CC BY
34
ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ И АНАТОМИЧЕСКОГО СТРОЕНИЯ ARTEMISIA TSCHERNIEVIANA
BESSER ИЗ КАЗАХСТАНА
Сисеталиева Гулсана Галымжанцызы
младший научный сотрудник института прикладной химии, студентка 4 курса специальности химия ЕНУ им. Л.Н. Гумилева, Республика Казахстан, г. Астана
Е-mail: gulok 93 3mail.ru Ишмуратова Маргарита Юлаевна канд. биол. наук, доцент кафедры фармацевтических дисциплин Карагандинского университета «Болашак» Республика Казахстан,
г. Караганды Е-mail: margarita.ishmur@mail.ru Искакова Жанар Бактыбаевна канд. хим. наук, ВНС института прикладной химии ЕНУ им. Л.Н. Гумилева,
Республика Казахстан, г. Астана Е-mail: zhanariskakova@mail.ru Джалмаханбетова Роза Илемисовна д-р хим. наук, ВНС института прикладной химии ЕНУ им. Л.Н. Гумилева,
Республика Казахстан, г. Астана Е-mail: rozadichem@mail.ru CYлеймен Ерлан Мэлсулы канд. хим. наук, PhD, ГНС института прикладной химии, доцент кафедры химии ЕНУ им. Л.Н. Гумилева, Республика Казахстан, г. Астана
Е-mail: syerlan75@yandex.kz
STUDY OF BIOLOGICAL ACTIVITY AND ANATOMIC STRUCTURE OF ARTEMISIA TSCHERNIEVIANA BESSER FROM KAZAKSTAN
Sissengaliyeva Gulsana Galymzhankyzy
junior Researcher of the Institute of Applied Chemistry of ENU, 4 th year student of the speciality chemistry of L.N. Gumilev ENU, Republic of Kazakstan, Astana
Ishmuratova Margarita Yulaevna candidate of Biol. Sciences, assistant Professor of Pharmaceutical Sciences Karaganda University "Bolashak", Republic of Kazakstan, Karagandy
Iskakova Zhanar Baktybaevna candidate of Chem. Science, Leading Researcher of the Institute of Applied
Chemistry of ENU, Republic of Kazakstan, Astana Jalmakhanbetova Roza Ilemisovna doctor of Chem. Science, Leading Researcher of the Institute of Applied Chemistry of
ENU, Republic of Kazakstan, Astana Suleimen Yerlan Melsuly candidate of Chem. Science, PhD, Chief Researcher of the Institute of Applied Chemistry of ENU, Associate Professor of Chemistry Department of L.N. Gumilev
ENU, Republic of Kazakstan, Astana
Благодарность
Работа выполнена по грантам МОН РК по бюджетным программам 055 «Фундаментальные и прикладные научные исследования» по теме «Фитохимическое изучение растений Казахстана и Сибири. Создание модифицированных производных на основе моно- и сесквитерпеноидов, флаваноидов и их биоскрининг» и «Создание образцов продукции под брендом «Ароматы степей Казахстана».
АННОТАЦИЯ
Проведено изучение антирадикальной и цитотоксической активности наработанных экстрактов и эфирного масла Artemisia tschernieviana Besser, изучено анатомическое строение растения.
ABSTRACT
The studies of antiradical and cytotoxic activities of extracts and essential oil of Artemisia tschernieviana Besser, anatomy structure of plant were done.
Ключевые слова: антирадикальная активность; цитотоксическая активность; DPPH; BHA; анатомическое строение; эфирное масло; хлороформный экстракт; этилацетатный экстракт; этанольный экстракт; хлороформно-этанольный экстракт; Artemisia tschernieviana Besser.
Keywords: antiradical activity; cytotoxic activity; DPPH; BHA; anatomical structure; essential oil; chloroform extract; ethyl acetate extract; ethanol extract; chloroform-ethanol extract; Artemisia tschernieviana Besser.
Artemisia L. — это род семейства Asteraceae Dumort, насчитывающий более 400 видов. Artemisia tschernieviana Besser (полынь Черняева) — полукустарничек, 50—100 см высотой; с длинными веточками, почти от основания ветвящимися. Листья черешковые, в очертании продолговато-яйцевидные, 2—6 см длиной и до 3 см шириной, гладкие, дважды перисто рассеченные. Цветочные корзинки широко-яйцевидные, до 4 мм шириной,
немногочисленные, сидят на коротких ножках. Растет в пустынной зоне, на песках. Встречается в Прикаспии, Бузачи, на Мангышлаке. Общее распространение: Кавказ. Эндем Прикаспийского региона [5].
Ранее была изучена антиоксидантная и антигемолитическая активность полыни из Ирана [9], с помощью метода гидродистилляции получено эфирное масло, изучена его антимикробная активность и определены его основные компоненты [8, 12], получено эфирное масло с помощью микроволнового метода выделения "Solvent free" и определены его основные компоненты [6].
Нами проведено изучение антирадикальной и цитотоксической активности экстрактов и эфирного масла A. tschernieviana, а также проведено исследование анатомического строение данного эфиромасличного сырья.
Надземную часть сырья A. tschernieviana (листья и стебли) собирали в фазе бутонизации на берегу Каспийского моря 22—23 июля 2013 г. в Мангыстауской области, окр. г. Актау), высушивали и измельчали.
Для изучения антирадикальной активности получили несколько экстрактов A. tschernieviana Besser: хлороформный (Atsch-1), этилацетатный (Atsch-2), этанольный (Atsch-3). Экстракты получали следующим образом: на аппарате Сосклет измельченную надземную часть A. tschernieviana экстрагировали этилацетатом, хлороформом, со смесью хлороформа — этанола (соотношение 1:1) (Atsch-5) и этанолом. Затем полученные экстракты упаривали на роторном испарителе.
Эфирное масло (Atsch-4) получено методом гидродистилляции на аппарате Клевенджера.
Метод исследования. Для определения ингибирования 2,2-дифенил-1-пикрилгидразилрадикала (DPPH) к 0,1 мл спиртового раствора исследуемых растворов в диапазоне концентраций 0,1; 0,25; 0,5; 0,75 и 1,0 мг/мл добавляли 3 мл 6*10-5 М раствора радикала. Пробирки находились в штативе, завернутого в черный полиэтилен. После интенсивного перемешивания растворы оставались в темноте на 30 минут, далее измеряли оптические плотности при 520 нм.
Значения величины антирадикальной активности (АРА) исследуемых объектов определяли по формуле:
АРА (%) = Ao - At / Ao *100,
где: A0 — оптическая плотность контрольного образца; At — оптическая плотность рабочего образца.
Оптическую плотность исследуемых растворов зависимую от концентрации измеряли на спектрофотометре Cary 60 при длине волны 520 нм, оптические плотности представлены в таблице 1. Антирадикальную активность экстрактов и эфирного масла мы сравнивали с бутилгидроксианизолом (BHA) [11].
Таблица 1.
Изменение оптической плотности растворов в зависимости от __концентрации_
№ Образцы Величина оптической плотности при концентрации (мг/мл)
0,1 0,25 0,5 0,75 1,0
1 BHA 0,1278 0,1240 0,1260 0,1250 0,1240
2 Atsch-1 0,2479 0,2554 0,2373 0,2359 0,2558
3 Atsch-2 0,3745 0,2670 0,2726 0,3296 0,432
4 Atsch-3 0,3216 0,1395 0,1409 0,1521 0,1606
5 Atsch-4 0,8819 0,8951 0,8869 0,8847 0,9116
Значения антирадикальной активности экстрактов и эфирного масла, рассчитанные по формуле, приведены в таблице 2.
Таблица 2.
Антирадикальная активность (АРА %) веществ при разных _концентрациях рабочих растворов_
№ Исследуемые вещества Концентрация веществ (мг/мл)
0,1 0,25 0,5 0,75 1,0
1 BHA 80 80,7 80,3 80,5 80,7
2 Atsch-1 30,5 28,42 33,49 33,88 28,30
3 Atsch-2 30,79 50,64 49,62 39,09 21,83
4 Atsch-3 49,92 78,27 78,05 76,31 74,99
5 Atsch-4 8,75 7,38 8,24 8,46 5,68
На основании проведенного эксперимента можно предположить, что эфирное масло растения А. tschernieviana Besser (Atsch-4) проявляет низкую антирадикальную активность во всех концентрациях. Среди экстрактов этого растения, АРА хлороформного экстракта (Atsch-1) составляет около 30 %, этилацетатный экстракт (Atsch-2) в концентрациях 0,25 и 0,5 мг/мл показал среднюю АРА, но в концентрации 1 мг/мл проявил низкую активность. Антирадикальная активность этанольного экстракта (Atsch-3) растения А. tschernieviana Besser при концентрации 0,1 мг/мл была равна 49,92 %, а в остальных случаях показал высокую активность приближенной АРА к веществу ВНА (рисунок 1).
Таким образом, исследуя антирадикальную активность эфирного масла и экстрактов Artemisia tschernieviana Besser установлено, что наименьшую АРА имеет эфирное масло, а наиболее высокий показатель проявляет этанольный экстракт. Дальнейшее исследование экстрактов в будущем, может привести к нахождению новых лечебных свойств A. tschernieviana Besser.
Рисунок 1. Динамика антирадикальной активности при изменении
концентрации веществ
Также нами изучена цитотоксическая активность экстрактов и эфирного масла растения A. tschernieviana Besser.
Метод определения цитотоксической активности [7, 10]. Делительную воронку на 55 мл заполняли искусственной морской водой и добавляли 200 мг яиц Artemia salina. Выдерживали в течение 3-х дней при мягкой подаче воздуха пока рачки не вывелись из яиц. Одну сторону трубы покрывали алюминиевой фольгой, и 5 мин спустя, личинок, которые собирались на яркой стороне делительной воронки, вынимали пипеткой Пастера.
20—40 личинок помещали в 990 мл морской воды в каждой из 24 микроплошек. Подсчитывали мертвых личинок под микроскопом. Добавляли по 10 мл раствора диметилсульфоксида на 10 мг/мл образца. В качестве препарата сравнения использовали актиномицин Д или стауроспорин. Для отрицательного контроля добавляли только 10 мл диметилсульфоксида. После 24 ч инкубации и дальнейшем выдерживании микроплошки в течение 24 ч (для обеспечения неподвижности) посчитывали мертвые личинки под микроскопом. Образцы с высокой цитотоксической эффективностью (менее 5 % выживших личинок) проверяли снова с концентрациями 50, 10, 5 и 1 мг/мл.
Смертность P определяли по следующей формуле:
A - N - B
P = (.............) х 100
Z
А= количество мертвых личинок после 24 ч; К= количество мертвых личинок до проведения теста; В= среднее количество мертвых личинок в отрицательном контроле; 7= общее количество личинок.
Таблица 3.
Цитотоксическая активность разных экстрактов и эфирного масла
Исследуем ый образец -я, мг/м К-во личинок К-во личинок в образце II15111 их личи в в а К * F 5, о я в s В t- s ■й н 3 2 ' Н В '1I1V нейр отокс ично
в контрле
выж. погиб. выж. погиб. пар.
Atsch-4 10 22 2 0 25 0 92 0 92 0
5 22 2 0 22 0 92 0 92 0
1 22 2 0 23 0 92 0 92 0
Atsch-2 10 21 1 0 17 6 95 0 74 21
5 21 1 0 14 7 95 0 67 28
1 21 1 0 5 6 95 0 24 71
Atsch-1 10 21 1 21 3 0 96 88 8 0
5 21 1 28 1 0 96 96 0 0
1 21 1 24 0 0 96 96 0 0
Atsch-5 10 21 1 18 6 0 96 75 21 0
5 21 1 24 3 0 96 89 7 0
1 21 1 22 1 0 96 96 0 0
Atsch-3 10 21 1 24 2 0 96 92 4 0
5 21 1 23 1 0 96 96 0 0
1 21 1 23 0 0 96 96 0 0
Исследование показало, что эфирное масло A. tschernieviana во всех концентрациях оказывает острую летальную токсичность — все личинки погибают. Этилацетатный экстракт A. tschernieviana в концентрациях 10 и 5 мг/мл проявляет острую летальную токсичность — все личинки погибают, а в концентрации 1 мг/мл гибель личинок составляет — 24 %. Хлороформный, хлороформно-этанольный (1:1), этанольный экстракты A. tschernieviana не показывают цитотоксическую активность.
Анатомическое исследование Artemisia tschernieviana Besser.
Для стандартизации и выявления строения на микроуровнях ценного растительного сырья (уточнения локализации эфирного масла в надземных органах) A. tschernieviana, мы провели изучение его анатомического строения.
При исследовании сухие образцы сырья A. tschernieviana размачивали в горячей воде и размягчали в смеси глицерин-спирт-вода дистиллированная в соотношении 1:1:1 [2, 4], кипятили в 5 %-ном водном растворе гидроксида
калия. Изготавливали поверхностные препараты и срезы вручную. Рисунки выполняли при помощи аппарата РА-4М. При описании анатомического строения использовали принципы, изложенные в трудах В.Н. Вехова, Л.И. Лотовой [1, 3].
Клетки нижнего эпидермиса округлые, верхнего эпидермиса — прозенхимные, с прямыми стенками (рис. 2). Устьица аномоцитного типа (окружены 4 и более клетками эпидермы) и встречаются преимущественно на нижней стороне листа. Листья с обеих сторон негусто опушены мелкими простыми 1-клеточными трихомами. Эфиро-масличные железки округлой формы, сидят в углублениях эпидермиса.
Рисунок 2. Препарат листа А. ^зеЬвг^пхв^хапа с поверхности. Ув. 15х10: А — ни^^нии эпидермис, Б — верхний эпидермис, 1 — основные клетки эпидермы, 2 — устьица, 3 — эфиро-масличные железки, 4 — простые
трихомы
Листочки обвертки цветочной корзинки наружные — узко-эллиптические, внутренние — широко-эллиптические. Внутренние части травянистые, зеленые, наружные — пленчатые (рис. 3). Поверхность пронизана жилками, в верхней части можно отметить эфиро-масличные железки, овальной или округлой формы, приподнимающиеся над поверхностью. Эпидермис травянистой части представлен мелкими клетками изодиаметрической формы; пленчатой части — клетками прозенхимной формы.
А
Б
Рисунок 3. Препарат листочка обвертки А. ^зеЬвг^пхв^^апа с поверхности. Ув. 15х10: А — листочек обвертки, Б — эпидермис пленчатой части, В — эпидермис травянистой части, 1 — эфиро-масличные железки, 2 —
основные клетки эпидермиса
Аналогичное строение имеет и эпидермис стебля А. 1зсЬегтеу1апа (рис. 4).
Рисунок 4. Эпидермис стебля А. 15еЬвгтвУ1апа с поверхности. Ув. 15х10:1 — основные клетки эпидермы, 2 — эфиро-масличные железки
Цветок обоеполый, венчик широко-конический, эпидермис в верхней части покрыт приподнимающимися эфиро-масличными железками (рис. 5). Эпидермис состоит из мелких, изодиаметрических клеток с прямыми стенками.
Рисунок 5. Препарат венчика цветка А. 15сЬвгтвУ1апа с поверхности. Ув.
15х10: А — обоеполый цветок, Б — участок эпидермиса венчика цветка, 1 — основные клетки эпидермиса, 2 — эфиро-масличные железки
Стебель на поперечном срезе округло-многогранный (рис. 6). Периферическая часть покрыта 1-слойным эпидермисом, под ним в углах находятся участки механической ткани — уголковой колленхимы, остальная часть заполнена многослойной хлоренхимой. Проводящую зону окружает кольцо эндодермы. Проводящая система пучкового типа. Пучки крупные, размещены в форме кольца; коллатерального типа (флоэма снаружи, ксилема внутри), открытые (1-слойный камбий между тяжами ксилемы и флоэмы).
Рисунок 6. Схема поперечного среза стебля А. ^5сЬвг^п1в^1апа. Ув. 15х10:1 — эпидермис, 2 — колленхима, 3 — хлоренхима, 4 — флоэма, 5 — камбий, 6 — ксилема, 7 — эндодерма, 8 — сердцевинная паренхима
Таким образом, в качестве характерных признаков надземных органов A. tschernieviana можно указать форма и строение основных клеток эпидермиса, эфиро-масличных железок и простых кроющих одноклеточных трихом.
Список литературы:
1. Вехов В.Н., Лотова Л.И., Филин В.Р. Практикум по анатомии и морфологии высших растений. М.: МГУ, 1980. — 560 с.
2. Долгова А.А., Ладыгина Е.Я. Руководство к практическим занятиям по фармакогнозии. М.: Медицина, 1977. — 255 с.
3. Лотова Л.И. Ботаника: Морфология и анатомия высших растений. М.: КомКнига, 2007. — 512 с
4. Прозина М.Н. Ботаническая микротехника. М.: Высшая школа, 1960. — 206 с.
5. Флора Казахстана. Под ред. Павлова Н.В., Алма-Ата, 1960. — 454 с.
6. Azar P.A., Tehrani M.S., Hosain S.W., Khalilzadeh M.A., Zanousi M.B.P. Solvent-Free Microwave Extraction of Essential oil of Artemisia tschernieviana // Asian Journal of Chemistry. — 2012. — Vol. 24, — Issue 11. — P. 5388.
7. Durackova Z., Betina V., Hornikova B., Nemec P. Zentralbl. Bakteriol//Abt. II.
— 1977. — № 32. — P. 294.
8. Kazemi M., Dakhili M., Rustaiyan A., Larijani K., Ahmadi M.A., Mozaffarian V. Chemical Composition and Antimicrobial Activity of Artemisia tschernieviana Besser from Iran // Pharmacognosy Res. — 2009. — № 1. — P. 120—124.
9. Naqinezhad A., Nabavi S.M., Nabavi S.F., Ebrahimzadeh M.A. Antioxidant and antihemolytic activities of flavonoid rich fractions of Artemisia tschernieviana Besser // European Review for Medical and Pharmacological Sciences. — 2012.
— 16(Suppl 3). — P. 88—94.
10. Reiss J. Zentralbl. Bakteriol//Hyg. I Abt. Orig. — 1972. — № 155. — P. 531.
11. Sawant O., Kadam V.J., Ghosh R. In vitro Free Radical Scavenging and Antioxidant Activity of Adiantum lunulatum // Journal of Herbal Medicine and Toxicology. — 2009. — № 3(2). — P. 39—44.
12. Zanousi M.B.P., Azar P.A. and Raeesi M. Chemical composition and antimicrobial activity of essential oils of different organs of three Artemisia species from Iran // Journal of Medicinal Plants Research. — 2012. — Vol. 6(42). — P. 5489—5494.
