CC BY
62
кондуит на основе поли(з-капролактона)
заполненный фибриновым гидрогелем с мезенхимальными стромальными клетками для замещения дефекта периферического нерва
Я.О. Мухамедшина 1,Р.Ф. Масгутов12,Г.А. Масгутова1,М.Н. Журавлева 1, А.А. Шульман 2, Л.Р. Галиева 1, А.А. Рогожин12, Ю.А. Челышев14, А.А. Ризванов1
1 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
2 Республиканская клиническая больница, Казань, Россия
3 Казанская государственная медицинская академия, Казань, Россия
4 Казанский государственный медицинский университет, Казань, Россия
Conduit based on poly(s-caprolactone) filled with fibrin-based hydrogel with mesenchymal stromal cells for peripheral nerve defect reconstitution
Y.O. Mukhamedshina 1, R.F. Masgutov12, G.A. Masgutova 1, M.N. Zuravleva 1, A.P.Shulman 2, L.R. Galieva 1, A.F. Rogozin 13, YA. Chelyshev14, A.A. Rizvanov1
1 ^zan (Volga region) Federal University, Kazan, Russia
2 Republic Clinical Hospital, Kazan, Russia
3 Kazan State Medical Academy, Kazan, Russia
4 Kazan State Medical University, Kazan, Russia
В работе предложена терапевтическая стратегия для стимулирования регенерации периферического нерва, которая заключается в комбинации мультипотентных мезен-химальных стромальных клеток (ММСК) и имплантации кондуита нерва из поли(е-капролактона), заполненного фибриновым гелем Tissucol . Исследования in vitro показали, что покрытие подложки из поли(е-капролактона) фибриновым гидрогелем способствует повышению проли-феративной активности клеток . Полученные результаты in vivo по замещению дефекта периферического нерва крыс с помощью кондуита на основе поли(е-капролактона) заполненного фибриновым гелем с ММСК подтверждают эффективность предложенного метода .
Ключевые слова: тубуляция, поли(е-капролактон), мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, фибриновый клей
Введение
Периферическая нервная система обладает хорошим посттравматическим регенераторным потенциалом, однако проблема высокой степени ин-валидизации больных до сих пор не решена [1, 2]. В значительной степени это связано с нерешенностью задачи преодоления протяженных диастазов нерва. С этой целью активно разрабатывают кондуиты нерва из биосовместимых материалов, которые предназначены для направления и поддержания регенерации нервных волокон Среди тубулиро-ванных тканеинженерных конструкций кондуит из поли(е-капролактона) (PCL) обладает оптимальными механическими свойствами и способностью к биодеградации [3, 4]. Установлено, что данный тип биополимера способствует адгезии не только шваннов-ских клеток, но и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) [5—7].
Представляется перспективной для стимулирования регенерации периферического нерва терапевтическая стратегия, которая заключается в комбинации ММСК и имплантации кондуита нерва [7, 8]. В качестве внеклеточного матрикса для регенерирующих нервных волокон был предложен фибриновый гидрогель Tissucol (Baxter, Австрия). Фибриновый клей Tissucol широко используется в биомедицинских исследованиях как природный высокомолеку-
e-mail: yana . k-z-n@mail . ru
In this study we used promising therapeutic strategy for stimulation of peripheral nerve regeneration — implantation of poly(s-caprolactone) nerve conduit filled with fibrin hydrogel Tissucol in combination with mesenchymal stem cells . In vitro studies showed that the coating by Tissucol of poly(s-caprolactone) substrate promotes cell proliferation . In vivo results of peripheral nerve defect reconstitution in rats using the conduit based on poly (s-caprolactone) filled with fibrin hydrogel with mesenchymal stem cells confirmed the effectiveness of the proposed approach
Keywords: tubulation, poly(s-caprolactone), multipotent mesenchymal stromal cells, fibrin glue .
лярный материал с превосходной биосовместимостью и биодеградацией [9, 10]. Применение ММСК из жировой ткани в данной связи представляется оптимальным, особенно с точки зрения доступности, простоты и относительной безопасности получения аутогенного клеточного материала [11]. Известно, что ММСК секретируют различные нейротрофиче-ские факторы и цитокины [12], обладают иммуно-модуляторным эффектом и хорошим миграционным потенциалом [13]. При введении ММСК в кровь, они способны к миграции в область повреждения и интеграции в ткань . Указанные выше свойства ММСК, а также их онкогенная безопасность, отсутствие этических противоречий, позволяют рассматривать эти клетки как оптимальный материал для аутотран-сплантаций не только при нейротравмах, но и при различных нейродегенеративных заболеваниях
На модели травмы лицевого нерва показано, что применение биодеградируемого материала в комбинации с нейральными стволовыми клетками, генетически модифицированными для экспрессии глиального нейротрофического фактора Юй^), повышает регенерацию поврежденного нерва [14]. В случае передавливания седалищного нерва крысы введение в область повреждения ММСК человека, модифицированных при помощи аденовирусных векторов с геном GDNF, стимулирует восстановление
двигательной функции, регенерацию аксонов и снижение апоптоза шванновских клеток [15]. Недавно обнаружено, что комбинация ММСК и PCL кондуита стимулирует посттравматическую регенерацию срединного нерва мыши, однако результаты по функциональной состоятельности нерва не были представлены [16]. Учитывая позитивное влияние ММСК и фибринового клея на разные мишени и молекулярные механизмы стимулирования регенерации, представляется достаточно вероятным, что их комбинация с PcL кондуитом будет способствовать эффективному преодолению протяженных диастазов нерва
Материал и методы
Эксперименты проведены на 20 крысах-самцах породы Wistar, массой 200—250 г . Все процедуры с животными проводили в соответствии с требованиями приказа Министерства здравоохранения Российской Федерации от 23 августа 2010 г . № 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики» . Животных содержали в стандартных условиях со свободным доступом к воде и корму Крыс наркотизировали путем внутрибрюшинной инъекции хлоралгидрата (Sigma, США) (80 мг/мл, 0,4 мл на 100 г веса животного) . В левом седалищном нерве на уровне середины бедра формировали диастаз длиной 5 мм, который преодолевали при помощи ту-буляции полимерной трубкой из PCL длинной 7 мм . Получение тубулированного кондуита было описано нами ранее [3]. На каждый конец кондуита накладывали по два шва Прооперированных животных разделили на три группы Крысам первой группы (n = 6) сформированный кондуит заполняли 0,9% NaCl (PCL). Во второй группе животных (n = 6) диастаз преодолевали при помощи кондуита нерва, заполненного гидрогелем на основе фибрина Tissucol (Baxter, Австрия) (PCL + Tissucol). В третьей группе (n = 8) сформированный кондуит заполняли смесью Tissucol с ММСК, трансдуцированными реком-бинантным лентивирусом, несущим ген усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP) (30 тыс . клеток в 7 мкл) (PCL + Tissucol + MSC-LV-EGFP) .
Получение ММСК из жировой ткани и рекомби-нантного лентивируса с клонированным геном EGFP c последующей трансдукцией клеток было описано нами ранее [17, 18]. Забор материала осуществляли через 14 сут . (PCL + Tissucol + MSC-LV-EGFP), 30 и 60 сут (все экспериментальные группы) после операции по методике, описанной ранее [19]. Продольные срезы сформированного кондуита толА Б
щиной 6 мкм, полученные на микротом-криостате НМ560 Cryo-Star (Carl Zeiss, Германия), окрашивали азур-эозином по стандартной методике
Для исследований in vitro использовали PCL трубки диаметром и высотой 2 мм, которые укладывали вертикально в ячейки 24 луночного планшета, после чего полость трубок заполняли суспензией ММСК в Tissucol (1 млн клеток в 7 мкл матрик-са) PCL трубки, заполненные матриксом с ММСК префабрицировали в CO2 инкубаторе при 37°С в течение 30 мин , после чего в лунки планшета добавляли 200 мкл среды а-МЕМ (ПанЭко, Россия) . Клетки культивировали в течение 48 часов, после чего трубки аккуратно снимали с культурального пластика, заливали средой для заморозки тканей NEG 50 (ThermoScientific, США) . Иммунофлуоресцентное окрашивание проводили на криостатных срезах толщиной 6 мкм с первичными антителами против каспаз (Caspase-3, sc-98785; Caspase-7, sc-6138; Caspase-10, sc-393983, SantaCruz, США) согласно протоколу фирмы-производителя
Для проведения MTS-теста в ячейки 96-луноч-ного планшета, покрытые PCL сеяли МСК по 5000 тыс . клеток на лунку . Культуральный планшет инкубировали в течение 48 ч . при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2 . Количество жизнеспособных клеток оценивали колометрически с помощью реагента CellTiter 96® AQueous MTS Reagent Powder (Promega) на планшетном анализаторе Infinite M200 Pro (Tecan, США) при длине волны 490 нм
На 30 и 60 сут после операции для оценки проводимой способности нервных волокон использовали метод стимуляционной электронейромиографии . С помощью игольчатых электродов регистрировали суммарный потенциал икроножной мышцы (порог возникновения, амплитуду, латентный период, длительность моторного и рефлекторного ответов) у крыс экспериментальных групп и интактных животных .
Статистическую обработку результатов тестирования проводили с использованием пакета программ Origin7 Pro Статистическую достоверность разницы определяли с помощью t-критерия Стьюдента . Во всех статистических данных уровень достоверности был принят меньше 0,05 (p<0,05) .
Результаты
При исследовании срезов PCL трубок, в которых культивировали ММСК в фибриновом клее, используемом в качестве матрикса, наблюдали адгезию клеток к внутренней поверхности трубок (рис. 1А) .
Рис. 1.
ММСК на внутренней поверхности PCL трубок in vitro:
А — микрофотография; Б — пролиферативная активность ММСК на различных матриксах (по результатам MTS-теста),
* — P < 0,05, t-критерий Стьюдента.
Докраска ядер — DAPI. Бар — 100 мкм
Большинство клеток располагалось ближе к стенкам PCL кондуита, тогда как центральная область трубки ММСК не содержала . В случае отсутствия нанесения на PCL покрытие фибринового клея адгезия клеток к поверхности трубки заметно снижалась . При имму-нофлуоресцентном окрашивании клеток на маркеры апоптоза (Caspase-3, -7, -10) иммунопозитивных клеток обнаружено не было
Пролиферативная активность клеток на различных матриксах анализировалась с помощью MTS-теста . Исследование показало, что покрытие фибриновым клеем Tissucol подложки из поли(е-капролактона), способствовало повышению пролиферативной активности клеток (рис . 1Б). Покрытие поверхности из поли(е-капролактона) поли-й-лизином не оказывало существенного воздействия на данный показатель
В группе PCL + Tissucol + MSC-LV-EGFP на 14 и 30 сут . после операции внутри PCL кондуита были обнаружены ММСК, экспрессирующие EGFP . Специфическое свечение было наиболее интенсивно на
14 сут после тубуляции в области проксимальных и дистальных концов трубки, но также присутствовало и в центральной части сформированного кондуита (рис. 2А) . К 30 сут . после операции свечение EGFP было распределено более равномерно по всей длине PCL трубки (рис . 2В) . Как на 14, так и на 30 сут . часть ММСК (~12—15%) была адгезирована к внутренней поверхности PCL кондуита
К 14 сут после тубуляции с Tissucol и ММСК кондуит был заполнен фибриновым матриксом (рис . 2Б), имелось большое количество клеток, часть которых (не менее 50%) экспрессировала EGFP . К 30 сут . на продольных срезах сформированного кондуита в группах PCL+Tissucol и PCL + Tissucol + MSC-LV-EGFP центральный отрезок седалищного нерва преодолевал диастаз в 5 мм и достигал периферического отрезка нерва (рис 2В) В первой группе животных (PCL) к аналогичному сроку дистального конца нерва достигали лишь отдельные пучки нервных волокон
*
О
н
>
о
*
о
н
>
о
о
со
центрально
дистально
Рис. 2. Продольные срезы кондуита через разные сроки от начала эксперимента iv vivo:
А — EGFP+ клетки через 14 сут. после тубуляции и имплантации ММСК с Tissukol; Б, В — состояние кондуита через 14 и 30 сут., соответственно, в группе PCL+Tissucol+MSC+LV-EGFP; 2В' — EGFP+ клетки в зоне, соответствующей выделенному красным квадратом участку. Бар: А—В — 500 мкм, В' — 50 мкм
Для оценки проводимой способности нервных волокон седалищного нерва у крыс использовали метод стимуляционной электронейромиографии . Во всех группах после пересечения нерва к 30 дню отмечалось частичное восстановление амплитуды моторного ответа (М-ответа) без статистически достоверных межгрупповых отличий (рис . 3А) . Однако порог вызывания М-ответа и латентный период (ЛП) по М-ответу в группе PCL + Tissucol заметно отличался от других экспериментальных групп (рис . 3Б). Значения амплитуды М-ответа оставались стабильными с 30 по 60 сут . в группах + и PCL+Tissucol,
при этом в группе PCL + Tissucol + MSC+LV-EGFP наблюдалось уменьшение порога М-ответа .
Исследование рефлекторного ответа (Н-ответ) позволило оценить также и функцию чувствительных волокон седалищного нерва . Наличие Н-ответа на 30 день после операции позволяет утверждать о восстановлении не только двигательной, но и чувствительной функции нерва . Соотношение амплитуд Н-ответа и М-ответа к 30 дню пришло к значениям, наблюдавшимся до пересечения нерва, но к 60 дню отмечалось увеличение соотношения Н/М-ответов в группе PCL + Tissucol + MSC+LV-EGFP .
Рис. 3. Амплитуда (Amax) и латентный период (ЛП) М- и Н-ответов икроножной мышцы крыс экспериментальных групп PCL (черный цвет), PCL + Tissucol, PCL+Tissucol+MSC+LV-EGFP до операции, через 30 и 60 сут. после тубуляции
Обсуждение
В ходе исследований in vitro обнаружена адгезия ММСК к внутренней поверхности PCL трубок, что подтверждает полученные ранее результаты [7]. При этом в случае нанесения на PCL покрытие фибри-нового клея Tissucol адгезия клеток к поверхности трубки заметно повышается . Отсутствие клеток, экс-прессирующих маркеры апоптоза или пролиферации, вероятнее всего свидетельствует о нахождении ММСК в интерфазе клеточного цикла
Для получения значимого терапевтического эффекта генетически модифицированные стволовые и прогениторные клетки должны обладать повышенной способностью к выживанию и активно экс-
прессировать терапевтические гены. Исследование позволило установить не только продолжительность присутствия ММСК, заключенных вместе с Tissucol в PCL кондуите до 30 сут . после тубуляции, но и эффективную экспрессию рекомбинантного репортер-ного гена EGFP в генетически модифицированных ММСК in vivo в течение указанного времени .
Не смотря на то, что центральный отрезок седалищного нерва в группах PCL+Tissucol и PCL + Tissucol + MSC+LV-EGFP преодолевал диастаз в 5 мм и достигал периферического отрезка нерва, говорить о функциональной состоятельности нерва без оценки проводимости не корректно . В ходе исследования были обнаружены одинаковые темпы
реиннервации в экспериментальных группах, но при этом присутствовали различия в порогах вызывания М-ответа и ЛП по М-ответу на 30 сут . после тубу-ляции . Это может свидетельствовать о том, что во второй группе (PCL+Tissucol) восстановление нерва происходило за счет медленнопроводящих аксонов, а в группах PCL и PCL+Tissucol + MSC + LV-EGFP за счет быстропроводящих аксонов . Наблюдаемое уменьшение порога М-ответа в группе PCL+Tissucol + MSC + Lv-EGFP с 30 по 60 сут . свидетельствует о продолжающейся ремиелинизации в данной группе
Соотношение амплитуд Н/М-ответов длительное время считали показателем возбудимости альфа-мотонейронов спинального центра, однако дальнейшие исследования установили, что изменчивость Н-ответа может определяться двумя факторами: состоянием мотонейронов и пресинаптическими тормозными влияниями на терминали Ia афферен-тов [20]. Из этого следует, что обнаруженное нарастание амплитуд Н/М-ответов к 60 дню в группе PCL+Tissucol + MSC + LV-EGFP может быть обусловлено как ослаблением пресинаптического торможения, так и повышением возбудимости мотонейронов
Таким образом, полученные нами результаты in vitro и in vivo подтверждают перспективность направления, которое заключается в комбинации терапии
ЛИТЕРАТУРА:
1. Lee S . K ., Wolfe S .W . Peripheral nerve injury and repair . J . Am . Acad . Orthop . Surg . 2000; 8(4): 243-52 .
2 . Navarro X . Functional evaluation of peripheral nerve regeneration and target reinnervation in animal models: a critical overview . Eur . J . Neurosci . Epub ahead of print . 2015 .
3 . Николаев С . И ., Галлямов А . Р ., Мамин Г . В . и др . Кондуит нерва на основе поли(е-капролактона) и локальная доставка генов vegf и fgf2 стимулируют нейрорегенерацию . Клеточные технологии в биологии и медицине 2014; 1: 44-49 .
4 . Chang С . J . The effect of pulse-released nerve growth factor from genipin-crosslinked gelatin in schwann cell-seeded polycaprolactone conduits on large-gap peripheral nerve regeneration . Tissue Eng . Part A . 2009; 15(3): 547-57 .
5 . Chiono V. , Vozzi G ., Vozzi F. et al . Melt-extruded guides for peripheral nerve regeneration . Part I: poly(epsilon-caprolactone) . Biomed . Microdevices 2009; 11(5): 1037-50 .
6 . Schnell E ., Klinkhammer K ., Balzer S . et al . Guidance of glial cell migration and axonal growth on electrospun nanofibers of poly-epsilon-caprolactone and a collagen/poly-epsilon-caprolactone blend . Biomaterials 2007; 28(19): 3012-25 .
7 . Frattini F . , Lopes F . R ., Almeida F . M . et al . Mesenchymal stem cells in a polycaprolactone conduit promote sciatic nerve regeneration and sensory neuron survival after nerve injury . Tissue Eng . Part A. 2012; 18(19-20): 2030-9 .
8 . Ribeiro-ResendeV .T., Pimentel-Coelho P . M ., Mesentier-Louro L .A . et al . Trophic activity derived from bone marrow mononuclear cells increases peripheral nerve regeneration by acting on both neuronal and glial cell populations . Neuroscience 2009; 159(2): 540-9 .
9 . Miri Bonjar M . R ., Maghsoudi H . , Samnia R . et al . Efficacy of fibrin glue on seroma formation after breast surgery . Int . J . Breast Cancer . 2012; 2012: 643132 .
10 . Tokuishi K ., Yamamoto S . , Anami K . et al . Successful application of subcutaneous adipose tissue with fibrin glue in conservative treatment of tracheobronchial rupture . Ann . Thorac . Surg . 2012; 94: 1726-9.
стволовыми клетками и трансплантации кондуита нерва, заполненного фибриновым гидрогелем Tissucol . Однако говорить о неоспоримых преимуществах данной комбинации на сегодняшний день не представляется возможным, в связи с необходимостью расширения морфологических и патофизиологических методов исследования для раскрытия полноценной картины возможных процессов нейрорегенерации в созданных условиях
Благодарности
Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ №13-04-12035_офи_м и РФФИ №15-04-07527_а. Исследование осуществлено в рамках программы повышения конкурентоспособности Казанского федерального университета и субсидии, выделенной Казанскому федеральному университету для выполнения государственного задания в сфере научной деятельности. Работа частично выполнена на оборудовании Междисциплинарного центра коллективного пользования Казанского федерального университета при финансовой поддержке государства в лице Минобрнауки России (ID RFMEFI59414X0003) и Научно образовательного центра фармацевтики Казанского (Приволжского) федерального университета.
11. Marconi S ., Castiglione G ., Turano E . et al . Human adipose-derived mesenchymal stem cells systemically injected promote peripheral nerve regeneration in the mouse model of sciatic crush . Tissue Eng . 2012; 18(11-12): 1264-72 .
12 . Azari M . F. , Mathias L., Ozturk E . et al . Mesenchymal stem cells for treatment of CNS injury . Curr. Neuropharmacol . 2010; 8: 316-23 .
13 . Chidgey A . P ., Layton D ., Trounson A . et al . Tolerance strategies for stem-cell-based therapies . Nature 2008; 453: 330-7 .
14 . Shi Y ., Zhou L ., Tian J . et al . Transplantation of neural stem cells overexpressing glia-derived neurotrophic factor promotes facial nerve regeneration . Acta Otolaryngol . 2009; 129(8): 906-14 .
15 . Cheng F . C ., Tai M . H ., Sheu M . L . et al . Enhancement of regeneration with glia cell line-derived neurotrophic factor-transduced human amniotic fluid mesenchymal stem cells after sciatic nerve crush injury . J . Neurosurg . 2010; 112(4): 868-79 .
16 . Oliveira J . T ., Almeida F . M ., Biancalana A . et al . Mesenchymal stem cells in a polycaprolactone conduit enhance median-nerve regeneration, prevent decrease of creatine phosphokinase levels in muscle, and improve functional recovery in mice . Neuroscience 2010; 170(4): 1295-303 .
17 . Катина М . Н ., Гайфуллина Р . Ф ., Хаятова З . Г . и др . Выделение, культивирование и дифференцировка мультипотентных мезенхимных стромальных клеток из жировой ткани крыс Rattus norvegicus и хомяков Mesocricetus auratus . КТТИ 2012; 7(3): 82-7 .
18 . Соловьева В . В . , Исаев А.А., Генкин Д.Д. и др . Влияние рекомбинантного гистона Н1. 3 на эффективность лентивирусной трансдукции клеток человека in vitro . КТТИ 2012; 3(7): 151-4 .
19 Masgutov R F , Masgutova G A , Zhuravleva M N et al Human adipose-derived stem cells stimulate neuroregeneration . Clin . Exp . Med . Epub ahead of print 2015 . DOI: 10 . 1007/s10238-015-0364-3
20. Старобинец М . Х . , Волкова Л . Д . Особенности функционирования сегментарного аппарата спинного мозга человека при различных формах нарушения нисходящего контроля . Физиология человека 1988; 14(2): 237-47 .
Поступила:17.09.2015
