CC BY
30
КОНКУРС ПО СПЕЦИАЛЬНОСТИ «ГЕПАТОЛОГИЯ», VIII СЪЕЗД НОГР
(ВТОРАЯ ПРЕМИЯ)
АПОПТОЗ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТАХ А, В И С У ДЕТЕЙ И ВЛИЯНИЕ НА НИХ ПРЕПАРАТОВ УРСОДЕОКСИХОЛЕВОЙ КИСЛОТЫ
Матанина Н. В., Рейзис А. Р.
ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва
РЕЗЮМЕ
SUMMARY
Апоптоз играет важную роль в развитии и течении вирусных заболеваний. Понимание процесса активации и осуществления апоптоза имеет большое значение для разработки оптимального патогенетического лечения вирусных гепатитов. У 144 детей с гепатитами А, В и С изучен апоптоз лимфоцитов периферической крови (ЛПК) методом цитофлуориметрии с йодистым пропидием и возможности его коррекции с помощью препаратов УДХК (урсосан). Полученные данные позволили сформулировать концепцию важной роли апоптоза и антиапоптотической терапии при вирусных гепатитах: 1) Апоптоз ЛПК — важнейшее звено патогенеза вирусных гепатитов, требующее специального медикаментозного воздействия. 2) Частота повышения апоптоза ЛПК при ВГ достигает 80-95,8%, а уровень находится в прямой корреляции со степенью холестаза, цитолиза, вирусной репликации и течением инфекции. 3) Препарат урсосан обладает выраженным антиапоптотическим действием, что является патогенетическим обоснованием его применения при вирусных гепатитах с целью улучшения их течения.
Apoptosis plays an important role in the pathogenesis of viral hepatitis (VH), affecting not only hepatocytes but also immune cells. However, the occurrence of apoptosis in peripheral blood lymphocytes (PBL) during the course of VH in children has not been described. The aim of this study was to measure the level of PBL apoptosis during VH in children, and to test its possible correction by ursodeoxycholic acid (UDCA). Apoptosis was determined by flow cytometry using propidium iodide (PI) staining for hypodiploid cells. The apoptosis of PBL is closely correlated with the severity and progression of hepatitis A, B and C in children. Furthermore, the improved course and outcomes of the disease following UDCA treatment are associated with the reduction of PBL apoptosis.
Прогресс в лечении вирусных инфекций, в том числе вирусных гепатитов, особенно хронических, тесно связан с эволюцией взглядов на их патогенез [3, 4]. Открытие апоптоза стимулировало изучение роли этого явления в патологии печени [1, 2, 6]. При вирусных гепатитах изменения касаются не только клеток печени, главной мишени апоптоза, но и им-мунокомпетентных клеток крови — лимфоцитов [1, 2]. В последние годы делаются попытки медикаментозного воздействия на апоптоз. Одним из таких препаратов является урсодеоксихолевая кислота (УДХК), которая обладает разносторонним патогенетическим действием [5, 7].
У детей при вирусных гепатитах различной этиологии характер и выраженность апоптоза и влияние на эти процессы урсодеоксихолевой кислоты не изучены.
Цель исследования: получить представление
о значении апоптоза лимфоцитов периферичес-
00
О
о
сч
кой крови (ЛПК) в патогенезе острых и хронических ВГ у детей и воздействии на него УДХК (урсосана).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе представлены результаты клинико-лабораторного обследования 174 детей в возрасте от 3 до 15 лет.
На этапе изучения влияния препарата УДХК (урсосан) на апоптоз лимфоцитов периферической крови и клиническое течение вирусных гепатитов А, В и С дети были рандомизированы в две группы сравнения: получавшие базис-терапию и получавшие лечение препаратом УДХК. Группы были сравнимы по возрастно-половому составу и основным клиническим характеристикам. Доза препарата УДХК назначалась с учетом массы ребенка 10 - 12мг / кг / сут. Длительность приема
і
Г-v
О
Рис. 1. Динамика уровня апоптоза лимфоцитов крови при острых гепатитах А и В у детей
препарата при остром гепатите А и В составляла
1 -6 месяцев. Максимальный курс приема при хроническом вирусном гепатите В и С — до полутора лет.
Метод детекции апоптоза ЛПК — проточная цитофлуориметрия с окрашиванием ДНК клеток йодистым пропидием и измерением процента ги-подиплоидных клеток.
В связи с абсолютной новизной исследования апоптоза при вирусных гепатитах у детей в первую очередь нами были установлены показатели апоптоза ЛПК у практически здоровых детей в возрасте 3-15 лет, оказавшиеся равными 0,77 ± 0,05%, что статистически значимо отличается от показателей здоровых взрослых 1,2 ± 0,2% (Е. В. Дмитриева, 2003). Более низкий, чем у взрослых, уровень апоптоза у здоровых детей может быть объяснен общебиологической целесообразностью преобладания пролиферативных процессов над процессами клеточной гибели в интенсивно растущем организме.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Как показали наши исследования, при остром циклическом течении ГА и ГВ показатели апоптоза ЛПК в разгаре заболевания в 46,3 раза
%
разгар реконвалесценция норма
23-30 д.б.
0 Легкая
ЕИ Среднетяж. и тяжёлая формы
Рис. 2. Соотношение уровня апоптоза ЛПК с тяжестью гепатита А
превышают норму, существенно снижаясь по мере стихания процесса. В периоде ранней реконвалесценции уровень апоптоза уменьшается значительно, но еще не до нормы. При этом динамика показателей апоптоза лимфоцитов крови была независима от этиологии гепатита (рис. 1).
Не выявлена связь апоптоза ЛПК с тяжестью острых вирусных гепатитов: при легкой форме ГА уровень апоптоза ЛПК так же высок в фазе разгара (37,3 ± 7,9%), как при среднетяжелых и тяжелых формах (33,7 ± 5,1%) (рис. 2). В фазу реконвалесцен-ции (на 23 -30-й день болезни) при легкой и среднетяжелой формах гепатита А отмечено одинаково существенное снижение уровня апоптоза ЛПК.
Однако отмечена четкая взаимосвязь апоптоза ЛПК с течением вирусного гепатита. Оказалось, при затяжном течении вирусного гепатита А уровень апоптоза ЛПК в фазе разгара заболевания в 2,6 раза ниже уровня апоптоза ЛПК при остром циклическом течении (13,2 ± 5,4%, p < 0,05), остается существенно выше в периоде реконвалесценции на 40-60-й день болезни (10,4 ± 2,7%) и не снижается на 70- 180-й день болезни (8,1 ± 2,6%), отражая длительный характер фазы восстановления (рис. 3).
♦ острое течение ГА ш затяжное течение
*35’7
\
\ P<0,05
\
\ _ 10,4
ИМ
• ♦ 2,6
разгар
40-60 д.б.
70-180 д.6.
Рис. 3. Динамика показателей апоптоза ЛПК при остром и затяжномтечении вирусного гепатита А
Рис. 4. Соотношение уровня апоптоза ЛПК и уровня билирубина при гепатитах А и В
лауреаты премий
winners of scientific competitions
00
о
28,5
р<0,05 гАЛТ до 2 АЛТ норм более 3 норм
Рис. 5. Соотношение уровня апоптоза ЛПК и активности цитолиза
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
п
г
й
¥
Й
Й
і
Й
О повышенная активность АЛТ □ нормальная АЛТ
□ повышенный билирубин Шнормальный билирубин
Рис. 6. Частота повышения апоптоза ЛПК при нормальных показателях цитолиза и билирубина при гепатитах А и В
Изучение связи апоптоза ЛПК и биохимических показателей при вирусных гепатитах А и В выявило, что соотношение апоптоза ЛПК и билирубина выражается в высоких цифрах апоптоза ЛПК (47,2 ± 8,8%, p < 0,05) при сравнительно высоком уровне билирубина (3-5 и более норм), при низких значениях билирубина цифры апоптоза ЛПК вдвое ниже (26,1 ± 4,4%, p < 0,05) (рис. 4). Полученные данные достоверно отражают связь апоптоза ЛПК с холестазом.
Уровень апоптоза ЛПК также значительно выше при более высоких цифрах аланинаминотранс-фераз (рис. 5), что подтверждает связь цитолиза в гепатоцитах с апоптозом лимфоцитов крови. Однако при оценке не уровня, а частоты повышения апоптоза ЛПК выявляется, что при нормальных показателях билирубина и АЛТ апоптоз также оказывается в той или иной степени повышенным почти у всех детей с вирусным гепатитом (рис. 6). Возможно, воздействие на апоптоз в этом периоде может существенно повлиять на течение и исход инфекции.
По нашим данным, для хронического течения вирусных гепатитов В и С характерен высокий уровень апоптоза ЛПК, в 15-18 раз превышающий норму (14,08 ± 3,1% и 13,8 ± 2,3% соответственно) и не зависящий существенно от этиологии хронических гепатитов.
При ХГ В и С степень повышения уровня апоптоза ЛПК отражает наличие или отсутствие вирусной репликации (РНК ВГС или ДНК ВГВ в ПЦР). У детей с обнаружением маркеров репликации уровень апоптоза выше — 13,1 ± 1,8, чем при их отсутствии — 8,5 ± 1,5 ^ < 0,05) (рис. 7).
В отличие от острого гепатита при ХГ В и С значимую связь показателей апоптоза ЛПК с билирубином выявить не удалось: уровень апоптоза лимфоцитов крови оказался выше нормы — 11,6 ± 1,4% как при нормальных значениях общего билирубина, так и при билирубине в 1,5 раза выше верхней границы нормы — 9,4 ± 5,9%, что по-видимому, связано с тем, что у детей с ХГ В и С манифестного холестаза и высоких цифр билирубина не наблюдалось.
Связь апоптоза ЛПК с цитолизом, по нашим данным, присутствует при хроническом течении гепатита В и С достоверно (при АЛТ в пределах нормы — 9,2 ± 1,4, при АЛТ выше нормы — 17,1 ± 2,9, р < 0,05): при повышении апоптоза происходит активация хронического процесса. Однако при ХГ В и С апоптоз остается в той или иной степени повышенным у 100% детей и в фазе полной ремиссии, что говорит о важности этого показателя как самостоятельного маркера хронического течения процесса и особой роли его в патогенезе инфекции.
30
20
10
ПЦР РНК ВГС или ДНК ВГВ
13,1
І І І І I р<0,05 8,5
т
%
6-. .5,8 5 '
4 '
3 ' 2 1 '
25-30
день
болезни
р<0,05
0,77
□ базис -терапия
О курс препарата УДХК
[□норма апоптоза
сч
т
Рис. 7. Уровень апоптоза ЛПК (%) при хроническом течении Рис. 8. Влияние препарата УДХК на уровень апоптоза ЛПК
гепатитов В и С в соответствии с вирусной репликацией в фазе ранней реконвалесценции
Рис. 9. Динамика значений апоптоза ЛПК и трансаминаз в фазы разгара и реконвалесценции при остром гепатите А
В ходе проведенного открытого контролируемого рандомизированного исследования влияния препарата УДХК (урсосан) на апоптоз ЛПК показано следующее.
При остром гепатите А по мере стихания процесса в фазе ранней реконвалесценции (25-30-й день болезни) уровень апоптоза в группе детей, получавших урсосан, снижается значительно (2,8 ± 0,4%) в отличие от группы детей, находившихся на базис-терапии, где апоптоз ЛПК остается еще весьма высоким (5,8 ± 1,1%) (рис. 8).
При одновременной оценке уровня апоптоза ЛПК и значений трансаминаз, мы отметили, что в группах детей, получавших препарат УДХК, показатели АЛТ снижаются параллельно уровню апоптоза ЛПК (рис. 9). Такой результат демонстрирует моделирующий эффект препарата УДХК на процессы цитолиза и апоптоза в ходе инфекционного процесса.
По нашим исследованиям, четко представлен антиапоптотический эффект препарата УДХК при неблагоприятном затяжном течении вирусного гепатита А. В период поздней реконвалесценции (41-60-й день болезни) уровень апоптоза на фоне приема препарата УДХК приближается к норме в отличие от значений апоптоза ЛПК у детей группы сравнения, что с очевидностью указывает на способность препарата влиять на процесс апоптоза ЛПК (рис. 10).
Ш базис -терапия В курс препарата УДХК □ норма
поздняя
реконвалесценция
Рис. 10. Влияние препарата УДХК на апоптоз ЛПК при затяжном течении гепатита А
Особенно важна и столь же значима роль препарата УДХК в качестве антиапоптоти-ческого средства при хронических гепатитах В и С у детей. Влияние препарата УДХК здесь представлено явно и достоверно статистически (рис. 11). Как видно из представленных данных, при ХГ В у детей, получавших препарат УДХК, уровень апоптоза ЛПК в три раза ниже, чем в группе пациентов, находившихся на базис-терапии. Аналогичная ситуация при ХГ С: прием препарата УДХК обеспечивает снижение показателей апоптоза ЛПК в 2,5 раза. В обоих случаях разница высоко достоверна.
Специальное изучение влияния длительности курса терапии препаратом УДХК показало преимущество шестимесячного курса лечения над более коротким. На примере ХГ В видим, что у детей в группе базис-терапии апоптоз сохранялся на уровне 12,7 ± 2,3%, в группе получавших препарат УДХК в течение трех месяцев этот показатель снижался до 4,9 ± 1,3%, а в результате шестимесячного лечения препаратом УДХК — до 3,6 ± 1,5%, то есть особенно благоприятное влияние на апоптоз ЛПК и течение гепатита оказывает препарат УДХК при длительном, не менее шести месяцев, лечении (рис. 12).
%Г] 2,6
12 I
10
8
6 p<0,05
4 1,97
2 °>77
i_ X m в
НХГ с
Рис. 11. Влияние препарата УДХК на апоптоз ЛПК при ХГ В и С
Рис. 12. Антиапоптотический эффект препарата УДХК в зависимости от длительности лечения
лауреаты премий
winners of scientific competitions
о
ВЫВОДЫ
СЧ
У
1. Апоптоз лимфоцитов периферической крови у здоровых детей 3-15 лет существенно ниже, чем у взрослых, что сопряжено с биологическими особенностями растущего организма.
2. Повышение апоптоза лимфоцитов периферической крови — важное звено патогенеза вирусных гепатитов и информативный показатель состояния иммунокомпетентных клеток крови.
3. Частота повышения апоптоза лимфоцитов периферической крови при вирусных гепатитах высока (80,0-95,8%), а уровень повышения находится в прямой корреляции со степенью холестаза, цитолиза и вирусной репликации.
4. При вирусных гепатитах у детей независимо от их этиологии апоптоз лимфоцитов периферической крови значимо коррелирует с фазой и течением инфекции и имеет прогностическое значение:
• при остром циклическом течении апоптоз резко повышается в период разгара и существенно снижается в фазе реконвалесценции;
• затяжное течение отличает менее выраженный подъем в острый период и отсутствие тенденции к снижению в течение 3-6 месяцев;
• при хроническом течении апоптоз иммуно-компетентных клеток крови остается постоянно повышенным.
5. Урсодеоксихолевая кислота обладает выраженным антиапоптотическим действием, что является патогенетическим обоснованием ее применения при вирусных гепатитах у детей.
6. Как элемент патогенетической терапии урсодеоксихолевая кислота улучшает течение и исходы острых и хронических вирусных гепатитов у детей.
ЛИТЕРАТУРА
1. Белушкина, Н. Н. Молекулярные основы апоптоза/Н. Н. Белуш-кина, Али Хасан Хамад, С. Е. Северин//Вопросы биол. мед. и фарм. химии. — 1998. — № 4. — С. 15-23.
2. Дмитриева, Е. В. Роль апоптоза в патогенезе заболеваний печени различной этиологии: дис.... канд. биол. наук/Е. В. Дмитриева. — М., 2003.
3. Котович, М.М. Роль этиотропной и патогенетической терапии в клинической и морфологической эволюции хронических гепатитов у детей: автореф. дис.. докт. мед. наук/М. М. Кото-вич. — М., 2003.
4. Рейзис, А. Р. Терапия и профилактика хронических гепатитов В и С у детей и подростков/А. Р. Рейзис//Современные проблемы профилактической педиатрии: диагностика, лечение
и профилактика хронических вирусных гепатитов В, С и Д
у детей. — М., 2003. — С. 6- 8.
5. Castro, R. E. UDCA modulates cell cycle proteins that control apoptosis of primary rat hepatocytes/R. E. Castro, J. D. Amaral, B. T. Kren et al.//J. Hepatology. — 2005. — Vol. 42, Suppl. 2. — P. 104.
6. Gricciardi, M. E. Apoptosis: a mechanism of acute and chronic liver injury/ M. E. Gricciardi, G.J. Gores // Gut. — 2005. — Vol. 54, № 7. — Р. 1024-1033.
7. Rodrigues, C. M. P. A novel role for UDCA in inhibiting apoptosis by modulating mitochondrial membrane perturbation/C. M. P. Rodrigues, G. S. Fan, X. M. Ma et al.//J. Clinical Investigation. — 1998. — Vol. 101, № 12. — Р. 2790-2799.
