CC BY
8ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, Серия А, 1997, том 39, № 1. с. 17-21
УДК 541(64+49):539.77
КОМПЛЕКСЫ ДНК-ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНОЕ ВЕЩЕСТВО, РАСТВОРИМЫЕ В МАЛОПОЛЯРНЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ1
© 1997 г. В. Г. Сергеев, О. А. Пышкина, А. Б. Зезин, В. А. Кабанов
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова. Химический факультет
119899 Москва, Воробьевы горы Поступила в редакцию 08.08.96 г.
Принята в печать 22.08.96 г.
Показана возможность растворения линейной высокомолекулярной ДНК в безводных малополярных органических растворителях путем ее комплексования с катионными поверхностно-активными веществами. Методами скоростной седиментации, УФ-спектроскопии и спектрофотометрии кругового дихроизма установлено, что комплексы ДНК с цетилтриметиламмоний бромидом и дистеарил-диметиламмоний хлоридом в хлороформе, гептане и циклогексане представляют собой индивидуальные соединения состава 1:1. При этом ДНК, переведенная в органическую фазу, сохраняет конформацию двойной спирали. Исследована устойчивость сгехиометричного комплекса ДНК (300-500 пар оснований)-дистеарилдиметиламмоний хлорид в водно-солевой среде. Показана возможность переноса этого комплекса через границу раздела фаз вода-хлороформ и хлороформ-0.5 М водный раствор ЫаС1.
В работах [1-3] показано, что сгехиометрич-ные комплексы, образованные гибкоцепными по-лиионами и противоположно заряженными ПАВ, способны растворяться в органических растворителях с низкой диэлектрической постоянной. Недавно мы показали [4], что последнее справедливо также и для высокомолекулярной линейной ДНК. Иными словами, продемонстрирована возможность растворения высокомолекулярной ДНК в сухих малополярных органических растворителях путем ее комплексования с катионными ПАВ.
В настоящей работе получены стехиометрич-ные комплексы различных ДНК с катионными ПАВ и изучено их поведение в малополярных органических средах, а также в двухфазных системах типа масло-вода.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали ДНК из эритроцитов цыплят "Союзхимреактив" (800-3000 пар оснований, М = (0.5-2) х 10б) (ДНК-1), ДНК из спермы лосося "ГОСНИИОХТ" (300-500 пар оснований, М = (1.9-3.2) х 105) (ДНК-2) и синтетический гетерогенный 14-звенный ДНК-дуплекс2. Нативные препараты ДНК очищали от примеси белка по ме-
1 Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (код проекта 96-03-33522а).
2 ДНК-дуплекс был синтезирован на кафедре химии природ-
ных соединений химического факультета МГУ в лабора-
тории З.А. Шабаровой и любезно предоставлен нам для
проведения исследований.
тодике [5]. В качестве ПАВ применяли цетилтриметиламмоний бромид (ЦТАБ) и дисгеарилдиме-тиламмоний хлорид (ДСДАХ) ('Tokyo Kasei Kogyo Со"). Хлороформ, гептан и циклогексан (х. ч.) очищали от следовых количеств воды над молекулярными ситами 5 А. Растворителем служила дистиллированная вода (дополнительно очищенная с помощью системы "Milli-Q" ("Millipore", США)), низкомолекулярной солью - NaCl (ч. д. а.). Все эксперименты выполняли при рН 8.0 (0.5 М ТВЕ-бу-фер). Седиментационные исследования проводили на аналитической ультрацентрифуге "Beckman-E" (США) при скорости вращения ротора со = 48000 и 60000 об/мин и температуре 20°С. Седиментационные профили регистрировали по изменению оптической плотности растворов при X = 260 нм.
Комплексы ДНК-ПАВ получали в микропробирках (аппендорфах) смешением водных растворов ДНК концентрации 10-20 мкг/мл (что соответствует концентрации нуклеотидных звеньев (3-6) х 10"5 моль/л) и ДСДАХ или ЦТАБ, взятых в эквимольном количестве по отношению к фосфатным группам ДНК, при 20°С. Полученные осадки комплексов ДНК-ПАВ отделяли от супер-натанта центрифугированием на препаративной центрифуге "Elmi" при 12000 об/мин, после чего их декантировали и сушили в вакуумном эксикаторе над хлоридом кальция в течение 7-10 дней до постоянной массы. Высушенные образцы помещали в органический растворитель (хлороформ, циклогексан или гептан). Концентрацию комплекса ДНК-ПАВ, перешедшего в органический растворитель, определяли спектрофотометрически
сПАв/сДНК
Рис. 1. Зависимость остаточной концентрации ДНК-1 (а) и ДНК-2 (б) в надосадочной жидкости после отделения сгехиометричного комплекса ДНК-ПАВ от соотношения концентраций ДНК и ПАВ: 1 - ДСДАХ, 2 - ЦТАБ. Концентрация ДНК 20 мкг/мл, Т = 20°С.
при длине волны 260 нм, используя спектрофотометр "Specord М-40" (Германия).
Спектры кругового дихроизма (КД) в области 240-310 нм получали на спектрополяриметре "JASCO J-500 С" (Япония) в 1 см кювете при температуре 20°С. Величину Де рассчитывали, выражая концентрацию ДНК или комплекса ДНК-ПАВ в молях нуклеотидов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При титровании водного раствора ДНК водным раствором ПАВ происходит осаждение комплексов ДНК-ПАВ. Зависимости остаточной концентрации ДНК в надосадочной жидкости после отделения комплекса на центрифуге от соотношения концентраций ПАВ и ДНК представлены на рис. 1. Как видно из кривой 1, связывание ДНК с более гидрофобными ионами ДСДАХ начинается уже при очень низких концентрациях ПАВ в растворе (-ÍO-6 моль/л). В области достоверных измерений содержание ДНК в супернатанте уменьшается практически линейно с увеличением количества добавленного ДСДАХ. При соотношениях ДНК и ДСДАХ, близких к эквимольному, практически вся ДНК переходит в нерастворимый комплекс. Следовательно, состав образующихся комплексов ДНК-ДСДАХ не зависит от соотношения концентраций исходных реагентов и близок к 1: 1 (сгехиометричный комплекс). На рис. 1 приведена также кривая 2 осаждения ДНК раствором ЦТАБ. В случае относительно менее ги-
дрофобного ЦТАБ связывание ДНК в комплексы начинается лишь после достижения некоторой критической концентрации ПАВ (кривая 2). При этом так же, как и в случае ДСДАХ, практически полное осаждение ДНК из раствора наблюдается при экви-мольном соотношении ДНК и ЦТАБ. Следует заметить, что при соотношениях ПАВ/ДНК > 1 в надосадочной жидкости обнаруживается заметное количество ДНК, не перешедшей в осадок. Это обусловлено недостаточно эффективным режимом центрифугирования используемой в работе препаративной центрифуги "Е1пй", при котором не удается отделить высокодисперсную фракцию комплекса ДНК-ПАВ. Полностью осадить эту фракцию удается в аналитической центрифуге "Весктап-Е" при скорости вращения ротора 25000 об/мин. Центрифугирование системы ДНК-ПАВ при соотношении компонентов 1:1 при таком режиме показывает, что уже на разгоне весь комплекс осаждается и после установления заданного режима центрифугирования 60000 об/мин (в течение 10 мин) в ячейке не обнаруживаются молекулы ДНК. Это однозначно свидетельствует, что реакция между ДНК и ПАВ действительно завершается образованием сгехиометричного комплекса.
Комплексы ДНК-ПАВ, включающие экви-мольные количества звеньев ДНК и катионов ПАВ, как и комплексы других полиионов с противоположно заряженными ПАВ, не растворяются в воде, поскольку ионогенные группы в них экранированы от молекул воды гидрофобными фрагментами ПАВ. Образование таких комплексов обусловлено электростатическим взаимодействием фосфатных групп ДНК с противоионами ПАВ. Важную роль в стабилизации комплексов ДНК-ПАВ в водных средах играют гидрофобные взаимодействия углеводородных радикалов ПАВ внутри частиц комплекса. Стехиометричные комплексы ДНК-ПАВ, полученные, как описано выше, исследовали на растворимость в малополярных органических растворителях - хлороформе, гептане и циклогексане. Оказалось, что комплексы высокомолекулярных образцов ДНК с ДСДАХ и ЦТАБ, помещенные в указанные растворители, через несколько часов переходят в раствор. Следует отметить, что полное растворение достигается только для тщательно высушенных образцов. Наряду с этим стехиометричные комплексы низкомолекулярного ДНК-дуплекса как с ЦТАБ, так и с ДСДАХ оказались не растворимы даже в хлороформе—самом полярном из использованных нами растворителей. Такой, на первый взгляд, парадоксальный результат, возможно, объясняется заметным вкладом гидрофильных торцов относительно коротких молекул дуплекса в липо-фильно-липофобный баланс комплексов.
Полученные растворы исследовали методом седиментации. Флотационные профили для растворов в хлороформе, относящиеся к различной
КОМПЛЕКСЫ ДНК-1
Ряс. 2. Флотационные профили комплексов ДНК-ДСДАХ в хлороформе при различной продолжительности центрифугирования, а: ДНК-1, время центрифугирования 2 (7), 13 (2) и 26 мин (3), (О = 40000 об/мин; б: ДНК-2, время центрифугирования 411), 12 (2), 17 (5), 29 мин (4), со = = 60000 об/мин. Т= 20°С.
»-АКТИВНОЕ ВЕЩЕСТВО 19
Поглощение, отн. ед.
Рис. 3. УФ-спектры стехиометричных комплексов ДНК-ДСДАХ в хлороформе: 1 - ДНК-1,2 -ДНК-2, 3 - исходная ДНК в 0.5 М ТВЕ-буфере. Концентрация ДНК 20 мкг/мл, Т=20°С.
продолжительности центрифугирования, приведены на рис. 2. Видно, что во всех случаях на се-диментограммах наблюдается только одна ступенька, соответствующая комплексу постоянного состава. Поскольку ДНК в отсутствие ПАВ не растворяется в хлороформе, из приведенных данных следует, что комплексы ДНК-ДСДХ не диссоциируют на исходные компоненты, т.е. присутствуют в растворе в виде устойчивого индивидуального соединения. Аналогичные данные получены и для комплексов ДНК-ЦТАБ.
Одной из важнейших характеристик растворов нуклеиновых кислот и полинуклеотидов, отражающей конформационное состояние ДНК в водных растворах, является спектр поглощения в УФ-области. На рис. 3 представлены спектры поглощения комплексов ДНК-ДСДАХ в хлороформе (кривые 1 и 2). Для сравнения приведен спектр исходной ДНК в воде (кривая 3). Видно, что при замене водной среды на органическую существенных изменений в спектрах поглощения не происходит. Для всех спектров наблюдается максимум поглощения в области 260 нм. Коэффициент экстинции в обоих случаях составляет 6500-6700 моль-1 см-1. Аналогичные спектры характерны и для комплексов ДНК-ЦТАБ. УФ-спектры комплексов ДНК-ДСДАХ и ДНК-ЦТАБ в гептане и цикло-гексане идентичны спектрам в хлороформе.
На рис. 4 приведены спектры кругового дихроизма для комплексов ДНК-ДСДАХ в хлороформе (кривые 1 и 2) и исходной нативной ДНК в воде, молекулы которой находятся в В-форме (кривая 3). Видно, что в спектрах комплексов проявляются характерные черты спектра нативной ДНК в конформации закрученной двойной спирали [6]. Для комплекса наиболее высокомолекулярной ДНК-1 характерна длинноволновая положительная полоса с максимумом около 280 нм и мольным дихроизмом меньше двух, а также интенсивная коротковолновая отрицательная полоса с
минимумом при 240 нм. Точка инверсии ( Де=0) лежит в области 270 нм. Аналогичные спектры КД наблюдали для сильно компактизованных нуклеиновых кислот, находящихся в головках фагов [7]. В спектре комплекса ДНК-2, имеющей несколько меньшую молекулярную массу, проявляются характерные черты спектра нативной ДНК в А-фор-ме. В нем присутствует интенсивная длинноволновая положительная полоса с максимумом около 270 нм и коротковолновая отрицательная полоса с минимумом при 240 нм. Точка инверсии (Де = 0) лежит в области 255 нм. А-форма, как известно [6], отличается от В-формы несколько большей за-крученносгью двойной спирали. Таким образом, комплексообразование ДНК с противоположно заряженными ПАВ и перевод этих комплексов в малополярные органические растворители не приводит к разрушению двойной спирали, т.е. вторичной структуры, характерной для нативной ДНК.
ДЕ
5 3 - 3 2_/ >
1 / / 7 \
-1 . 230 / //270 4^10 X, нм
-3 - \
-5
Рис. 4. КД-спектры комплексов ДНК-ДСДАХ в хлороформе: 1 - ДНК-1,2- ДНК-2,3 - исходная ДНК в 0.5 М ТВЕ-буфере.
сднк х Ю6> моль/л 6
0.4 0.6 0.8 1.0
С^аС1 > МОЛЬ/Л
Рис. 5. Диссоциация комплекса ДНК-2-ДСДАХ в растворе №С1 различной концентрации. Т = = 20°С.
Спектры КД не содержат прямой информации о третичной структуре ДНК в комплексах с кати-онными ПАВ. Однако, недавно, методом флуоресцентной микроскопии установлен факт резкой компактизации молекул ДНК при образовании таких комплексов в водном растворе [8, 9]. Позднее мы показали также, что компактная конформация сохраняется и при переводе комплекса ДНК-ПАВ в малополярные органические растворители [10].
Известно, что комплексы полианион-ПАВ в водных средах диссоциируют на исходные компоненты при добавлении определенных количеств низкомолекулярной соли [И]. Мы убедились, что последнее справедливо и для комплексов ДНК-ПАВ. Для этого к сухому водонерастворимому комплексу ДНК-2-ДСДАХ, полученному смешением водных растворов, содержащих заданные количества ДНК и ПАВ в соотношении 1: 1, добавляли 0.5 мл раствора №С1 различной концентрации. Через 48 ч (время, достаточное для установления равновесия) спектрофотометрически определяли количество перешедшей в водную фазу ДНК. Соответствующая зависимость представле-
на на рис. 5. Видно, что при концентрациях ИаС1, превышающих 0.25 моль/л, ДНК начинает переводить в водно-солевой раствор в результате диссоциации комплекса. Количество ДНК в растворе увеличивается с повышением содержания №С1 в исследуемой системе. В этой связи представляло интерес выяснить возможность диссоциативного переноса ДНК из раствора ее комплекса с катион-ным ПАВ в органическом растворителе в водную фазу, содержащую низкомолекулярную соль.
Исследование проводили следующим образом. В микропробирку помещали 0.5 мл раствора ДНК заданной концентрации в 0.5 М ТВЕ-буфе-ре. Туда же добавляли 1 мл хлороформа. В полученную двухфазную систему вводили различные количества ПАВ. Смесь интенсивно перемешивали в течение 5 мин, центрифугировали, а затем спектрофотометрически определяли содержание ДНК в органической и водной фазах.
Оказалось, что комплексы высокомолекулярной ДНК-1, образующиеся в водной фазе, в органическую фазу не переходят, а концентрируются на межфазной границе. В отличие от этого комплексы менее высокомолекулярной ДНК-2 с ДСДАХ (но не с ЦТАБ) переходят из водной фазы в органическую. На рис. 6 представлены зависимости концентрации ДНК в органической (кривая 1) и водной фазах (кривая 2) от исходных соотношений ДСДАХ : ДНК-2 в водной фазе. Видно, что убыль ДНК в воде соответствует ее накоплению в хлороформе. При добавлении 1.5-кратного избытка ДСДАХ практически вся ДНК оказывается в органической фазе.
Замечательно, что добавлением №С1 в водную фазу можно вызвать обратный перенос ДНК из органической фазы в водную. Это было показано следующим образом. Слой органической фазы в микропробирке, содержащий различные количества растворенного комплекса ДНК-ДСДАХ, отделяли от водного слоя и смешивали с 0.5 мл 0.5 М ЫаС1. Смесь интенсивно перемешивали в течение 5 мин, разделяли центрифугированием и вновь определяли содержание ДНК в каждой из фаз. Результаты приведены ниже
Исходная концентрация ДНК-2 в хлороформе, моль/л Равновесная концентрация ДНК-2 в водной фазе, моль/л
9x10"* 1.8 х10"5 2.4 х 10~5 3.0 х 10~5 3.0 хЮ"6 3.0x10"* 3.0 х КГ6 3.0x10"*
Видно, что в изученных системах, действительно происходит обратный перенос ДНК из хлороформа в водно-солевой раствор. При этом количество перешедшей ДНК не зависит от исходной концентрации ее комплекса в органическом растворителе. Можно полагать, что концентрация ДНК, перешедшей в водную фазу, определяется содержанием в ней низкомолекулярных ионов, вызывающих диссоциацию комплекса ДНК-ДСДАХ на исходные компоненты.
Следует подчеркнуть, что предложенный нами способ перевода ДНК в малополярные органические растворители принципиально отличается от описанной ранее [12] солюбилизации нуклеиновых кислот в обращенных мицеллах, где макромолекулы, переходя в органическую фазу, тем не менее остаются в водном микроокружении.
Некоторое время назад появилось краткое сообщение [13] о растворимости комплексов ДНК с
КОМПЛЕКСЫ ДНК-ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНОЕ ВЕЩЕСТВО
21
Сднк X 105, моль/л
сПАв/сДНК
Рис. 6. Зависимость количества ДНК-2 в водной фазе (7) и в хлороформе (2) от соотношения концентраций ДСДАХ и ДНК-2 в водной фазе (0.5 М ТВЕ-буфер). Т= 20°С.
катионными амфифилами в органических средах. Однако отсутствие каких-либо данных о молекулярных характеристиках использованной ДНК затрудняет интерпретацию результатов [13]. Из данных, описанных выше, следует, в частности, что растворимость комплексов и их поведение в водно-органических средах решающим образом зависит от молекулярной массы ДНК.
В заключение следует отметить, что перевод ДНК в органическую фазу открывает новые возможности для осуществления ее химической модификации с использованием реагентов, неприменимых в водной среде. Кроме того, поскольку состояние ДНК в этих условиях в какой-то мере моделирует ее состояние в липидном бислое, перевод ДНК в органические растворители открывает новые пути для моделирования отдельных
стадий трансмембранного переноса нуклеиновых кислот. В качестве одной из таких моделей можно рассматривать описанный выше диссоциативный перенос комплексов ДНК-ПАВ из хлороформа в водно-солевой раствор.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Бакеев КН., Ян Мин Uly, Зезин А.Б., Кабанов В.А. // Докл. РАН. 1993. Т. 332. № 4. С. 450.
2. BakeevKJ°J„ ChugunovSA., Teraoka/.,MacKnight WJ., Zezin A.B., Kabanov V.A. // Macromolecules. 1994. V. 27. № 14. P. 3926.
3. Kabanov A.V., Sergeev V.G., Foster M.S., Kasaikin V.A., Levashov A.V., Kabanov VA. // Macromolecules. 1995. V. 28. № 10. P. 3657.
4. Пышкина O.A., Сергеев В.Г., Зезин А.Б., Кабанов В.А. // Докл. РАН. 1996. Т. 348. № 4. С. 496.
5. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
6. Ivonov V.l., Minchenkova L.E., Schyolkina A.K., Pole-taevA.l. H Biopolymers. 1973. V. 12. P. 89.
7. Karasev A.V., Dobrov E.N. // Int. J. Biol. Macromol. 1988. V. 10. P. 227.
8. Mel'nikov S.M., Sergeyev V.G., Yoshikawa K. // J. Am. Chem. Soc. 1995. V. 117. № 9. p. 2401.
9. Mel'nikov S.M., Sergeyev V.G., Yoshikawa K. // J. Am. Chem. Soc. 1995. V. 117. № 40. P. 9951.
10. Пышкина O.A., Сергеев В.Г.,Лезов A.B., Мельников А.Б., Рюмцев ЕМ., Зезин А.Б., Кабанов В.А. И Докл. РАН. 1996. Т. 349. № 6. С. 772.
11. Хандурина Ю.В., Рогачева В.Б., Зезин А.Б., Кабанов В.А. II Высокомолек. соед. 1994. Т. 36. № 2. С. 241.
12. Imre V.E., Luisi PL. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1982. V. 107. № 2. P. 538.
13. ¡jiro К., Okahata Y. // J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1992. № 18. P. 1339.
DNA-Surfactant Complexes Soluble in Low-Polarity Organic Liquids
V. G. Sergeev, O. A. Pyshkina, A. B. Zezin, and V. A. Kabanov
Department of Chemistry, Moscow State University, Vorob'evy Gory, Moscow, 119899 Russia
Abstract—A linear high-molecular-mass DNA can dissolve in non-aqueous low-polarity organic solvents by forming complexes between DNA and cationic surfactants. The data of high-rate sedimentation, UV spectrometry, and circular dichroism measurements show that the DNA complexes with cetyltrimethylammonium bromide (СТАВ) and distearyldimethylammonium chloride (DSDAC) in chloroform, heptane, and cyclohex-ane are individual compounds with a 1 : 1 stoichiometry. The DNA molecules passing to the organic phase retain a double-stranded helix conformation. Stability of a stoichiometric complex between DNA (300-500 bp) and DSDAC was studied in an aqueous medium. It was demonstrated that this complex can be transferred through a water-chloroform and 0.5 M aqueous NaCl-chloroform phase boundaries.
