Компьютерная спектрофотометрия в медицинской диагностике Текст научной статьи по специальности «Медицинские технологии»

№269

ВЕСТНИК ТОМСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА

январь

2000

ПРИМЕНЕНИЕ КОМПЬЮТЕРНЫХ И ИНФОРМАЦИОННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ В МЕДИЦИНЕ

УДК 532.08; 533.1/5.08; 615.47:616-074

А.А. Елисеев, Ю.П. Морозова, В.А. Козинская, Б.В. Королев,

КВ. Кулагина, О. В. Смирнов, В.Н. Черепанов

КОМПЬЮТЕРНАЯ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ В МЕДИЦИНСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ

Предложена и реализована компьютерная методика лабораторного спеюрофотометрического анализа многокомпонентных смесей на автоматизированном спектрофотометре. Проведены измерения электронных спектров поглощения ряда биологических объектов, имеющих важное диагностическое значение в медицине (фенилтиоцианат, миокард, атеросклеротические бляшки, моча, сыворотка крови). При этом математическое обеспечение ЭВМ включало в себя эффективные методы обработки наблюдаемых спектров: оригинальный метод разложения исследуемого спектра по экспериментальным базовым спектрам компонентов и метод производной спектрофотометрии. Методика эксперимента, ее аппаратурная реализация, а также полученные результаты измерений могут найти применение в практической лабораторной медицинской диагностике.

В обширном арсенале современных методов диагностики, основанных на оценке морфологических, функциональных, биохимических и генетических параметров организма, появляются принципиально новые методические подходы в анализе гомеостатических систем. Важное место среди этих методов принадлежит оптической спектроскопии, которая дает информацию о физико-химических свойствах среды, таких как строение молекулы, природа химических связей, межмолекулярные взаимодействия, позволяет определять качественно и количественно состав среды. В связи с этим в современной литературе достаточно активно обсуждаются возможности спектроскопии в диагностике широкого круга заболеваний человека [1-7]. Спектрофотометрические методы имеют большое диагностическое значение при исследовании биологических веществ, таких, например, как кровь (цельная, плазма, сыворотка), моча, мягкие ткани организма, биологически активные вещества (витамины, гормоны, ферменты). В частности, изучение аминокислот в клинической химии играет большую роль для диагноза и наблюдения наследственных болезней, аминокислотного метаболизма и других обменных процессов.

Спектры поглощения многих веществ, как правило, накладываются друг на друга, что создает трудности при их идентификации. Поэтому автоматизация спектрофотометрических измерений должна включать в себя соответствующее программное обеспечение, позволяющее решать задачу разделения полос поглощения с целью проведения дальнейшего количественного анализа. В данной работе при обработке экспериментальных данных, полученных на автоматизированном спектрофотометре СФ-26, использовались для этой цели методы производной спектрофотометрии и метод разложения исследуемого спектра многокомпонентной смеси по базисным спектрам, взятым из предварительно созданного банка экспериментальных спектров компонентов смеси. Полученные результаты не только иллюстрируют возможности компьютерной спектрофотометрии в диагностике биологических объектов, но и представляют самостоятельное значение в количественном анализе состава исследуемых веществ.

§1. Методика эксперимента

В этом параграфе изложены аппаратурная реализация экспериментальной установки и методы обработки результатов измерения, используемые в данной работе.

1.1. Автоматизированный спектрофотометр СФ-26

Для автоматического сбора и обработки данных спектрофотометрических измерений на основе лабораторного спектрофотометра СФ-26 и микро-ЭВМ была создана

автоматизированная установка (без каких-либо конструктивных изменений спектрофотометра).

Принципы автоматизации Задача заключается в том, чтобы, сканируя с определенным шагом оптическую систему (в данном случае призму) спектрофотометра, собрать, обработать и представить в удобной форме информацию об изменении светового потока при данной длине волны, проходящего через исследуемый образец Для этого был разработан блок сопряжения спектрофотометра с ЭВМ, состоящий из функциональных элементов (аналогоцифрового преобразователя с динамическим диапазоном 105; устройства управления шаговым двигателем; параллельного интерфейса), и необходимые управляющие программы, позволяющие устанавливать режимы сканирования спектра, проводить накопление и обработку регистрируемых спектров, создавать на диске банк спектров.

Технические характеристики экспериментальной установки:

- спектральный диапазон измерений: 186-1100 нм;

- обратная линейная дисперсия: 1; 7,5; 42,4 нм/мм соответственно при 200,340,600 нм;

- динамический диапазон чувствительности по оптической плотности D: 10_3<£КЗ.

Положительные качества установки:

- сокращено время получения спектра;

- данные эксперимента отображаются в графическом виде;

- оперативно применяются различные способы обработки полученных данных;

- увеличена точность регистрации и обработки измерений;

- расширен диапазон измерений оптической плотности.

1.2. Метод математического разложения спектра смеси по спектрам составляющих компонентов с известной концентрацией

Количественный анализ на основе математического разложения может быть полезен в тех случаях, когда наблюдается значительное перекрывание спектров компонентов смеси и в то же время имеется возможность получить их в чистом виде.

111

Математическое обоснование метода. Пусть имеется к веществ, для которых получены спектры, где каждый спектр представляет собой набор точек (отсчетов оптической плотности) при заданных длинах волн: D(Xi), D(X2), ..., А(Х„). Рассматривая спектр поглощения смеси этих веществ, предположим, что для смеси выполняется принцип суперпозиции:

/>(*.)=£с„ля а), о)

Л = 1

где ДХ) - спектр поглощения смеси; D£X), Q - спекф поглощения /-й компоненты и ее концентрация. Учитывая, что Д(Х) представляют собой наборы отсчетов на различных длинах волн Xi..Хт перепишем (1) в ви-

де системы уравнений

D(\a) = tc,Di(Xm),m = l п. (2)

Система (2) разрешается в случае к = п (л - число отсчетов в каждом спектре). Однако на практике обычно имеем п » к, т.е. число экспериментальных отсчетов значительно превышает число анализируемых компонентов. Система (2) оказывается переопределенной и требует специальных методов решения.

В этой ситуации можно прибегнуть к формальным методам разложения функций по функциональному базису, полагая, что А(Х), ...,А(Х) - это базисные функции, ДХ) - разлагаемая функция, а С, - коэффициенты разложения. Коэффициенты С, определяются единственным образом, если базисные функции А(Х)...

А(Х) являются линейно-независимыми, т.е. невоз-мож-но получить базисный спектр D,(k) из D/X) при i * j никакой линейной операцией. На практике это условие выполняется всегда.

Для построения системы уравнений с учетом пере-определенности домножим (2) почленно на D,(X) и просуммируем по всем строкам. Затем повторим эту процедуру для D2(X), ..., А(Х). В итоге получим систему уравнений с симметричной относительно главной диагонали матрицей, которая легко может быть решена относительно С,:

IPj &)D(X) =£С| YP (X) А (X),

». I X (3)

X —X j,..., Х„ , j — 1,..., к.

Разложение можно считать успешным, если относительная погрешность восстановления спектра 8 < 3 %.

Анализ ошибок и ограничений метода. Применимость метода разложения по базисным функциям определяется выполнимостью условия (1), т.е. принципа суперпозиции (аддитивности). Для рассматриваемой задачи это означает, что отсутствуют нелинейные концентрационные эффекты; отсутствует межмолекулярное взаимодействие, способное деформировать профиль спектра поглощения хотя бы одной ком-по-ненты смеси; недопустимо в смеси наличие (к + 1)-й компоненты (например, неизвестной примеси), спектр которой не представлен в базисе А, А- Математически это ограничение обусловлено неортогональностью базисных спектров. Это не означает, что количество эталонных спектров л, должно быть равно количеству компонентов смеси пс. Это условие можно сформулировать как л, £ причем если л, > то кон-

центрация базисных спектров, не представленных в смеси, будет близка к нулю.

Отметим возможность использования метода для обнаружения межмолекулярного взаимодействия при сильном перекрывании спектров, когда другие методы не позволяют обнаружить деформацию контуров. Детектором наличия такого взаимодействия может служить большая ошибка 5 или несоответствие концентраций фактически приготовленным.

1.3. Производная спектрофотометрия

Количественный анализ по спектрам поглощения основан на законе Бугера-Ламберта-Беера, отражающем линейную зависимость оптической плотности D и ее производных от концентрации раствора С и толщины поглощающего слоя d [8]:

А _ е хCd,

dTD,

dX"

dX"

Cd,

(4)

где Z\ - молярный показатель поглощения анализируемого вещества при аналитической длине волны X.

Основным положительным эффектом дифференцирования спектров является увеличение разрешения перекрывающихся в исходных спектрах полос. Наиболее общим и легко реализуемым из всех методов получения прозводных спектров является метод численного дифференцирования. Все методы численного дифференцирования можно разделить на две группы: метод разностей и методы, предполагающие предварительное описание экспериментальных данных с помощью выбранной математической функции с последующим аналитическим дифференцированием этой функции.

При рассмотрении производных функции можно сделать следующие выводы [8]:

- с ростом порядка дифференцирования производные спектры усложняются и ширина основных пиков в четных производных прогрессивно уменьшается;

- в нечетных производных абсциссе Хо (центр полосы) соответствует нулевое значение производных;

- в четных производных абсциссе Хо соответствует отрицательный (во второй, шестой, ...) или положительный (в четвертой, восьмой,...) экстремумы;

- на каждой ступени дифференцирования точки перегиба в исходном спектре превращаются в экстремумы, а экстремумы - в точки пересечения следующей производной с осью абсцисс.

Уменьшение полуширины основных пиков в четных производных улучшает разрешение полос, перекрывающихся в исходных спектрах. При этом полосы большой ширины (независимо от интенсивности), ниспадающие или восходящие ветви пологих пиков, рассеянный свет, постоянное фоновое поглощение и тому подобное при дифференцировании подавляются, что обеспечивает уменьшение систематических ошибок количественного анализа. Для уменьшения отношения сигнал/шум численное дифференцирование включает в себя многократное сглаживание исходных данных.

Производная спектрофотометрия используется в научном эксперименте в физической, органической и аналитической химии, биохимии и биофизике, фармацевтическом анализе, криминалистической эксперти-

112

зе, анализе пищевых продуктов и полимеров, при контроле чистоты атмосферного воздуха и сточных вод.

§2. Применение спектрофотометрии

2.1. Анализ электронного спектра поглощения фенилтиоцианата

В работе изучены элекронные спектры поглощения фенилтиоцианата (ФИТЦа), который широко используется в клинической химии для определения аминокислот; рассмотрено взаимодействие ФИТЦа с аминокислотами (триптофан, тирозин). Проведен квантово-механический расчет молекулы ФИТЦа методом ЧПДП со спектроскопической параметризацией [9].

В табл. 1 приведены расчетные и полученные экспериментальные данные для длин волн переходов 50 - S/

(/=1-5), силы осциллятора для каждого перехода и дипольные момент.

Дипольный момент основного состояния - 2,20 D. По данным табл. 1 видно, что переход S0->Si является запрещенным, а остальные переходы - разрешенные. Также были получены спектры поглощения триптофана и тирозина, причем все три наблюдаемые полосы поглощения соответствуют я-мг* переходам.

Анализ полученных спектров поглощения с учетом изменения концентраций ФИТЦа, тирозина и триптофана показал, что при взаимодействии аминокислот с ФИТЦем явно проявляется структура спектра поглощения ФИТЦа с некоторыми дополнительными пиками и перегибами, соответствующими тирозину или триптофану с резким возрастанием интенсивности. ФИТЦ предоставлен НИИ медицинской генетики РАМН.

Характеристика электронных переходов и состояний ФИТЦа в этаноле и ацетонитриле

Переход ^теор.э HM ^ЭКСП.э HM Сила осциллятора Дипольный момент, D

Этанол Ацетонитрил

So —> S\ 335 - 312 0,0061 7,71

So —► Sj 283 278 278 0,1611 3,45

So —> S3 277 266 264 0,1872 3,40

So —► S4 239 253 251 0,0469 3,05

So —> Ss 228 226 - 0,2503 2,17

Таблица 1

2.2. Количественный анализ нитросоединений

Работоспособность метода разложения по базисным спектрам была проверена на двухкомпонентных смесях (паранитроанилин и 2,4-динпгроанилин в водном растворе) и четырехкомпоненткых смесях (ортоюпрофенол, метанигроанилин, паранитроанилин, 2,4-динпгроанилин). При этом восстановленные спектры отличались по концентрации от заданного состава менее чем на 3 %. Отметим, что графическое представление результатов анализа на экране облегчает выбор рабочего диапазона длин волн. Эта методика представляет интерес для анализа лекарственных аппаратов, например сульфатиазола и сульфаниламида, смесей хлорофиллов [1].

2.3. Спектральный анализ мягких тканей

Условия эксперимента: спектральный диапазон 200-600 нм, шаг сканирования по длине волны 2 нм, щель спектрофотометра 0,4 мм, толщина образцов 20 мкм, температура комнатная.

Атеросклеротические бляшки. Спектры нормальной ткани и бляшек (образцы предоставлены Сибирским медицинским университетом) приведены на рис. 1. Отчетливо наблюдается различие нормальной и аномальной тканей: заметно относительное возрастание поглощения в области 284 нм.

Миокард, проводящая система миокарда. Характерные спектры поглощения этих биологических объектов (исследуемый материал предоставлен НИИ кар-

диологии РАМН) приведены на рис. 2. Наблюдается относительно меньшее поглощение в тканях миокарда

Рис. 1. Оптическая плотность (вверху) и ее вторая производная (в относительных единицах) нормальной ткани (1) и атеросклеротической бляшки (2)

113

по сравнению с проводящей системой в области 222 нм, что свидетельствует о различном содержании алифатических аминокислот в белках этих тканей.

Рис. 2. Оптическая плотность (вверху) миокарда (2), его проводящей системы (1) и ее вторая производная (в относительных единицах)

2.4. Спектрофотометрия в лабораторной медицинской диагностике

Моча. Электронный спектр поглощения мочи здорового человека имеет относительно гладкую структуру, полоса поглощения широкая (^«200-550 нм) с максимумом на 7=360 нм. Повышенное содержание белка в моче приводит к смещению максимума поглощения в коротковолновую область. Следует отметить, что на практике для целей диагностики иногда легче проводить люминесцентное обнаружение продуктов жизнедеятельности организма, например порфиринов в мо-

че [6]. Так, на ранней стадии отравления свинцом содержание порфиринов в моче возрастает в 2-10 раз. Это возрастание обнаруживают по изменению цвета флуоресценции (в норме - голубовато-зеленый цвет, при отравлении - от розового до красного). Повышенное содержание порфиринов в моче может быть и при некоторых заболеваниях печени, лимфогранулематозе. Содержание порфиринов в моче может и падать по сравнению с нормой в 4-10 раз при азотемии (накопление в крови избыточного количества продуктов белкового обмена при урологических заболеваниях).

Сыворотка крови. Проведенные измерения спектров поглощения сыворотки крови в области 340-730 нм при определенных патологических состояниях детей показали незначительные смещения центров полос поглощения (табл. 2) и в то же время сильное изменение относительных и абсолютных величин поглощения, особенно в области 418 и 466 нм. Изменение поглощения связано с концентрационным изменением состава крови. Например, известно, что наблюдающееся повышение поглощения сыворотки крови больного гепатитом на 7=466 нм обусловлено повышенным содержанием билирубина в крови. Из табл. 2 видно также, что в зависимости от заболевания появляются или исчезают в спектре поглощения некоторые линии, что свидетельствует также об изменении концентрации компонентов крови.

Таблица 2

Центры линий поглощения сыворотки детской крови при некоторых заболеваниях

Образец Максимумы поглощения, нм'

Норма 344 356 422 464 - 492 -

Анемия - 352 418 464 - 490 -

Кожный зуд - 356 418 464 - 490 538

Аллергический миокардит - 350 422 466 - 492 528

Г епатит - 352 416 466 478 488 -

Г астродуоденит 346 352 418 466 478 490 -

Сердечно-сосудистое заболевание 344 358 418 468 478 492 -

Лимфаденит - 350 418 466 - 490 -

* Ошибка измерения длины волны * ± 2 нм.

ЛИТЕРАТУРА

1. Штерн Э., Тиммонс К. Электронная абсорбционная спектроскопия в органической химии. М.: Мир,1974. С. 291.

2. Чевари С, Чаба И. Спектрофотометрический метод определения гемоглобина в крови // Лабораторное дело. 1983. № 8. С. 457-460.

3. Чевари С, Андлл Т. Определение железа в сыворотке и его диагностическое значение // Лабораторное дело. 1987. № 4. С. 252-255.

4. Спектроскопические методы исследования в физиологии и биохимии. Л.: Наука, 1987. С. 204.

5. Приезжее А.В., Тучин В.В., Шубочкин Л.П. Лазерная диагностика в биологии и медицине. М.: Наука, 1989. С. 237.

6. Барашков Н.Н. Люминесцентный анализ на службе здоровья. М.: Наука, 1985. С. 95.

7. Sherwood ЯА., Titheradge А.С., Richards D.A. Measurement of plasma and urane amino acids by high-perforance liquid chromatography with electrochemical detection using phenylisothiocyanate derivatization H J. of Chromatography. 1990. V. 528. P. 293-303.

8. Новые физико-химические методы исследования органических соединений: Уч. пособие / Б.В. Иоффе, И.Г. Зенкевич, М.А. Кузнецов, И.Я. Бернштейн. Л.: ЛГУ, 1984. С. 240.

9. Артюхов В.Я., Галеева А.И. Спектроскопическая параметризация методом ЧПДП // Изв. вузов. Физика. 1986. №11. С. 96-100.

Статья представлена кафедрой оптики и спектроскопии физического факультета Томского государственного университета и лабораторным отделом областного организационно-методического и контрольного центра по лабораторному делу, поступила в научную редакцию «Кибернетика и информатика» 15 декабря 1999 г.

114