CC BY
6
УДК 615.324:615.37 DOI: 10.21323/2071-2499-2018-3-32-35 Ил. 4. Библ. 14.
КОМПЛЕКСНАЯ ОЦЕНКА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ, ОБЛАДАЮЩИХ ИММУНОТРОПНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
Василевская Е.Р.
ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова
Ключевые слова: иммунодефицит, эритрограмма, тканевая специфичность, антитела, иммуноферментный анализ, компоненты комплемента
Реферат
Представлены основные этапы скрининга биологического иммуномодулятора, полученного из животного сырья, для комплексной оценки его активности методами in vitro и in vivo. Определение тканевой специфичности in vitro показало рост клеток сосудистой стенки (на 16,6%), энтероцитов (на 13,4%), тимоцитов (на 21,9%), гепатоцитов (на 19,2%). Отмечена пролонгация гемолиза эритроцитов на 30 секунд на кислотной эритрограмме, показывающая протективное действие биорегулятора, его мембранотропную активность и биодоступность. Эффективность препарата in vivo была доказана цитометрическими и иммуноферментными исследованиями, установлено увеличение степени дифференцировки и типирования CD3 и CD4 (на 24 % и 40 %), синтеза цитокинов IgG и IgM (на 16% и 10%), Il-2 и Il-6 (до 10%), компонентов комплимента (C1q до 10% и С4 до 13%). Исследуемый иммуномодулятор проявляет провоспалительную активность и влияет на формирование адаптивного иммунного ответа, запуская каскад комплементарных реакций. Предложен алгоритм скрининг-системы иммунорегуляторных веществ животного происхождения.
COMPLEX ASSESSMENT OF BiOLOGiCALLY ACTiVE SUBSTANCES OF ANiMAL ORiGiN, POSSESSiNG iMMUNOTROPiC ACTiViTY
Vasilevskaya E.R.
Gorbatov Research Center for Food Systems
Key words: immunodeficiency, erythrogram, tissue specificity, antibodies, enzyme immunoassay, complement components
Summary
The article presents screening main stages of biological immunomodulator obtained from animal raw material for its activity complex evaluation by in vitro and in vivo methods. Tissue specificity determination in vitro showed increase of vascular wall cells (by 16.6%); entero-cytes (by 13.4%), thymocytes (by 21.9%); hepatocytes (by 19.2%). Erythrocytes hemolysis prolongation for 30 seconds on an acidic erythrogram was marked, showing bioregulator protective effect, its membrane activity and bioavailability. In vivo research was demonstrated remedy efficiency by cytometric and immunoenzymatic studies, an increase in CD3 and CD4 differentiation degree and typing (by 24% and 40%); cytokines and antibody synthesis (Il-2 and Il-6 up to 10%, IgG and IgM by 16% and 10%); compliment components (C1q to 10% and C4 to 13 %). Immunomodulator being studied shows pro-inflammatory activity and influences adaptive immune response formation, triggering complementary reactions cascade. Immunoregulatory animal substances screening system algorithm is suggested.
Введение
На сегодняшний день сформировалось представление о продуктах сельскохозяйственного производства, как источнике веществ, обладающих функциональными свойствами. Большое количество публикаций направлено на изучение биологически активных компонентов микробиального, растительного и животного сырья, выделено огромное количество соединений, относящихся к классам полисахаридов, полифенолов, каротино-идов, нуклеаз, нуклеотидов и пептидов.
Наиболее интересным представляется, что аминокислотные последовательности, обнаруженные в животном сырье в значительных количествах, обладают различными эффектами, в том числе антиамнестическими, антитромботи-ческими, антибактериальными, гипо-липидемическими, гипотензивными, опиоидными, иммунотропными и пр. свойствами [1, 2]. В животных белках на настоящий момент идентифицировано более 220 функциональных пептидов, большинство из изученных соединений состоят не более чем из 2-10 аминокислотных остатков. Доказано, что обнаруженные вещества активно участвуют в поддержании структурного и функционального гомеостаза организма и стимулируют синтез различных белков и ре-гуляторных факторов согласно принципу гомологичности [3, 4, 5].
Успешное изучение биоактивных соединений и оценка их эффективности напрямую зависит от грамотного планирования исследования и используемых методов. Современные подходы предполагают использование комплексной панели методов in vitro, ex vivo и in vivo, взаимодополняющих друг друга. Применение биосистем in vitro позволяет изучать клеточные и молекулярные механизмы действия исследуемых агентов на объекты-мишени (клеточные компоненты, рецепторы, специфические ферменты, гены и пр.), что целесообразно ввиду относительной сложности такой оценки в опытах на животных. При этом исследование фармакокинетики, в том числе на межклеточное взаимодействие и регуляторные процессы, невозможно без использования живого организма. Наиболее полное изучение эффектов биоактивных веществ возможно только с использованием экспериментального биомоделирования in vivo, как это, например, описано в работах [6, 7].
Стоит отметить, что одним из наиболее удобных объектов для биотестирования соединений белковой природы являются органотипические культуры тканей, в которых отсутствуют нервные, гуморальные и другие воздействия на клетки. В экспериментах ex vivo установлено тканеспецифическое действие природных и синтетических препаратов на
рост эксплантатов соответствующих тканей как эмбрионов кур, крыс и мышей, так и взрослых животных, в отношении которых необходимо учитывать изменения уровня синтеза белка и компенсаторно-приспособительных механизмов клеток [2, 8].
Таким образом, исследование на эксплантатах тканей крыс позволит определить тканевую специфичность потенциального иммунорегулятора путем оценки степени стимулирующего и ингибирую-щего действия на специализированные клетки различных органов. В качестве дополнительного метода in vitro можно использовать мембраны эритроцита для изучения мембранотропного действия и биодоступности анализируемого объекта [9, 10].
Исследование эффективности потенциального препарата на уровне организма рационально проводить с использованием лабораторных животных с моделью патологии иммунной системы. Изучение иммунотропных свойств регулятора неспецифического иммунитета должно быть основано на анализе функциональной активности иммунных клеток крови, продукции специфических регуляторных белков и пептидов, амплифицирующего ферментативного каскада реакций [11].
Целью работы являлся сравнительный анализ и подбор методов in vitro
и in vivo для создания скрининг-системы иммуноактивных веществ животного происхождения.
Материалы и методы
Объектом исследования являлся высокоэффективный природный имму-норегулятор на основе видо- и ткане-специфичных биомолекул на иммуноком-петентных органах свиньи, разработанный на базе ФГБНУ «ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова» РАН [12].
При исследовании in vitro были использованы следующие методы: изучение тканевой специфичности на эксплантатах тканей крыс [13], оценка мембранотроп-ной активности методом кислотных эри-трограмм [14].
Исследование in vivo проведено на лабораторных крысах (самцах) Wistar (spf), распределенных на группы: 1 - контрольная с некорригируемым иммунодефицитом (ИД); 2 - опытная с коррекцией ИД путем введения препарата; 3 - ин-тактная. Крысам 1 и 2 групп моделировали цитостатик-индуцированный ИД с использованием циклофосфамида на протяжении 13 суток [ссылка на кауфман с моделью]. Внутрижелудочное введение исследуемого образца осуществляли ежедневно на протяжении 26 суток из расчета (20 ± 0,2) г/л белка. Животным 1 группы в эквивалентном объеме вводили дистиллированную воду.
Крысы всех групп на протяжении эксперимента потребляли ad libitum полнорационный комбикорм (Ассортимент-Агро, Россия) и воду для поения, полученную на установке (Merc Millipore, Германия), минерализованную путем добавления минеральных солей (314-382 мг/л).
Продолжительность эксперимента составила 39 суток, по завершении крыс усыпляли в камере для эвтаназии (VETtech, Великобритания). У оглушенных животных отбирали из правого желудочка сердца кровь. Содержание антител CD3+, CD4+, CD3/CD4 определяли на проточном цитофлуориметре Guava easyCyte (MerchMillipore, Франция), содержание иммуноглобулинов M и G, интерлейки-нов 2, 4 и 6 оценивали на анализаторе Immunochem 2100 (НТ1, USA), используя наборы видоспецифичных реактивов ELISA (rat).
Для расчетов использовали программу STATISTICA 10. Результаты представлены в виде «Среднее значение ± Стандартное отклонение» (M ± m). Статистическую достоверность рассчитывали с применением однопараметрического ANOVA теста с применением критерия Дункана, в качестве значимого уровня выбрана вероятность 0,1.
Результаты исследования
Анализ данных, полученных в исследованиях на эксплантатах, выявил что исследуемый объект проявляет биологическую активность в отношении отдельных видов тканей внутренних органов (рисунок 1). Наблюдалась выраженная пролиферация клеток периферической зоны роста эксплантатов интимы аорты (на 16,6%), слизистой оболочки желудка (на 13,4%), тимуса (на 21,9 %), печени (на 19,2 %).
Выявленное в ходе эксперимента ингибирующее действие исследуемого иммунорогулятора на рлетки слизистой доенадцатиперстной кишки (до 1,2%) можно сеязать с недостаточной сменоИ питательной среды, в результате чего происходит накопление метаболитов и уменьжение колечества питательных веществ. Малая степень пролиферации (до 4,7 и до 2,8 % соответственно) клеток селезенки и спинного мозга возможно обусловлена исчерпанием клеточного резерва тканей организма, что обосно-вываетстепено пролиферации, минрации и продоижительности жизни клетоо.
Результаты исследования мембра-нотропной активности исследуемого образца представлены на рисунке 2.
Показане смещдние эритоограммы вправо, что свидетельствует об увеличении кислотности среды и росте резистентности эритроцитарной мембраны (стойкости эритроцитор) на 30 снкунд. Подобная пролонгация гемолиза эритроцитов прн дебавлении в раствор препарата сиидетельствует об увеличении в ре-мени сохранности, степени цеоостности мембран эритроцитов при воздействии агрессивьых факторов и уменьшении цитотоксического дейсевид.
Исследования in vivo на крысах с моделью иммунодефицита показали, что исследуемый препарат способствует восстановлению опытных животных. Анализ фенотипирования лимфоцитов крови крыс показал значительное увеличение содержания клеток CD3 и CD4 - на 24% и 40% для опытной группы относительно контрольной, соотвественно иммунорегуляторный индекс CD3/CD4 уменьшился в среднем более чем на 20°%. Анализ иммуноферментных показателей сыворотки крови (рисунок 3) внявил, рто у животных опытной г руппы достоверно увеличивалось содержание IgG на 10% соответственно, IgM на 16% соответственно, Il-2 и Il-6 в контрольной группе уменьшилось до 21%, н группе 2 возросио до 10% относительно группы контрольной группы. Содержание Il-4 и ЦИК достоверно не изменялось в опытной группе по сравнентю с показателями крыс контрольной и интактной групп. Среди компонентов комплимента у крыс опгнной группы наблюдалось увеличенне КК C1q дт 10% и РК С4 до 13%, уменьшение содержания КК С5 до 6% (p<0,05) и С3 до 4% по сравнению с контрольн оТ группой.
Обсуждение полученных результатов
Полученные в результате проведенного скрининга данные позволили под-вердить натичие иммурорегуляттрных свойств у исследуемого препарата. Так, проявле нная иммуноактивация и значительная реакттвность клеточных и молекулярных коапонентов в ответ на цитотоксическое действие циклофосфа-мида, вызваоная ррименением исследуем ого природного препарата, отобразила
Рисунок 1. Оценка тканевой специфичности на эксплантатах крыс
125,0 120,0 115,0 110,0 105,0 100,0 95,0
<5 90,0
85,0
80,0
а «
о
0
2
3
4
5
6
7
2018 | №3 ВСЕ О МЯСЕ
Рисунок 2. Оценка мембранотропной активности биомолекул методом кислотных эритрограмм
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195 210 225 240 255 270 285 300 315 330 345 360 375 390 405 420
Время, с
Рисунок 3. Результаты иммуноферментного анализа крови лабораторных животных по завершении исследования, %,
относительно интактной группы
т 1 т
г ■Г" г н Г г 1 ц ■■ ■ в и г
||-2, пг/мл ||-4, пг/мл ||-6, пг/мл мкг/мл ^М, нг/мл С^, нг/мл С1С, мкг/мл С3, нг/мл С4, нг/мл С5, нг/мл
■ 1 группа ■ 2 группа
процессы дифференцировки и типирова-ния субпопуляционных взаимодействий и формирования функциоиальной активности Т- клеток, происходящих во время активной фазы приобретенного иммуно-дефицитного состояния. Полипептидные соединения, содержащиеся в смеси экстрактов иммунокомпетентных органов, воздействуют на тимич еские иммон ные клетки, значительно увеличивая их количество, и на систему макрофагов путем
стимуляции выработки Т-хелперов ^4) за счет сокращения иных субкопулкцик (суп рессоров и киолеров). Вырабокка провоспалительных цитокинов позволила сделать предположение о формировании специфического иммунного ответа, что подтверждается акиивациой каскада комплементарных реакций, происходящей по классическому пути, затрмгивая пеавичные компоненты комплимента. Данная гипотеза подтверждается нали-
чием у препарата цитопротективных свокств, кмоявляющихся в уменьшении токсического действия, увеличении мембранной стабильности и стимуляции клеточного роста.
Вывоуы
По результатам проведенных исследо-каниу пеедлагается последовакельность ксновных этапив скрининга биологически активных веществ животного проис-
хождения, обладающих иммунотропной активностью, на базе методов in vitro и in vivo (рисунок 4).
Исследования ex vivo, включающие на первом этапе определение тканевой специфичности на эксплантатах, дают возможность определить степень пролиферации, миграции и продолжительности жизни специализированных клеток. Выявлено, что разработанный препарат достоверно влияет на рост клеток сосудистой стенки (на 16,6%), энтероцитов (на 13,4%), тимоцитов (на 21,9%), гепа-тоцитов (на 19,2%).
Вторым этапом предлагается изучение специфической активности и протектив-ных функций препарата в отношении плазматической мембраны на примере эритроцитов in vitro. Построение кислотных эритрограмм позволяет оценить степень целостности мембран (цитоток-сическое действие) по времени гемолиза эритроцитов. Полученные результаты эксперимента выявили увеличение резистентности эритроцитарной мембраны на 30 секунд относительно контроля, что свидетельствует о биодоступности препарата.
В качестве заключительного третьего этапа предлагается проведение исследования эффективности иммунорегу-лятора in vivo. Основными задачами этапа является получение информации о процессах дифференцировки и типи-рования субпопуляционных взаимодействий и формирования функциональной активности Т-клеток; определении цитокинового профиля для выявления провоспалительной или противовоспалительной активности (11 - 2, 11-6) иммуномодулятора, а также степень воздействия на гуморальный иммунитет (Il-4); комплементарном звене системы иммунитета для оценки степени активации каскада комплементарных реакций. Выявлено, что исследуемый препарат увеличивает содержание CD3 и CD4 (на 24 % и 40 %), IgG и IgM (на 16% и 10%), 11-2 и 11-6 (до 10%), компонентов комплимента (C1q до 10 % и С4 до 13%).
Таким образом, представленный алгоритм изучения природных биоактивных соединений, потенциально обладающих иммунотропной активностью на основании данных аминокислотного, пептидного и протеомного анализа, может служить базой для создания скрининг-системы иммуноактивных веществ животного происхождения.
© КОНТАКТЫ:
Василевская Екатерина Романовна a e.vasilevskaya@fncpc.ru
Рисунок 4. Скрининг-система биологически активных веществ животного происхождения, обладающих иммунотропной активностью
список ЛИТЕРАТУРЫ: REFERENCES:
1. Ahhmed, A.M. A review of meat protein hydrolysates and hypertension / A.M. Ahhmed, M. Muguruma // Meat science. — 2010. — № 86. — Р. 110-118.
2. Lafarga, T. Bioactive peptides from meat muscle and by- products: generation, functionality and application as func-Itional ingredients /T. Lafarga, M. Hayes //Meatscience. — 2014. — № 98. — P. 227-239.
3. Mine, Y. Nutraceutical Science and Technology (Book 4). Nu- traceutical Proteins and Peptides in Health and Disease / Y. Mine, F. Shahidi // USA: Taylor & Francis Group, 20P6. — P. 688.
4. Bauchart, C. Small peptides (<5 kDa) found in ready-to-eat beef meat / C. Bauchart, D. Remond, C. Chambon, P. Pa-tureau Mirand.I. Savary-Auzeloux, C. peyne's, M. Morzel // Meat science. — 2006. — № 74. — P. 6s8-666.
5. Alrefaiel, Z. Leucocytelnfiltration ¡8 Experimental Warm H/paticIschemia Reperfusion; Effent oflschemis Pre and Post Conditioning; Implications of Adhesion Molecules / Z. Alrefaiel, L. Rashed // Life Science Journal. — 2012. — V. 9. — № 3. - P. 2290-2295.
6. Zvereva, E.A. Enzyme immunoassay and proteomic characterization of troponin I as a marker of mammalian muscle co/pounds in raw meat and some meat produces / E.A. Zvereva, L.I. Kovalev, A.V. Ivanov, MP.A. Kovaleva, A.V. Zherdev et al.// MeatScience. — 2015. - № 105. — Р. 46-52.
7. Modanlou, H.D. Ontogeny of VEGF, IGF-I, and GH in Neonatal Rat Serum, Vitreous Fluid, and Retina from Birth to Weaning / H.D. Modanlou, Z. Gharraee, J. Hasan, J. Waltzman, S. Nageotte, K.D.A. Beharry // IOVS. — 2006. — V. 47. — № 2. — P. 738-744.
8. Toldra, F. New insights into meat by-product utilization / F. Toldra, L. Mora, M. Reig // Meat science. — 2016. — № 120. — P. 54-59.
9. Хавинсон, В.Х. Тканеспецифическое действие пептидов в культуре тканей крыс разного возраста / В.Х. Хавинсон, В.В. Малинин, Н.И. Чалисова, Е.И. Григорьев // Успехи геронтологии. — 2002. — Т. 3. — № 9. — С. 248-252.
Havinson, V.H. Tkanespecificheskoe dejstvie peptidov v kul'ture tkanej krys raznogo vozrasta [Tissue-specific effect of peptides in different ages rats tissue culture] / V.H. Havinson, V.V. Malinin, N.I. CHalisova, E.I. Grigor'ev // Uspekhi gerontologii. — 2002. — T. 3. — № 9. — P. 248-252.
10. Udenigwe, C.C. Meat proteome as source of functionaI biopeptides / C.C. Udenigwe, A. Howard // Food Research International - 2013. - N 54. - P. 1021-1032.
11. Кузнецова, Д.П. Новый биорегулятор из поджелудочной железы крупного рогатого скота / Д.П. Кузнецова, Б.Б. Березин, А.П. Ильина и др. // Фундаментальные исследования. — 2015. — № 2-14. — С. 3079-3084.
Kuznecova, D.P. Novyj bioreguIyator iz podzheIudochnoj zheIezy krupnogo rogatogo skota [New bioreguIator derived from cattIe pancreas] / D.P. Kuznecova, B.B. Berezin, A.P. II'ina i dr. // FundamentaI'nye issIedovaniya. - 2015. -N 2-14. - P. 3079-3084.
12. Fedulova, L.V. Influence of Different Polypeptides Fractions Derived from Sus Scrofa Immune Organs on the Rats Immunological Reactivity / L.V. Fedulova, E.R. Vasilevskaya,, E.A. Kotenkova, A.A. Elkina, M.G. Baryshev, et al // Journal of Pharmacy and Nutrition Sciences. — 2017. — V. 7. — № 2. — P. 35-40.
13. Кашинова, Э.Б. Применение in vitro методов для определения тканеспецифичного действия биологически активных веществ, выделенных из тканей Sus Scrofa / Э.Б. Кашинова, А.М. Воробьева, Г.С. Толмачева // Актуальная биотехнология. — 2017. — № 1 (20). — С. 12-16.
Kashinova, Eh.B. Primenenie in vitro metodov dlya opredele-niya tkanespecifichnogo dejstviya biologicheski aktivnyh veshchestv, vydelennyh iz tkanej Sus Scrofa [In vitro methods for determining biologically active substances extracted from Sus Scrofa tissues tissue-specific effect] / Eh.B. Kashinova, A.M. Vorob'eva, G.S. Tolmacheva // Aktual'naya biotekhnologiya. — 2017. — № 1 (20). — P. 12-16.
14. Котенкова, Е.А. Изучение эффективности ткане-специфичных веществ с молекулярной массой менее 30 кДа, выделенных из аорты Sus Scrofa / Е.А. Котенкова, Л.В. Федулова, И.М. Чернуха // Все о мясе. — 2017. — № 2. — С. 40-42.
Kotenkova, E.A. Izuchenie ehffektivnosti tkanespeci-fichnyh veshchestv s molekulyarnoj massoj menee 30 kDa, vydelennyh iz aorty Sus Scrofa [The study of isolated from Sus scrofa aorta tissue-specific substances with a molecular weight less than 30 kDa] / E.A. Koten-kova, L.V. Fedulova, I.M. Tchernukha // Vsyo o myase. — 2017. — № 2. — P. 40-42.
2018 I № 3 ВСЕ O МЯСЕ
