CC BY
62
8. Chrank D., Gruner J. Dermatitis digitalis (Foot-rot) beim Rind. / Mh. Vet. Med. — 1989, — № 44. — S. 104—106.
9. Döpfer D., A. Koopmans, F.A. Meijer, I. Szakall, Y.H. Schukken, W. Klee, R.B. Bosma, J.L. Cornelisse, A.J.A.M. Van Asten u. A.A.H.M. Ter Huurne. Histological and bacteriological evaluation of digital dermatitis in cattle, with special reference to spirochaetes and Campylobacter faecalis. / Vet. Rec. — 1997, — V. 140, — P. 620—623.
10. Döpfer D., Willemen M. Standardisation of infectious claw diseases (Workshop report). / Proc. 10th International Symposium on Lameness in Ruminants. Lucerne, Switzerland. 1998, — P. 244—264.
11. Evans Nicholas J., Jennifer M. Brown, Ibrahim Demirkan, Richard Birtles, Anthony Hart C., Stuart D. Carter In vitro susceptibility of bovine digital dermatitis associated spirochaetes to antimicrobial agents. / Veterinary Microbiology. — 2009, — V. 136. — P. 115—120.
12. Holzhauer M., Hardenberg C., Bartels C.J.M., Frankena K. Herd- and Cow-Level Prevalence of Digital Dermatitis in The Netherlands and Associated Risk Factors. / American Dairy Science Association. J. Dairy Sci. — 2006, — V. 89, — P. 580—588.
13. Read D.H., Walker R.L. Papillomatous digital dermatitis and associated lesions of dairy cattle in California: pathologic findings. / Proc. 8th International Symposium on Disorders of the Ruminant Digit. Banff, Canada. 1994, — P. 156—158.
СЕКЦИЯ 5. ХИМИЯ
5.1. БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
КОМПЛЕКСНОЕ ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ JUNIPERUS SABINA L. ИЗ КАЗАХСТАНА
Сулеймен Ерлан Мэлсулы
канд. хим. наук, PhD, директор института прикладной химии, доцент кафедры химии ЕНУ им. Л.Н. Гумилева,
г. Астана, Казахстан
Е-mail: syerlan 75@yandex. kz
Ишмуратова Маргарита Юлаевна
канд. биол. наук, доцент кафедры фармацевтических дисциплин Карагандинского университета «Болашак», г. Караганда, Казахстан Е-mail: [email protected]
Искакова Жанар Бактыбаевна
канд. хим. наук, старший научный сотрудник института прикладной химии, доцент кафедры Казахского университета технологии и бизнесса,
г. Астана, Казахстан Е-mail: zhanariskakova@mail ru
COMPREHENSIVE PHYTOCHEMICAL STUDY OF JUNIPERUS SABINA L. FROM KAZAKHSTAN
Suleimen Yerlan Melsuly
candidate of Chem. Science, PhD, Director of the Institute of Applied Chemistry ENU, Associate Professor of Chemistry Department
of L.N. Gumilev ENU, Astana, Kazakhstan
Ishmuratova Margarita Yulaevna
candidate of biol. Sciences, assistant Professor of Pharmaceutical Sciences
Karaganda University "Bolashak", Karaganda, Kazakhstan
Искакова Жанар Бактыбаевна
candidate of Chem. Science, Senior Researcher of the Institute of Applied Chemistry ENU, Associate Professor of Kazakh University
of Technology and Business, Astana, Kazakhstan
Работа выполнена по гранту МОН РК по бюджетным программам 055 «Фундаментальные и прикладные научные исследования» по теме «Фитохимическое изучение растений Казахстана и Сибири. Создание модифицированных производных на основе моно- и сесквитерпеноидов, флаваноидов и их биоскрининг» и «Создание образцов продукции под брендом «Ароматы степей Казахстана». Авторы благодарят Ш. Хан, Б. Теквани и М. Джакоб (университет Миссиссипи, США) за помощь в исследовании биоактивности (грант USDA Agricultural Research Service Specific Cooperative Agreement).
АННОТАЦИЯ
Проведено изучение антигрибковой, антимикробной, антилейш-маниозной, антималярийной и цитотоксической активности эфирного масла Juniperus Sabina L., определен микроэлементный состав растительного сырья и изучено анатомическое строение.
ABSTRACT
The study of antifungal, antimicrobial, antileyshmanial, antimalarial and cytotoxic activity of essential oils Juniperus sabina L., definition of microelement composition and anatomy structure of plant material was done.
Ключевые слова: антигрибковая; антимикробная; антилейш-маниозная; антималярийная и цитотоксическая активность; эфирное масло; микроэлементный состав; анатомическое строение; Juniperus sabina L.
Keywords: antifungal; antimicrobial; antileyshmanial; antimalarial and cytotoxic activity; essential oils; microelement composition; anatomy;
Juniperus sabina L.
Juniperus Sabina L. (можжевельник казацкий) — двудомный стелющийся кустарник высотой 1—1,5 м. Быстро разрастается в ширину и образует плотные заросли. Распространен на Кавказе, Урале, Сибири, Приморье, Южной и Центральной Европе. Произрастает в Центральном и Северном Казахстане в гористой местности [7].
Ранее был изучен состав эфирного масла [8—9], в том числе и нами масло из Казахстана [17].
Экстракт J. sabina обладает противоопухолевым эффектом, превосходящим противоопухолевую активность экстракта тисового дерева Taxus baccata [15].
Эфирное масло J. sabina обладает выраженным абортивным эффектом [11, 13—14], антимикробной [9] и антиоксидантной активностью [10, 12].
В связи с тем, что эфирное масло данного растения представляет интерес с точки зрения его биоактивности мы провели изучение его антигрибковой, антимикробной, антилейшманиозной, антималярийной и цитотоксической активности.
Сырье J. sabina собирали в июне 2011 г. в Павлодарской области с. Баянаул (лагерь «Кристалл») Республики Казахстан. Эфирное масло получали методом гидродистилляции на аппарате Клевенджера в течение 2-х часов [2]. Выход масла составил 1,5—1,9 %.
На антимикробную активность проверяли образцы эфирных масел, их способность ингибировать рост из 5 бактерий и 5 грибков, патогенных для человека.
Вначале испытывали в первичном скрининге на 50 мкг/мл дважды и процент ингибирования роста (% инг.) рассчитывался по отношению к отрицательному и положительному контролю. Эфирные масла показывающие > 50% ингибирования направляли на вторичный скрининг.
Во вторичном скпининге образцы растворяли в 20 мг/мл и проверяли при 50, 10 и 2 мкг/мл и IC50s против всех 10 штаммов микроорганизмов. Образцы растворяли в 2 mg/mL и проводили
испытания на 20, 4, 0,8 мкг/мл и IC50s против всех 10 штаммов микроорганизмов. Чистые соединения, которые имеют IC50 < 7 мкг/мл на вторичном скрининге направляли на третичный скрининг.
В третичном скрининге чистые соединения проверены против всех 10 микробов в 20, 10, 5,0, ... 0,02 мкг/мл и рассчитывали IC50S. В дополнение к IC50 проводили расчет MIC (минимальная ингибирующая концентрация), и либо MFC или МБК (минимальная фунгицидная или бактерицидная концентрация, соответственно). MIC является самой низкой тест концентрацией (в мкг/мл), который подавляет в организме 100 %. MFC или MBC является самой низкой тест-концентрацией (в мкг/мл), которая убивает организм. Чистые соединения могут иметь MIC, при которой клетки могут быть еще живы, но без роста. MFC и MBC является показателем способности образца уничтожать испытуемый образец.
В качестве контроля как противогрибкового препарата использовали амфотерицин В и как антибактериальный препарат — ципрофлоксацин.
Как видно из таблицы 1, эфирное масло J. sabina оказывает слабовыраженную активность лишь в отношении штаммов Candida neoformans.
Таблица 1.
Антигрибковая и антимикробная активность эфирного масла J. sabina L.
%Ингибирования
Образец C. albicans C. glabrata '53 J C. A. fumigatus C. neoformans S. aureus MRS E. coli M. intracellular P. aeruginosa Концентрация (мкг/мл)
Амфотерицин B 95 100 100 99 100 ND ND ND ND ND 5
Ципро флоксацин ND ND ND ND ND 74 76 100 66 100 1
Эфирное масло J. sabina 3 0 0 8 36 1 0 0 10 7 50
Полученные данные не согласуются с литературными [9]: согласно ним минимальная ингибирующая концентрация для штаммов C. albicans, S. aureus и E. coli составила 3,125 и против штамма
S. aureus — 6,25 мг/мл, что связано, видимо, с различием в составе эфирного масла.
Антилейшманиозную активность образцов определяли по способности ингибировать Leishmania donovani, простейшего мухи, которое вызывает висцеральный лейшманиоз.
Первичный скрининг.
Экстракты изначально тестировали Leishmania donovani в первичном скрининге дважды при 80 мкг/мл, и процент ингиби-рования (% инг.) рассчитывали по отношению к отрицательному и положительному контролю. Извлечение, показывающее > 50 % ингибирования, изучали на вторичном скрининге.
Вторичный скрининг. Все образцы тестировали при 40, 8,0 и 1,6 мкг/мл и IC5oS а также IC90S (тест концентрациях, что дает 50 и 90 % ингибирования относительно простейших с контрольной группой, соответственно). Образцы, которые имели IC50 <1,6 мкг/мл на вторичном скрининге антилейшманиозной активности, передавали на третичный анализ. Все IC50S и IC90S рассчитывали с использованием программного обеспечения XLfit.
Третичный скрининг. Образцы повторно тестировали на 40, 8, 1,6, 0,32, 0,064, 0,0128 мкг/мл и IC50S и IC90S пересчитывали снова. Все IC50S и IC90S рассчитывали с использованием программного обеспечения XLfit.
В результате испытаний установлено, что эфирное масло J. sabina в отношении L. donovanii в исследуемых дозировках не обладает антилейшманиозной активностью.
Таблица 2.
Антилейшманиозная активность эфирного масла J. sabina L. (первичный скрининг)
Образец Концентрация (мкг/мл) % ингибирования L. donovanii
Эфирное масло J. sabina 80 98
Контрольный препарат % ингибирования IC50 (ug/мл)* IC90 (ug/мл)**
Амфортерицин B 99 0,18 0,32
Пентамидин NT 1,50 2,27
*Концентрация (mg/мл) приводящая к 50 % ингибированию роста ** Концентрация (mg/мл) приводящая к 90 % ингибированию роста
Антилейшманиозная активность эфирного масла J. sabina L. (вторичный скрининг)
Образец Концентрация (мкг/мл) IC50 (ug/мл) IC90 (ug/мл)
Эфирное масло J. sabina 40, 8, 1.6 16,58 >40
Амфортерицин B 0,18 0,32
Пентамидин 1,50 2,27
Изучение антималярийной активности проводили по методике описанной нами в [12].
Как видно из таблицы 4, эфирное масло J. sabina оказывает слабовыраженную активность в отношении Plasmodium falciparum D6.
Таблица 4.
Антималярийная активность эфирного масла J. sabina L.
Образец P. falciparum D6 % Inh.
Хлорохин 97
Эфирное масло J. sabina 48
Изучение цитотоксической активности проводили по методике описанной нами в [16].
На основании проведенного эксперимента можно предположить, что эфирное масло J. sabina во всех испытанных концентрациях проявляют острую летальную токсичность — все личинки погибают (таблицы 5—7), что согласуется с литературными данными [15].
Таблица 5.
Цитотоксическая активность эфирного масла J.sabina 10 мг/мл
Параллель К-во личинок в контроле К-во личинок в образце % выживших личинок в контроле % выживших личинок в образце Смертность, А,% Наличие нейроток- сичности, %
выж. погиб. выж погиб. пар.
1 20 2 0 21 0 95 0 95 0
2 21 1 0 20 0
3 22 0 0 22 0
Ср 21 1 0 21 0
Цитотоксическая активность эфирного масла J. sabina 5 мг/мл
Параллель К-во личинок в контроле К-во личинок в образце % выживших личинок в контроле % выживших личинок в образце Смертность, А,% Наличие нейроток- сичности, %
выж. погиб. выж погиб. пар.
1 20 2 0 25 0 95 0 95 0
2 21 1 0 21 0
3 22 0 0 28 0
Ср 21 1 0 25 0
Таблица 7.
Цитотоксическая активность эфирного масла J. sabina 1 мг/мл
Параллель К-во личинок в контроле К-во личинок в образце % выживших личинок в контроле % выживших личинок в образце Смертность, А,% Наличие нейроток- сичности, %
выж. погиб. выж погиб. пар.
1 20 2 0 20 0 95 0 95 0
2 21 1 0 24 0
3 22 0 0 21 0
Ср 21 1 0 22 0
Для получения данных по доброкачественности растительного сырья было проведено изучение его микроэлементного состава. Сырье J. sabina собирали в июне 2011 г. в Павлодарской области с. Баянаул (лагерь «Кристалл») Республики Казахстан.
Проведено сухое озоление сырья J. sabina. Содержание микроэлементов определяли методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой на приборе ICP-AES и в результате которого получены количественные данные о 43 обнаруженных элементах.
Элементный состав золы J. sabina L.
№ Элемент Символы Содержание (мг/кг) № Элемент Символы Содержание (мг/кг)
1 Гафний Hf 9,57 23 Олово Sn <0,1
2 Индий In <0,01 24 Ванадий V 99,56
3 Уран U <0,01 25 Церий Се 71,72
4 Тантал Та <0,01 26 Литий Li 12,00
5 Галлий Ga <0,01 27 Лантан La 1,31
6 Скандий Sc <0,01 28 Кадмий Cd 5,69
7 Фосфор Р 10495,63 29 Медь Cu 426,48
8 Сурьма Sb <0,1 30 Иттербий Yb 0,97
9 Марганец Mn 1246,36 31 Иттрий Y 5,83
10 Свинец Pb 73,57 32 Цинк Zn 303,16
11 Титан Ti 374,44 33 Серебро Ag <0,1
12 Цирконий Zr 62,88 34 Кобальт Co 10,33
13 Мышьяк As <0,1 35 Стронций Sr 958,70
14 Вольфрам W <0,1 36 Золото Au <100
15 Хром Cr 52,77 37 Таллий Tl <0,1
16 Никель Ni 42,03 38 Железо Fe 2664,72
17 Германий Ge <0,01 39 Платина Pt <10
18 Висмут Bi <0,1 40 Торий Th <0,1
19 Барий Ba 2084,06 41 Теллур Те <0,1
20 Бериллий Be 0,97 42 Бор В 143,88
21 Ниобий Nb 27,27 43 Алюминий Al 11239,07
22 Молибден Mo 6,05
Для стандартизации и выявления строения на микроуровнях ценного растительного сырья (уточнения локализации эфирного масла в надземных органах) J. sabina, мы провели изучение его анатомического строения.
Материалы и методы. Заготовку сырья J. sabina проводили в 2—3 декадах августа в фазе плодоношения в горах Улытау (Улытауский район, Карагандинская область, Республика Казахстан).
Исследовались листья (хвоя) J. sabina. Воздушно-сухое сырье размачивали в горячей воде и размягчали в смеси глицерин-спирт-вода дистиллированная в соотношении 1:1:1 [3, 6], кипятили в 5 %-ном водном растворе гидроксида калия. Изготавливали поверхностные препараты и срезы вручную. Рисунки выполняли при помощи аппарата РА-4М. При описании анатомического строения использовали принципы, изложенные в трудах В.Н. Вехова, Л.И. Лотовой [1, 5].
Анатомическое строение. На поперечном срезе лист имеет овальное строение. Клетки эпидермиса состоят из 1 слоя клеток. Эпидерма покрыта толстым слоем кутикулы. Клетки эпидермы в сечении почти квадратной формы. Все стенки сильно утолщены, в углах имеются поровые каналы. Полость клетки округлая. В углублениях на уровне гиподермы расположены устьица, под которыми имеется большая воздушная полость. У старых листьев стенки клеток эпидермы одревесневают.
Под эпидермой находится мезофилл, состоящий из однородных клеток, стенки которых образуют складчатую структуру. Это значительно увеличивает площадь прилегающего к стенке слоя цитоплазмы с хлоропластами, а, следовательно, и ассимилирующую поверхность. В каждой клетке видно ядро.
Смоляные ходы, пронизывающие складчатую паренхиму, внутри выстланы тонкостенными клетками, выделяющими внутрь смолу, а снаружи имеют обкладку из толстостенных клеток.
На радиальных стенках клеток эндодермы имеются одревесневающие утолщения — пояски Каспари.
Проводящие пучки коллатерального типа. Ксилемная часть обращена к плоской стороне листа, флоэмная — к выпуклой. Следовательно, плоская сторона хвои является морфологически верхней, а выпуклая — нижней. Между проводящими пучками расположена механическая ткань — склеренхима. Остальное пространство центральной части занято толстостенными паренхимными клетками.
Рисунок 1. Поперечный срез листа J. Sabina: 1 — эпидермис, 2 — устьице, 3 — эндодерма, 4 — смоляной ход, 5 — мезофилл, 5 — флоэма, 6 — ксилема
Таким образом, нами проведено изучение антигрибковой, антимикробной, антилейшманиозной, антималярийной и цитотокси-ческой активности эфирного масла J. sabina L., определен микроэлементный состав растительного сырья и изучено анатомическое строение.
Список литературы:
1. Вехов В.Н., Лотова Л.И., Филин В.Р. Практикум по анатомии и морфологии высших растений. М.: МГУ, 1980. — 560 с.
2. Государственная Фармакопея СССР. Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье МЗ СССР. 11-е изд. М., 1990. — 400 с.
3. Долгова А.А., Ладыгина Е.Я. Руководство к практическим занятиям по фармакогнозии. М.: Медицина, 1977. — 255 с.
4. Киханова Ж.С., Искакова Ж.Б., Джалмаханбетова Р.И., Сейлханов Т.М., Ross S.A., Сулеймен Е.М. Компоненты Artemisia austriaca Jacq. И их биологическая активность // Химия природ. соедин. — 2013. — № 5. — P. 826—827.
5. Лотова Л.И. Ботаника: Морфология и анатомия высших растений. М.: КомКнига, 2007. — 512 с.
6. Прозина М.Н. Ботаническая микротехника. М.: Высшая школа, 1960. — 206 с.
7. Флора Казахстана. Т. 7. Алма-Ата: Изд-во АН КазССР, 1964. — 496 с.
8. Adams R.P., Nguyen S., Liu J. Geographic Variation in the Leaf Essential Oils of Juniperus sabina L. and J. sabina var. arenaria (E.H. Wilson) Farjon // Journal of Essential Oil Research. — 2006. — № 18 (5). — P. 497—502.
9. Asili J., Emami S.A., Rahimizadeh M., Fazly-Bazzaz B.S., Hassanzadeh M.K. Chemical and Antimicrobial Studies of Juniperus sabina L. and Juniperus foetidissima Willd. Essential Oils // Journal of Essential Oil Bearing Plants. — 2010. — № 13 (1). — P. 25—36.
10. Doosti F., Bagherpasand N., Zolfagharian F., Sarabandi S., Emami S., Hassanzadeh Khayyat M. Investigation of antioxidant activity of the essential oils of different parts of Juniperus sabina (Cupressaceae) by TBARS method in comparison with vitamin E // Research in Pharmaceutical Sciences. — 2012. — № 7(5). — S. 798.
11. Dweck A.C. Toxicology of essential oils reviewed // Personal Care. 2009. — P. 65—77.
12. Emami S.A., Shahidi N.H., Hassanzadeh-Khayyat M. Antioxidant activity of the essential oils of different parts of Juniperus sabina L. and Juniperus foetidissima Willd. (Cupressaceae) // International Journal of Essential Oil Therapeutics. — 2002. — № 3(4). — P. 363—370.
13. Pages N., Fournier G., Baduel C., Tur N., Rusnac M. Sabinyl Acetate, the Main Component of Juniperus Sabina L. Essential Oil, is Responsible for Antiimplantation Effect // Phytotherapy Research. — 1996. — № 10 (5). — P. 438—440.
14. Pages N., Fournier G., Chamorro G., Salazar M., Paris M., Boudene C. Teratological evaluation of Juniperus sabina essential oil in mice // Planta Med. — 1989. — № 55 (2). — P. 144—146.
15. Shokrzadeh M., Azadbakht M., Ahangar N., Naderi H., Saeedi Saravi S.S. Comparison of the cytotoxic effects of Juniperus sabina and Zataria multiflora extracts with Taxus baccata extract and Cisplatin on normal and cancer cell lines // Pharmacogn Mag. — 2010. — № 6 (22). — P. 102—105.
16. Suleimenov E.M. Components of Peusedanum morisonii and their antimicrobial and cytotoxic activity // Chemistry of Natural Compounds. — 2009. — № 45 (5) — P. 710—711.
17. Suleimenov Ye.M., Atazhanova G.A., Kulyjasov A.T., Ozek T., Demirchi B., Adekenov S.M., Baser K.H.C. Constituents of Juniperus sabina essential oil from Kazakhstan / 4th Internat. Symposium on the chemistry of natural compounds, Isparta, Turkey. 2001. — P. 93.
