CC BY
99
рости кровотока в микроциркуляторном русле по времени корреляции. На рис. 3 приведена блок-схема программы.
Для определения измерительных возможностей разрабатываемого датчика был выполнен ряд натурных экспериментов на волонтерах. В частности, были зафиксированы сигналы до и после физической нагрузки (рис. 4).
Из приведенных зависимостей, соответствующих разным условиям регистрации сигналов, видно, что АКФ явно отражает изменение состояния обследуемого. В данном случае изменение времени корреляции обусловлено тем, что при физической нагрузке сосуды расширяются и скорость крови в них уменьшается, соответственно время корреляции увеличивается. Таким образом подтверждена работоспособность модели датчика скорости микроциркуляторного кровотока.
Итак, в ходе работы создана лабораторная модель неинвазивного спекл-датчика капиллярного кровотока, сопряженная с персональ-
ным компьютером по каналу Bluetooth, и программа обработки информационного сигнала, позволяющая рассчитывать скорость капиллярного кровотока в автоматическом режиме. Предложенная модель датчика позволяет вести непрерывный мониторинг параметров микроциркуляторного кровотока и осуществлять дистанционную передачу данных, что позволит в дальнейшем использовать датчик как в качестве самостоятельного прибора, так и в диагностическом комплексе для контроля за пациентами с хроническими заболеваниями.
Авторы выражают благодарность Заслуженному деятелю науки РФ, доктору технических наук, профессору С.Б. Макарову (зав. кафедрой радиоэлектронных средств защиты информации СПбГПУ) и кандидату технических наук, доценту С.В. Волвенко (сотрудник той же кафедры) за предоставление электронного модуля с каналом Bluetooth.
Работа поддержана Федеральной целевой программой «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» ГК №16.512.11.2115.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Eiju, T. Microscopic laser Doppler velosimeter for blood velocity measurements [Text] / T. Eiju, M. Nagai, K. Matsuda, [et al.] // Optical Engineering. — 1993. — Vol. 32. - P. 15-20.
2. Aizu, Y. Coherent optical techniques for diagnostics of retinal blood flow [Text] / Y. Aizu, T. Asakura // Journal ofBiomedical Optics. - 1999. - Vol. 4. — № 1. - P. 61-75.
3. Galanzha, E.I. Speckle and Doppler methods of blood and lymph flow monitoring [Text]: In: Handbook of optical biomedical diagnostics / E.I. Galanzha, G.E. Brill, Y. Aizu, [et al.] - Bellingham: SPIE Press, 2002. - P. 875937.
4. Asacura, T. Dynamic laser speckles and their application to velocity measurements of diffuse object [Text] / T. Asacura, N. Takai // Applied Physics. — 1981. -Vol. 25. - P. 179-194.
5. Мокрова, Д.В. Бесконтактная диагностика физических параметров биологических объектов на основе оптических спекл-полей и дифрактометрии [Текст]: дис. ... канд. физ.-мат. наук: 01.04.21: защищена 09.12.10: утв. 08.04.2011 / Мокрова Дарья Всеволодовна. — СПб., 2010. — 150 с. Библиогр.: с. 53-71.
6. Ульянов, С.С. Что такое спеклы [Текст] / С.С. Ульянов // Соровский образовательный журнал. -1999. - № 5. - С. 112 - 116.
УДК 577.322; 541.64:537.3
В.М. Капралова, Е.А. Назарова, Н.Е. Иванова, Е.Б. Шадрин
ИНФОРМАЦИОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ АЛЬБУМИНА КАК ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ ПАРАМЕТР
В последнее десятилетие показано, что при многих серьезных нейродегенеративных заболеваниях имеются изменения конформации
белковых молекул и, как следствие, нарушение биологической функции определенных белков. Эти заболевания принято также называть кон-
формационными [1]. К ним относятся, например, хорея Хантингтона, болезни Альцгеймера и Паркинсона. Способность белков центральной нервной системы выполнять их специфические биологические функции утрачивается, в частности, при образовании вместо белковых глобул нерастворимых амилоидных фибрилл, склонных к агрегации [2]. На сегодняшний день подобные нейродегенеративные заболевания неизлечимы, однако признана необходимость их ранней диагностики. Поэтому представляется актуальным расширение круга физических методов, с помощью которых можно наблюдать конформационные изменения белковых молекул.
Одним из новых в медицинской диагностике является метод термоимпедансметрии спинномозговой жидкости, или ликвора, человека. Ликвор — сложная биологическая жидкость, содержащая различные белки, эритроциты, клеточные структуры, взвешенные в физиологическом растворе. По составу и свойствам ликвора возможна оценка состояния больных и прогнозирование исходов при различных заболеваниях центральной нервной системы (ишемический и геморрагический инсульты,
менингит, опухоли и др.) и черепно-мозговых травмах. В ФТИ им. А.Ф. Иоффе РАН была разработана и изготовлена установка для измерения электрического импеданса биологических жидкостей в зависимости от температуры (рис. 1) [3]. С ее помощью были получены кривые термоимпеданса для проб ликвора большого числа пациентов, предоставленных клиникой Института нейрохирургии им. проф. А.Л. Поленова (Минсоцразвития России). Набранный объем данных позволяет выделить характерные особенности кривых температурного хода импеданса ликвора, присущие определенным, установленным другими диагностическими методами, заболеваниям. Опытный врач-невролог, таким образом, может уже по виду кривой судить о заболевании и, что немаловажно, оценивать состояние больного и определять тактику лечения и показания для хирургического вмешательства, а также прогнозировать исход заболевания. Такого рода диагностика уже проводится в Институте нейрохирургии им. А.Л. Поленова [4, 5]. Кроме того, выяснилось, что диагностические параметры метода термоимпедансметрии связаны с содержанием и состоянием белков в ликворе.
Рис. 1. Блок-схема установки для измерения электрического импеданса кюветы (1) с жидкостью:
2 — генератор переменного тока; 3 — фазометр; 4 — двухкоординатный самописец; 5 — нагреватель; 6 — блок питания нагревателя; 7 — измеритель температуры; 8 — эталонное сопротивление
Это позволяет расширить диагностические возможности метода и, возможно, внести вклад в изучение и диагностику конформационных заболеваний.
Напомним, что электрический импеданс представляет собой усредненную характеристику отклика образца на воздействие переменного электрического напряжения, причем для кюветы с жидкостью основной составляющей импеданса является емкостное сопротивление. Изменение емкости с температурой весьма мало, и именно поэтому применяется фазометрический метод, заключающийся в измерении разности фаз напряжения на кювете и внешнего напряжения, прилагаемого к измерительной ячейке.
Зависимость электрического импеданса спинномозговой жидкости от температуры (рис. 2) практически всегда имеет немонотонный характер, причем на большинстве кривых имеется так называемый клюв, или лямбдо-образный минимум, свидетельствующий о фазовом переходе в структурных элементах ликво-ра, происходящем при температуре минимума кривой. Основными параметрами экспериментальных кривых являются температура фазового перехода ГфП и выраженность минимума. Под выраженностью участка кривой здесь по-
нимается отношение интервала Ду разности фаз, соответствующее этому участку, к полному интервалу АН изменения разности фаз для всей кривой.
Ранее для выяснения природы наблюдаемого лямбдообразного минимума и соотнесения его с определенными структурными элементами лик-вора проводилась интерпретация части экспериментальных кривых в терминах теории фазовых переходов [6], то есть определение критических индексов перехода и температуры равновесия фаз. Полученные значения критических индексов подтвердили, что в изучаемой системе действительно происходит фазовый переход. Для понимания роли определенных структурных элементов ликвора в фазовых переходах нами были определены коэффициенты корреляции между параметрами термоимпедансметрических кривых и биохимическими показателями ликво-ра, а также состоянием больных по специальным медицинским оценочным шкалам. В частности обнаружено, что наибольшие коэффициенты корреляции наблюдаются при недоброкачественных опухолях между параметром «выраженность» и содержанием белка в ликворе (0,77), а также между цитозом (содержанием клеточных структур) и температурой фазового перехода Тфп (0,39). Существование уверенных корреляций
40
Температура
Рис. 2. Пример термоимпедансметрической кривой ликвора пациента с черепно-мозговой травмой средней степени тяжести. Показаны основные параметры экспериментальных кривых
между параметрами наблюдаемого на термо-импедансметрической кривой фазового перехода и содержанием белка в ликворе для всех исследованных заболеваний и черепно-мозговых травм позволило связать этот переход с фазовым переходом глобула — клубок в белках ликвора.
В белковых молекулах существует иерархия структур и энергий связей, стабилизирующих эти структуры. Соответственно, при увеличении температуры происходит последовательное разрушение связей, приводящее в конечном итоге к денатурации белка и затем к фазовому переходу глобула —клубок [7]. Белки в нативном состоянии имеют строго определенную, заданную их первичной структурой конформацию, только находясь в которой, белки выполняют свои биологические функции. Поэтому важна возможность наблюдения конформационного состояния белковых молекул. В этом отношении метод термоимпедансметрии представляется перспективным, поскольку несомненно имеет место влияние конформации белков и ее изменений на форму термоимпедансметриче-ских кривых. Это влияние было подтверждено модельными экспериментами с глобулярными белками.
Так как белки в ликвор попадают в основном путем фильтрации из плазмы крови, то в ликворе предпочтительно накапливаются сред-немолекулярные белки, находящиеся в плазме в относительно большом количестве, — это альбумин, преальбумин и трансферрин. Специфические для центральной нервной системы белки (основной белок миелина, кислый гли-альный фибриллярный белок и ¿-белок) в нор-
?фп, °С.
60 А
50
40-
• • •• «г
ме составляют только 1—2 % от концентрации общего белка в ликворе. Поэтому в качестве модельных объектов для предварительного исследования конформационных превращений в белках были выбраны доступные глобулярные белки интерферон и церебролизин, аналогичные белкам ликвора. Форма и параметры тер-моимпедансметрических кривых интерферона и церебролизина, а также концентрационные зависимости параметров кривых подтвердили, что наблюдаемый фазовый переход происходит именно в белках ликвора.
В связи с этим задачей настоящей работы было проведение термоимпедансметрических экспериментов с альбумином — белком ликвора с целью наблюдения проявлений конформаци-онных состояний белка на термоимпедансме-трических кривых.
Объектом исследования был человеческий сывороточный альбумин, который является одним из основных белков в составе спинномозговой жидкости (в норме составляет около 70 % от общего содержания белков ликвора). Выбор альбумина в качестве модельного белка обусловлен также его важной ролью в плазме крови. Данный белок, во-первых, обеспечивает осмотическое давление крови, от которого в значительной степени зависит обмен воды и растворенных в ней веществ между кровью и тканевой жидкостью; во-вторых, регулирует вместе с другими белками плазмы водородный показатель рН крови благодаря наличию буферных свойств; в-третьих, влияет на вязкость крови; в-четвертых, служит переносчиком гормонов, липидов, минеральных веществ и лекарственных препаратов.
ю
70
80
20 30 40 50 60 Концентрация, мг/мл
Рис. 3. Зависимость температуры фазового перехода в структурных элементах ликвора от концентрации раствора альбумина
Образцы для экспериментов получали последовательным разбавлением исходного препарата человеческого сывороточного альбумина дистиллированной водой. Препарат альбумина представлял собой 10 %-й раствор человеческого сывороточного альбумина с молекулярной массой 69 кДа в дистиллированной воде, в который были добавлены каприлово-кислый натрий (3 г/л) и хлористый натрий (100 ммоль/л). Получены концентрационные ряды термоимпедансметрических кривых.
С изменением концентрации растворов от большей к меньшей изменяется форма термо-импедансметрической кривой. При некотором значении концентрации характерный для фазового перехода участок на кривых практически пропадает. Были получены зависимости температуры фазового перехода (рис. 3) и его выраженности от концентрации раствора, которые обсуждались в рамках представлений о концентрационных состояниях полимерного, в том числе белкового, раствора. С учетом плохой воспроизводимости результатов (характерной для биологических систем) температура наблюдаемого фазового перехода заключена в промежутке 40—55 оС и практически не зависит от концентрации раствора. Это подтверждает, что с помощью термоимпедансметрического метода наблюдается именно фазовый переход
отдельных глобул в клубки, а не процессы разрушения агрегатов альбуминовых глобул в растворе.
С целью поиска проявлений различных конформационных состояний альбумина на термоимпедансметрических кривых проводились эксперименты с денатурированным белком. В качестве денатурантов использовались 8М раствор мочевины и растворы ортофосфор-ной и лимонной кислот. На рис. 4, а приведены термоимпедансметрические кривые растворов альбумина при различных значениях рН раствора.
Наблюдаемые при изменении рН раствора изменения формы термоимпедансметрических кривых можно связать с изменениями конфор-мации молекул альбумина. Известно [8], что в зависимости от pH молекула альбумина может находиться в одной из пяти изомерных форм, причем переходы между ними полностью обратимы. Форма молекулы альбумина в нейтральной среде (наиболее известная, «сердцеобразная») называется нормальной, или #-формой (рис. 4, б). При понижении pH до 4,3 (с ростом кислотности среды) альбумин переходит в ^-конформацию (от англ. Faster migrating). При pH ниже 2,7 белок находится в развернутой ^-конформации (от англ. Expanded), что и отражается на форме термоимпедансметрических
б)
А $
4f J
Л
л
■ %s
Рис. 4. Термоимпедансметрические кривые раствора альбумина при различных значениях рН (а) и кон-формации изомерных форм альбумина [8] (б), которые связаны со значениями рН; а — значения рН: 2,0 (1), 2,2 (2),2,3 (3), 2,5 (4), 6,7 (5), 8,6 (6); б — конформации молекулы альбумина(сверху вниз):
^-форма, /-форма и /-форма
зависимостей (кривые 1 — 4 на рис. 4,а): происходит изменение выраженности минимума или полное исчезновение минимума на кривой.
Воздействие кислоты на альбумин в целом подобно термическому воздействию, но характеризуется значительно большей избирательностью по отношению к связям, стабилизирующим пространственную структуру белка. Естественно, что когда тепловому воздействию подвергается альбумин в одной из уже модифицированных форм (F- или £-форм), для термоинициированных процессов остается значительно меньше возможностей. Поэтому и на термоимпедансметрических кривых эти процессы проявляются в значительно меньшей степени.
При увеличении рН до 8,6 незначительно изменяется форма допереходного участка кривой (см. рис. 4, а), а выраженность минимума приблизительно такая же, как и для кривой, полученной для раствора с pH = 6,7. В интервале значений pH от 8 до 10 альбумин существует в так называемой 5-форме (от англ. Basic). Эта изомерная форма близка к Ж-форме по геометрическим параметрам и компактности, но отличается характером междоменных связей. Поэтому форма термоимпедансметрической кривой для слабощелочного раствора альбумина подобна таковой для нейтрального раствора.
Известно, что раствор альбумина представляет собой сложную систему, содержащую как отдельные глобулы, так и их ассоциаты. Для
таких систем при изменении их состояния большое значение имеет фактор времени. Многие биологические системы приходят в равновесное состояние в течение многих часов и даже суток, поэтому в практике биофизических исследований обычным является приготовление и перемешивание термостатированных растворов в течение, например, суток. В связи с этим было изучено влияние времени на процессы, проходящие в растворах альбумина с лимонной кислотой.
С интервалом времени в десять дней была проведена запись термоимпедансметрических кривых растворов альбумина с различным содержанием лимонной кислоты (рН 3,0 и 2,2). Концентрация альбумина в растворах была одинакова и равна 7 мг/мл. На рис. 5 видно, что как для раствора с рН = 3,0, так и для раствора с рН = 2,2 явно выраженный клювообразный участок и минимум в области 42 0С по прошествии 10 суток исчезли. Это может свидетельствовать о том, что с течением времени при воздействии денатурирующих факторов, в нашем случае лимонной кислоты, молекула альбумина полностью денатурирует и переходит из состояния глобулы в малоупорядоченное развернутое состояние, для которого фазовый переход уже не наблюдается.
Сведения о конформации и косвенно о концентрации белков, полученные методом термо-импедансметрии, могут быть весьма ценными для медицинской диагностики по свойствам
а)
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
(н
а «
=s
3 «
о эт св
0,30
0.26
0.22
0.18
О 0.14
Температура, °С
0.Ю 1—|—i—|—i—|—i—|—i—|—i—|—i—|—i—|—i—|—i—г
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
Температура, °С
Рис. 5. Влияние времени выдерживания растворов альбумина на вид термоимпедансметрических кривых растворов с различным содержанием лимонной кислоты: рН = 3,0 (а) и 2,2 (б); 1, 2 — кривые, снятые сразу после приготовления растворов и через 10 дней, соответственно
биологических жидкостей, содержащих белки. Важно использовать эти сведения вместе с данными о биохимическом составе биологических жидкостей, а также с оценками состояния больных по специальным медицинским шкалам. Так например, при наблюдении термоимпедансметрической кривой без выраженного минимума можно предположить или крайне незначительное содержание белков в исследуемой жидкости, или что белки в ней имеются, но в денатурированном состоянии. При наличии хорошо выраженного минимума можно воздействовать на изучаемую жидкость денатурантами с различными рН, чтобы понять, в каком конформационном состоянии находятся белки этой жидкости. Возможно также использовать данные о кинетике денатурации. В сочетании с данными о содержании белка в биологической жидкости — крови или лик-воре, полученными другими аналитическими методами, можно сделать важные выводы о состоянии белков в биологической жидкости и, возможно, о состоянии организма в целом. Для более точных заключений необходима статистика по большому количеству больных и здоровых людей, что само по себе представляет сложную исследовательскую задачу.
После исследования растворов альбумина с различными значениями концентрации и рН термоимпедансметрическим методом представляется целесообразным проверить, будут ли наблюдаться какие-либо закономерности при исследовании таких же растворов методом спектроскопии.
Спектр УФ поглощения альбумина характеризуется двумя полосами. Первая — интенсивная полоса в области 200 — 220 нм — обусловлена наличием большого числа амидных групп в составе пептидных связей (— СОКН —). Вторая — менее интенсивная полоса в районе 280 нм — обусловлена наличием в структуре белка таких сильных хромофоров, как аминокислотные остатки триптофана и тирозина. Поскольку на полосе 280 нм поглощение этих хромофоров практически ничем не маскируется, она считается наиболее чувствительной к изменениям конформации альбумина [9].
Были сняты спектры пропускания растворов альбумина с различным содержанием белка: концентрация менялась от 33 до 0,03 мг/мл путем последовательного разбавления растворов (рис. 6). Вплоть до концентрации 8 мг/мл в УФ области спектров пропускание отсутствует и появляется только в области 300 нм. Особен-
200 250 300 350 400 X, нм
Рис. 6. Спектры пропускания воды (1) и водных растворов альбумина различной
концентрации, мг/мл: 0,03 (2), 0,08 (3), 0,2 (4), 0,5 (5), 1,4 (6), 4,0 (7), 8,2 (8), 16,5 (9), 33,0 (10)
ности, связанные с поглощением аминокислотных остатков тирозина и триптофана в области 280 нм, проявляются, начиная с концентрации 4 мг/мл, и меняются с понижением концентрации — пик поглощения постепенно исчезает.
По данным спектров пропускания было показано, что оптическая плотность в максимуме поглощения при 280 нм имеет линейную зависимость от концентрации раствора. Это говорит о том, что в данных растворах альбумина при концентрации ниже 4,0 мг/мл выполняется закон Ламберта—Бугера — Бера, то есть образования каких-либо агрегатов молекул, способного повлиять на поглощение, в этой области концентраций не происходит. При более высоких концентрациях альбумина чувствительность использованного спектрофотометра СФ-56 до 2 ед. оптической плотности не позволяет наблюдать поглощение.
Представляет интерес изучение спектров пропускания растворов альбумина с различными рН, а также температурных зависимостей этих спектров с целью выявления процессов денатурации. Существует ряд исследований, демонстрирующих проявления процессов образования расплавленной глобулы и полной денатурации белковых молекул в спектрах пропускания, а также возможности изучения конформации альбумина различными спектроскопическими методами [9 — 11].
Кроме того, необходимо изучение теми же методами изменений конформации не только глобулярных белков, каким является альбу-
мин, но и фибриллярных: кератина, миозина, фибрина, коллагена. Возможно, это позволит различать большее количество конформаци-онных состояний белков и повысит ценность метода термоимпедансметрии для диагностики конформационных заболеваний. Такие исследования планируются в дальнейшем.
Итак, в работе получены данные, подтверждающие, что за наблюдаемый термоимпеданс-метрическим методом фазовый переход в лик-воре ответственны белки, входящие в его состав. По виду термоимпедансметрической кривой, наличию на ней области фазового перехода и параметрам этого перехода можно косвенно судить о концентрации белка. Кроме того, по форме и параметрам кривой можно делать выводы о структуре и устойчивости белковых глобул, то есть об их конформации и ее изменении при повышении температуры. Показано, что с помощью метода термоимпедансметрии возможно наблюдение фазового перехода в отдельных глобулах альбумина, а также кинетики конформационных изменений при денатурации альбумина под действием кислоты. Спектроскопическим методом продемонстрировано, что при концентрации раствора альбумина менее 4,0 мг/мл не происходит агрегации его молекул.
Таким образом, показана возможность расширить область применения термоимпеданс-метрического метода диагностики и на болезни центральной нервной системы, вызываемые изменениями конформации белков.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Иллариошкин, С.Н. Конформационные болезни мозга [Текст]/ С.Н. Иллариошкин. — М.: Янус-К, 2003. - 248 с.
2. Сулацкая, А.И. Особенности взаимодействия флуоресцентного красителя тиофлавина Т с амилоидными фибриллами [Текст]/ А.И. Сулацкая // Научно-технические ведомости СПбГПУ. Физико-математические науки. — 2011. — № 3 (129). — С. 123—127.
3. Пат. 2205392 Российская Федерация, МПК7 7G 01 N 27/02, A 61 B 5/05. Устройство для определения электрических параметров жидкой среды [Текст] / Ильинский А.В., Иванова Н.Е., Шадрин Е.Б., Ют-кина Н.Л.; заявитель и патентообладатель Физико-технический институт им. А.Ф. Иоффе РАН. — № 2002103476/28(003348); заявл. 04.02.2002.
4. Пат. 2257579 Российская Федерация, МПК7 G
01 N 33/487, G 01 N 27/06. Способ прогнозирования исхода ишемического повреждения головного мозга [Текст] / Юткина Н.Л., Иванова Н.Е., Панунцер В.С., Касумов Р.Г., Шадрин Е.Б., Шадрин А.Е.; заявитель и патентообладатель Российский научно-исследовательский нейрохирургический институт им. проф. А.Л. Поленова. — № 2003130396/15; заявл. 14.10.2003; опубл. 27.07.2005.
5. Иванова, Н.Е. Термоимпедансметрия спинномозговой жидкости человека как метод медицинской диагностики [Текст] / Н.Е. Иванова, В.М. Капралова, Е.Б. Шадрин [и др.] // Труды СПбГПУ. Научные исследования на РФФ. — СПб., 2006. — № 500. — С. 217 — 222.
6. Шадрин, Е.Б. Основы физики фазовых переходов [Текст]: Учеб. пос. / Е.Б. Шадрин. — СПб.: Изд-во СПбГТУ, 2001. — 107 с.
7. Гросберг, А.Ю. Статистическая физика макро-
молекул [Текст] / А.Ю. Гросберг, А.Р. Хохлов. — М.: Наука, 1989. - 342 с.
8. Peters, T.J. All about Albumin: Biochemistry, genetics and medical applications [Text] / T.J. Peters. — San Diego, CA: Academic Press, 1996. — 432 p.
9. Капралова, А.В. Влияние терагерцового излучения различных диапазонов на конформа-цию молекул бычьего сывороточного альбумина [Текст] / А.В. Капралова, А.С. Погодин //Вестник НГУ. Серия: Физика. — 2010. — Т. 5.—Вып. 4. -С. 182 — 185.
10. Григорян, К.Р. Влияние диметилсульфоксида и диэтилсульфоксида на термическую денатурацию человеческого сывороточного альбумина [Текст] / К.Р. Григорян, Ш.А. Маркарян, М.Г. Азнаурян // Теоретическая и экспериментальная криобиология. Проблемы криобиологии. — 2009. — Т. 19. — № 1. — С. 3—9.
11. Дмитриев, А.В. Тепловая денатурация бычьего сывороточного альбумина в спектрах мандельштам-бриллюэновского рассеяния света. [Электронный ресурс] / А.В. Дмитриев, А.И. Федосеев, А.В. Сванидзе. — URL: http://physica.spb.ru/contents/2011thesises/biofizika/
