 2-й и в 34,78% в группе плацебо (95% ДИ). Несмотря на очевидную благоприятную картину при РКС в 1-й группе, значимых различий между числом пациентов с положительным ответом на лечение между группами не выявлено.
■ Неинвазивный метод является новым и перспективным в консервативном лечении CIN у женщин репродуктивного возраста, демонстрируя бережный и щадящий подход, т. к. исключает коагуляционные повреждения
шейки матки, и патогенетическое обоснование, учитывая механизм влияния ДИМ на трансформацию клеток, пораженных ВПЧ, и продукцию белка Е7
По данным гистологического исследования, полная регрессия CIN произошла у 17 пациенток 1-й группы (85%) и у 15 из 2-й (68,2%) (95% ДИ). В группе плацебо CIN не выявилась у 10 пациенток (52,6%). После окончания лечения женщины, не имеющие признаков CIN, прекращали применять исследуемый препарат. Во 2-й группе не установлено статистически значимых отличий между числом пациентов с положительным и отрицательным ответами на лечение через 90 дней терапии: р = 0,181 (точный критерий Фишера); р = 0,201 (критерий с2), что связано с небольшим размером выборки. Эффективность лечения во 2-й группе не различалась с 3-й группой (68,20 против 52,60% соответственно), т. к. значимых различий между числом пациен-
тов с положительным ответом на лечение между двумя группами не выявилось: р = 0,243 (точный критерий Фишера); р = 0,309 (критерий с2). Напротив, эффективность терапии в 1-й группе была значимо выше, чем в группе плацебо (85 против 52,6%): р = 0,032 (точный критерий Фишера); р = 0,029 (критерий с2). Таким образом, была очевидна эффективность при лечении CIN I-II вагинальных суппозиториев на основе ДИМ в дозе 200 мг/сут в течение 90 дней.
Из 34 нежелательных явлений в ходе исследования для 4 случаев установлена их связь с приемом препарата (жжение и зуд во влагалище - 2 случая, крапивница - 1 случай, ОРВИ -1 случай). Наличие у препарата способности приводить к ОРВИ сомнительно из-за отсутствия данных о возможных механизмах этого явления.
В ряде плацебо-контролируемых клинических исследований детально уточнялась эффективность применения перо-ральных субстанций И3К и ДИМ у пациенток с CIN [20-22]. Экспериментальные исследования активной субстанции ДИМ in vitro и in vivo дают основания для оценки ее клинической эффективности в профилактике и лечении РШМ [1013, 23, 24]. Поэтому предполагается высокая противоопухолевая и противовирусная активность препарата на основе ДИМ в отношение эпителия шейки матки, пораженного ВПЧ. Цервикон-ДИМ при интравагинальном введении обладает высокой местной биодоступностью - 72-73% от введенной дозы ДИМ распределяется в тканях влагалища, но низкой системной абсорбцией - лишь 3-4% ДИМ выявляется в системном кровотоке. Полученные нами данные продемонстрировали выраженное влияние ДИМ на эрадикацию ВПЧ: при применении ДИМ в дозе 200 мг/сут эрадикация ВПЧ произошла в 70% случаев. Это открывает перспективы в терапии ВПЧ-ассоциированных цервицитов с помощью данной фармакологической композиции.
В доклинических исследованиях при гистологической оценке тканей шейки матки после аппликации Цервиконом-ДИМ выявлялась полная эпителизация поверхности эрозии на фоне отсутствия воспалительной инфильтрации в под-слизистом слое. Наше исследование продемонстрировало, что эффективность Цервикона-ДИМ напрямую зависит от дозы препарата, т. к. при дозе 200 мг/сут, применяемой в течение 90 дней, происходила значительная нормализация кольпоскопической картины и регрессия CIN по морфологическим данным.
При изучении фармакокинетики Цервикона-ДИМ показано, что после его интравагинального введения в дозе 100 мг в системном кровотоке экспериментальных животных концентрация ДИМ начинает выявляться через 15 мин, достигая максимальной через 1,5 ч. Среднее время присутствия препарата в организме (показатель MRT) составляет около 5,5 ч, период полувыведения (Т V) - до 3,5 ч. Данные о накоплении препарата в организме и возможности его кумуляции в проведенных ранее исследованиях не выявлялись. Таким образом, Цервикон-ДИМ характеризуется высоким уровнем безопасности и переносимости, что объясняется его лекарственной формой и зоной воздействия.
медицинский ^^^ совет 2014 | № 17
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Единого подхода к лечению CIN I и/или CIN II у молодых женщин в России пока нет. Деструктивное лечение, несмотря на свою доказанную эффективность, травматично и может нарушать репродуктивные планы пациентки. Напротив, длительное динамическое наблюдение и тактика невмешательства опасны из-за риска дальнейшего прогрессирования процесса. Поэтому поиск консервативного и безопасного способа лечения CIN I-II остается актуальным. Наше исследование показало, что лечение в течение 90 дней препаратом Цервикон-ДИМ в дозе как 200 мг/сут, так и 100 мг/сут при интравагинальном введении приводит к улучшению гистологической картины течения CIN I-II и даже ее излеченности. Статистически значимо выше была эффективность терапии в группе пациенток, принимавших препарат по 200 мг/сут, при сравнении с группой плацебо. Безусловно, такой неинва-зивный метод является новым и перспективным в консервативном лечении CIN у женщин репродуктивного возраста, демонстрируя бережный и щадящий подход, т. к. исключает коагуляционные повреждения шейки матки, и патогенетическое обоснование, учитывая механизм влияния ДИМ на трансформацию клеток, пораженных ВПЧ, и продукцию
белка Е7. Из-за высокой биодоступности и минимальной абсорбции действующего вещества местная аппликация ДИМ, в отличие от системного применения, характеризуется высоким уровнем безопасности и переносимости.
Необходимо отметить, что представленные здесь данные промежуточные. Для уточнения оптимальной дозировки и длительности курса лечения Цервиконом-ДИМ начаты клинические исследования.
Авторы выражают признательность клиническим центрам и исследователям, принимавшим участие в работе: Л.А. Ашрафян (Москва); А.В. Головач (Дзержинский, Московская обл.); Т.Н. Коломойцева (Пермь); В.Е. Радзинский (Москва); С.П. Селиванов (Томск); Л.В. Сутурина (Иркутск); Н.И. Фадеева (Барнаул); Р.Ш. Хасанов (Казань); В.Б. Цхай (Красноярск); И.В. Шамина (Омск).
Научно-исследовательские и опытно-конструкторские работы выполнены в ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» в рамках исполнения комплексного проекта по созданию высокотехнологичного производства «Производство лекарственных средств на основе биотехнологий для лечения социально значимых заболеваний», финансируемого Министерством образования и науки РФ в соответствии с Постановлением Правительства РФ №218.
ЛИТЕРАТУРА
1. Дмитриева Г.А., Биткина О.А. Папилломавирусная инфекция. М.: Медицинская книга, 2006: 76.
2. Маянский А.Н. Патогенетическая микробиология: Руководство. Н. Новгород: Изд-во Нижегородской государственной медицинской академии, 2006: 520.
3. Апгар Б.С., Броцман Г.Л., Шпицер М. Клиническая кольпоскопия. М.: Практическая медицина, 2012: 496.
4. Маянский А.Н. Папилломавирусы человека: Возбудители доброкачественных и злокачественных неоплазий. Вопросы диагностики в педиатрии, 2010, 2 (2): 5-11.
5. Schneider J et al. Abnormal oxidative metabolism of estradiol in women with breast cancer. Proc Natl acad Sci USA, 1982, 79 (9): 3047-51.
6. Chung SH, Wiedmeyer K, Shai A et al. Requirement for estrogen receptor a in a mouse model for human papillomavirus-associated cervical cancer. Cancer Res, 2008, 68 (23): 9928-9934.
7. Morimoto Y et al. Urinary estrogen metabolites during a randomized soy trial. Nutr Cancer., 2012, 64 (2): 307-14.
8. Киселев В.И. Вирусы папилломы человека в развитии рака шейки матки. М.: ДГГ, 2004: 184.
9. Banerjee S. Attenuation of multi-targeted proliferation-linked signaling by 3,3'-diindolylmethane (DIM): from bench to clinic. Banerjee S, Kong D, Wang Z. MutatRes., 2011, 728: 47-66.
10. Zhu J, Li Y, Guan C, Chen Z. Anti-proliferative and pro-apoptotic effects of 3,3'-diindolylmethane in human cervical cancer cells. Oncol Rep., 2012, 28 (3): 1063-8.
11. Chen DZ, Qi M, Auborn KJ, Carter TH. Indole-3-carbinol and diindolylmethane induce apoptosis of human cervical cancer cells and in murine HPV16-transgenic preneoplastic cervical epithelium.J. Nutr., 2001, 131 (12): 3294-3302.
12. Sepkovic DW, Stein J, Carlisle AD et al. Diindolylmethane inhibits cervical dysplasia, alters estrogen metabolism, and enhances immune response in the K14-HPV16 transgenic mouse model. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 2009, 18 (11), 2957-2964.
13. Dalessandri KM, Firestone GL, Fitch MD, Bradlow HL, Bjeldanes LF. Pilot study: effect of 3,3'-diindolylmethane supplements on urinary hormone metabolites in postmenopausal women with a history of early-stage breast cancer. Nutr Cancer, 2004, 50 (2): 161-7.
14. Chang, X et al. 3,3'-Diindolylmethane inhibits angiogenesis and the growth of transplantable human breast carcinoma in athymic mice. Carcinogenesis, 2005, 26 (4): 771-8.
15. Kim EJ, Shin M, Park H, Hong JE, Shin HK, Kim J et al. Oral administration of 3,3'-diindolylmethane inhibits lung metastasis of 4T1 murine mammary carcinoma cells in BALB/c mice.J.Nutr, 2009, 139 (12): 2373-9.
16. Semov A, Iourtchenko L, Liu LF, Li S, Xu Y, Su X et al. Diindolylmethane (DIM) selectively inhibits cancer stem cells. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2012; 424 (1): 45-51.
17. Zeligs MA et al. US patent 6.416.793, Formulation and use of controlled-release indole alkaloids.
18. Kiselev VI. Diindolylmethane-based drug for the treatment of hyperplastic and inflammatory diseases. WO 2011/136691 A1. 2011.
19. Киселев В.И. Суппозитории вагинальные на основе 3,3'-дииндолилметана (метиндола) (RU 2318510).
20. Bell MC et al. Placebo-controlled trial of indole-3-carbinol in the treatment of CIN. Gynecol Oncol., 2000, 78(2): 123-9.
21. Giuseppe Del Priore, Deleep Kumar Gudipudi, Nadine Montemarano, Antonella M Restivo, Jeanetta Malanowska-Stega, Alan A Arslan. Oral diindolylmethane (DIM): pilot evaluation of a nonsurgical treatment for cervical dysplasia. Gynecol Oncol, 2010, 116 (3): 464-7.
22. Zeligs MA, Sepkovic DW, Manrique C. Absorption-enhanced 3,3'-diindolylmethane: human use in HPV-related, benign and pre-cancerous conditions. Proc Am. Assoc. Cancer Res., 2003, 44.
23. Carter TH, Liu K, Ralph W et al. Diindolylmethane alters gene expression in human keratinocytes in vitro.J. Nutr, 2002, 132 (11): 3314-3324.
24. Savino JA, Evans JF, Rabinowitz D, Auborn KJ, Carter TH. Multiple, disparate roles for calcium signaling in apoptosis of human prostate and cervical cancer cells exposed to diindolylmethane. Mol Cancer Ther, 2006, 5 (3): 556-63.
