CC BY
34
УДК 577. 34
Н. А. Касьяненко, В. В. Сморыго
Вестник СПбГУ. Сер. 4, 2007, вып. 2
КОМПАКТИЗАЦИЯ ДНК В РАСТВОРЕ, ИНДУЦИРОВАННАЯ ЕЕ СВЯЗЫВАНИЕМ С ПОЛИКАТИОНАМИ И ТОЧЕЧНЫМИ МНОГОВАЛЕНТНЫМИ ИОНАМИ
Компактные дискретные структуры, возникающие в растворе при взаимодействии высокомолекулярной ДНК с различными агентами, используют в генной инженерии и нанотехнологиях. Образование таких структур в разбавленных водных растворах вызывает значительный интерес для понимания механизма обратимой компактизации ДНК с сохранением вторичной структуры.
Молекула ДНК в водной среде в широкой области рН представляет собой сильно заряженный жесткий полианион. Высокомолекулярная ДНК в растворе приобретает конформацию сильно набухшего статистического клубка. Вода является хорошим растворителем для ДНК в широкой области концентраций ЫаС1 [1], однако набухание макромолекулы в растворе обусловлено в основном полиэлектролитными эффектами. В связи с этим для компактизации ДНК необходима экранировка ее отрицательного заряда. Ионы одно- и двухвалентных металлов не могут вызвать конденсацию двуспи-ральной ДНК в водном растворе [1, 2]. При использовании же ионов трехвалентных металлов наблюдается переход ДНК в компактное состояние с сохранением вторичной структуры [3-5], причем в некоторых случаях возникают тороидальные частицы, в которых ДНК имеет плотную регулярную упаковку [3, 6, 7]. Процесс образования дискретных компактных частиц в растворе с участием ДНК в литературе называется конденсацией ДНК, тогда как под компактизацией макромолекулы понимают любое резкое уменьшение ее размеров в растворе. Результатом конденсации ДНК может быть появление тороидальных, палочкообразных или сферических частиц, а также сетчатых структур. Интересно отметить, что в присутствии поликатионов также реализуется конденсация ДНК [8]. При достижении определенного соотношения между концентрациями заряженных групп полианионов (Р - молярная концентрация фосфатных групп ДНК) и поликатионов (Ы - молярная концентрация мономерных звеньев, содержащих азот) происходит компактизация ДНК (обычно при №Р >1), за которой следует образование компактных структур [9, 10]. Опыт показал, что при использовании поликатионов компактизации ДНК предшествует область М:Р, в которой объем молекулы ДНК меняется незначительно, в отличие от Точечных трехвалентных ионов, вызывающих уменьшение объема ДНК даже при небольших концентрациях в растворе [4, 5,11].
Вопрос об обратимости конденсации ДНК - очень важный в связи с применением таких структур для направленной передачи генетического материала в клетки-мишени. Кроме того, существует мнение, что добавление избытка конденсирующего агента приводит к перезарядке комплексов и в ряде случаев их перерастворению [12-16]. Настоящая работа посвящена изучению обратимости комплексов ДНК с поликатионами и рассмотрению возможности перерастворения комплексов при больших концентрациях положительно заряженных агентов.
© Н. А. Касьяненко, В. В. Сморыго, 2006
Методы исследования и материалы. Использовали тимусную ДНК «Sigma» с молекулярной массой М= 6 -106 Да, соли NaCl и LaCl3 марки «х,ч.», полиаллиламии (ПАА), синтезированный кандидатом химических наук О. В. Назаровой в Институте высокомолекулярных соединений РАН. Молекулярная масса ПАА была определена вискозиметрически и составила 20 ООО Да. Комплексы готовили сливанием равных объемов выбранных концентраций ДНК и препарата в 0,005 М NaCl и выдерживали при температуре +4 °С в течение 24 ч.
Спектры кругового дихроизма (КД) и ультрафиолетового (УФ) поглощения ДНК регистрировали на автодихрографе Mark IV, «Jobin Ivon» (Франция) и спектрофотометре СФ-56 соответственно. Относительную вязкость растворов Г|г = Л/Л0> гДе Л и Л0 _ вязкость раствора и растворителя, определяли при разных градиентах скорости потока g с последующей экстраполяцией к g = 0 на низкоградиентном ротационном вискозиметре [17]. Характеристическую вязкость ДНК
г , Tjr -1
^ с™ г получали, экстраполируя к нулевой концентрации ДНК С = 0 концентрационную
зависимость приведенной вязкости Г|пр = (г|г - 1 )/С. Все измерения проводили при температуре 21 'С.
Результаты и их обсуждение. Ранее в лаборатории молекулярной биофизики НИИФ СПбГУ было изучено взаимодействие молекулы ДНК с трехвалентными ионами Fe3+ и комплексными ионами [Co(NH3)6]3+. Было показано, что присутствие трехвалентных ионов в растворе вызывает уменьшение объема молекулы ДНК. На опыте фиксируется падение характеристической вязкости ДНК [г|] не только в растворах малой ионной силы, но и при больших концентрациях NaCl (1 М), соответствующих полному подавлению электростатических взаимодействий в макромолекуле [4, 5]. Такой же результат был получен нами для ионов лантана (рис. 1). Компактизация ДНК, индуциро-
[Л]. Дл/г
10 С Ю6, м
Рис. 1. Зависимость характеристической вязкости ДНК от концентрации LaCl3 в 1 М NaCl (1) и 0,005 NaCl M (2).
ванная трехвалентными ионами металлов, сопровождается внутримолекулярным структурированием ДНК - появлением взаимно ориентированных сегментов двойной спирали, связанных трехвалентными ионами [4,5]. Как видно из рис. 1, существует область концентраций лантана, где наблюдается неизменность величины [г|], свидетельствующая о насыщении связывания. Дальнейшее увеличение концентрации лантана в растворе приводит к резкому снижению объема ДНК, предшествующему ее выпадению в осадок. На рис. 2 приведены данные для относительной вязкости растворов разной концентрации ДНК в присутствии ионов лантана. Под конденсацией ДНК понимают процесс ком-
Рис. 2. Зависимость относительной вязкости растворов ДНК
от концентрации ЬаС13 в 0,005 М ЫаС1. Концентрация ДНК(в%): 1 - 0,003,2 - 0,007,3 - 0,009,4 -0,0011.
пактизации, сопровождающийся появлением в растворе дискретных малых частиц. Методом вискозиметрии было зафиксировано уменьшение размеров ДНК. В этом случае падение вязкости сопровождается увеличением оптической плотности растворов (рис. 3), которое наблюдается не только при А, = 260 нм (соответствующей максимуму в спектре поглощения ДНК), но и при X = 310 нм вне спектра поглощения и, возможно, связано с рассеянием. С ростом концентрации ДНК рассеяние увеличивается. Мы воспользуемся этими данными для фиксации конденсации макромолекулы: повышение оптической плотности раствора будет критерием появления конденсированной ДНК.
В последнее время в литературе обсуждается вопрос о том, может ли после конденсации ДНК мультивалентными ионами дальнейшее добавление в раствор конденсирующих агентов привести к перезарядке и перерастворению конденсатов и восстановлению размеров ДНК. Этому посвящены теоретические и экспериментальные работы [12-17], в том числе рассматривающие конденсацию ДНК трехвалентными ионами.
а ло5, м
La '
Рис. 3. Зависимость оптической плотности растворов ДНК D при \ = 310 нм от концентрации LaCl3 в 0,005 М NaCl.
Концентрация ДНК (в %): 1 - 0,001,2 - 0,002,3 - 0,003, 4 - 0,004, 5 - 0,005.
Например, обратное движение частиц, образованных при взаимодействии ДНК с мицеллами, наблюдалось при использовании метода электрофореза с ростом концентрации конденсирующего агента [18].
Проведенный эксперимент показал, что в исследуемом случае (в 0,005 М NaCl) формирующиеся комплексы ДНК с лантаном (до С^ = Ю-5 М) обратимы при изменении концентрации лантана в сторону уменьшения, но необратимы при увеличении Си до значительных концентраций. В таблице представлены результаты, полученные при регистрации оптической плотности растворов ДНК, содержащих разные концентрации лантана. При этом базовый раствор, соответствующий ДНК в конденсированном состоянии (что фиксировали по резкому падению относительной вязкости раствора), показывал небольшое изменение оптической плотности за счет рассеяния на 310 нм вне спектра поглощения ДНК. Этот раствор разбавляли с помощью различных концентраций лантана. Концентрация С^ > 5-Ю"5 М приводит к выпадению ДНК в осадок, наблюдаемому визуально. Еще большее повышение концентрации лантана не ведет к перерастворению ДНК, как, впрочем, и добавление большой концентрации лантана сразу к ДНК в малой ионной силе (0,005 М NaCl). В обоих случаях благодаря добавлению большей концентрации лантана ДНК выпадает в осадок. Этот результат представляется вполне разумным. Действительно, лантан вызывает выпадение ДНК в осадок из-за экранировки ее заряда, что приводит к подавлению отталкивания между ионогенными группами полимера и уменьшению количества полярных групп. Таким образом, помимо уменьшения дальних электростатических взаимодействий, обеспечивающих полиэлектролитное набухание клубка, одновременно меняется и сама молекула, так что вода становится для нее все худшим растворителем. Вряд ли стоит ожидать, что при увеличении концентрации лантана в растворе взаимодействие ДНК-вода улучшится. Для «перезарядки»
X, нм
Рис. 4. Спектры КД ДНК в 0, 005 М NaCl. а - в присутствии ПАА, концентрации ПАА (в М): 1 - 0, 2 - 510~7, 3 - 10-6, 4 - 2'10~6, 5 - 510-6, 6 - 10"5, 7 - 2-Ю"5, 8 - 540-5, 9 - ЮЛ б - свободной ДНК (1), ДНК в комплексе с ПАА после компактизации при N:P = 1 (2), комплекс 2 после разбавления до N:P = 0,25 (5) и контрольный раствор, содержащий комплексы при
N:P - 0,25 (4).
Результаты исследования возможности перерастворения ДНК при больших концентрациях лантана (базовый раствор (ДНК + Ьа) в 0,005 М ШС1, Си = ЗЮ"5М, Стк = 0,004%)
Оптическая плотность раствора,
£днк> 0/° Си> м Способ получения раствора D
X = 260 нм X = 310 нм
0,001 0 Контроль 0,217 0,003
0,001 3-Ю"5 Приготовлен сразу 0,250 0,034
0,001 3-Ю"5 Из базового, добавлена та же концентрация La 0,236 0,025
0,001 5-Ю"6 Контроль (приготовлен сразу) 0,200 0,004
0,001 5-Ю-6 Из базового, добавлен 0,005 М NaCl 0,192 0,005
0,001 1,6 Из базового, добавлен 2,1 М LaCl3 0,490 0,160
0,001 1,6 Приготовлен сразу 0,491 0,146
же ДНК, о которой упоминают некоторые авторы, необходима дополнительная сила, которая обеспечила бы притяжение ионов лантана к «заэкранированной» молекуле ДНК.
Следовательно, взаимодействие лантана с ДНК приводит к образованию компактных структур. Компактизация обратима, если не наблюдается еще выпадение ДНК в осадок (или не происходит нарушение вторичной структуры макромолекулы). При образовании осадка добавление лантана в раствор не вызывает перерастворение комплексов.
Интересно сопоставить процесс конденсации ДНК, индуцированный точечными трехвалентными ионами и поликатионами. В работе [11] была подробно изучена компактизация ДНК при образовании генных векторов. При этом использовали синтетические полимеры различной структуры и состава. Остановимся на комплексах ДНК с ПАА. При компактизации ДНК, вызванной ее взаимодействием с ПАА, также фиксировалось уменьшение вязкости и увеличение оптической плотности растворов [11]. Кроме того, компактизация сопровождается изменением спектров КД ДНК (рис. 4, а). Как видно из рис. 4, б, на котором приведена проверка обратимости комплексообразования ДНК с ПАА, разбавление растворов после компактизации ДНК до меньших концентраций ПАА приводит к полному совпадению ее спектра КД со спектром контрольного раствора, приготовленного независимо с теми же значениями Сднк и СПАА. При этом спектральные характеристики макромолекулы восстанавливаются полностью. Так как спектры КД характеризуют состояние вторичной структуры ДНК, можно утверждать, что компактизация обратима, а вторичная структура макромолекулы полностью сохраняется. Аналогичный результат был получен и при изучении комплексов ДНК с лантаном методом КД. Эксперимент показал, что добавление больших концентраций ПАА к конденсированной ДНК не приводит к перерастворению комплексов после их высаживания из раствора. Таким образом, проведенные исследования показали, что конденсация ДНК обратима, при этом в комплексе сохраняется неизменная вторичная структура ДНК. Перерастворение же ДНК невозможно при добавлении избытка конденсирующего агента к конденсированной форме ДНК.
Авторы благодарят канд. хим. наук О. В. Назарову за предоставленный образец
ПАА.
Summary
Kasyanenko N. A., Smorygo V. V. DNA packaging in solution induced by binding with polycations and small multivalent ions.
DNA condensation in solution induced by polyallylamine and lantanum ions is investigated. The possibility of re-dilution and re-charging of complexes in excess of condensing agents in solution is regarded.
Литература
1. Фрисман Э. В., Касьяненко Н. А. // Молекулярная биология. 1990. Т. 24. С. 318-327. 2. Касьяненко Н. А. // Журн. структ. химии. 2006. Т. 47. С. 163-169. 3. Bloomfield V. А. // Curr. Opin. Struct. Biol. 1996. Vol. 6. P. 334-341. 4. Kasyanenko N., ZaninaA., Nazarova O., Panarin E. // Langmuir. 1999. Vol. 15. P. 7912-7917. 5. Kasyanenko N., Arikainen N., Frisman E. 11 Biophys. Chemistry. 1998. Vol. 70. P. 93-100. 6. Widom J., Baldwin R. L. // Biopolymers. 1983. Vol. 22. P. 1595-1620. 7. Widom J., Baldwin R. L. // J. Mol. Biology. 1980. Vol. 144. P. 431- 453. 8. Lerman L. S. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1971. Vol. 68. P. 1886-1890. 9. Касьяненко H. А., Копышев A. M., Назарова О. В., Панарин Е. Ф. //Журн. физ. химии. 2002. Т. 76. С. 2036-2042. 10. Hansma Н. G., Golan R., Wan Hsieh et al. // Nucl. Acids Research. 1998. Vol. 26. P. 2481-2487. 11. Slita A. V., Kasyanenko N. A., Nazarova О. V. et al. // J. of Biotechnology. 2007. Vol. 127. P. 679-693.12. RaspaudE., Olvera de la CruzM., SikoravJ.-L., Livolant F. II Biophys. J. 1998. Vol. 74. P. 381-393. 13. Jary D., Sikorav J. L. Ц Biochemistry. 1999. Vol. 38. P. 3223-3227.14. Brewer L. R., CerzettM., Balhorn R. // Science. 1999. Vol. 286. P. 120-123.15. Pelt a J., Livolant F., Sikorav J. L. // J. Biol. Chemistry. 1996. Vol. 271. P. 5656-5662.16. Nguen Т. Т., Shklovskii В. 1.11 Phys. Rev. Lett. 2002. Vol. 89. P. 1-4. 17. Thurmond К .В., Remsen E. E., Kowalewski Т., Wooley K. L. // Nucl. Acids Research. 1999. Vol. 27. P. 2966-2971.18. Frisman E. V., Schagina L. V., Vorobiev V. I. // Biorheology. 1965. Vol. 2. P. 189-194.
Статья принята к печати 23 ноября 2006 г.
