CC BY
98
Р. И. Ижбульдин 1, И. Ю. Понеделькина 2
Комплекс метиленового синего с гепарином в сосудистой хирургии
1 Башкирский государственный медицинский университет 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3; тел.: (347) 272-41-73 2 Институт нефтехимии и катализа Российской академии наук 450075, г. Уфа, пр. Октября, 141; тел.: (347) 231-27-50
Исследован комплекс красителя метиленового синего с антикоагулянтом гепарином. Показана перспективность применения комплекса для ат-ромбогенной обработки эктомированных кровеносных сосудов.
Ключевые слова: метиленовый синий, гепарин, комплекс, сосудистая хирургия, атромбогенная обработка.
Метахроматический фенотиазиновый краситель метиленовый синий (МС), синтезированный Г. Каро в 1876 г., уже в 1882 г. был использован в микроскопической технике Р. Кохом при работе с возбудителем туберкулеза. Сродство МС к нервной ткани, выявленное П. Эрлихом, стимулировало разработку методик прижизненной окраски нервной системы теплокровных животных 1. Антисептические свойства МС помогли ему занять исторически важное место в развитии химиотерапии красителями: МС применяли при лечении гонореи, дизентерии, возвратного тифа, туберкулеза, опухолей, а также для дезинфекции мочевых путей и кишечника. Окислительновосстановительные свойства МС, его способность легко восстанавливаться в лейко-форму до сих пор представляют ценность при лечении цианоза, вызываемого недостатком кислорода или отравлением кровяными ядами 2. При фотодинамическом воздействии МС наблюдается уменьшение вязкости растворов ДНК 3. Этот факт был положен в основу разработок фотохимиотерапевтического лечения различных опухолей с помощью селективно проникающего в биологические ткани МС, интенсивно поглощающего в красной области спектра и генерирующего при этом синглетный килород 4. Отмечена также фотоиндуцирован-ная инактивация под действием МС некоторых вирусов 5, в том числе вируса иммунодефицита человека 6. В последнее время «старый» краситель нашел новое применение в хирургии — появились рекомендации
по применению МС в терапии вазоплегическо-го синдрома 7 и воспалительной реакции после операций на сердце *.
Катионные красители тиазинового ряда (МС, азуры, тионин, толуидиновый синий) прочно связываются с элементами соединительной ткани, особенно с сульфатированны-ми полисахаридами из класса гликозаминогли-канов. Это свойство красителей используется при гистологических исследованиях срезов тканей при выявлении гликозаминогликанов, нуклеиновых кислот и других компонентов живого организма. Хорошо исследованными в этом отношении являются стабильные труднорастворимые комплексы красителей с гепарином (ГЕП). На основе их образования разработаны колориметрические и гравиметрические методы количественного определения ГЕП. По данным работы 9, Кравн. для равновесной реакции обмена в сульфатированной целлюлозе (модели ГЕП) ионов №+ на катионы МС+ находится в пределах от 3000 до 5500 М-1 в зависимости от сульфатированности целлюлозы и температуры.
Исходя из известных свойств МС, образующего в водных растворах ди-, три-, тетра-и мультимерные ассоциаты 10 (рис. 1), нами была предложена оригинальная методика ат-ромбогенной обработки реконструированных кровеносных сосудов путем последовательного нанесения на поверхность сосудистой ткани растворов МС и ГЕП. Быстрая иммобилизация антикоагулянта на поверхности окрашенного сосуда достигалась за счет того, что агрегированные молекулы МС имели возможность
Рис. 1. Предполагаемое строение димера МС (показана одна из четырех резонансных структур) 10
Дата поступления 16.04.07
Башкирский химический журнал. 2007. Том 14. №2
присоединять отрицательно заряженные молекулы ГЕП (рис. 2). Прочный комплекс ГЕП с МС эффективно предотвращал тромбоэмболические осложнения после хирургических
х 11-14
операций .
В задачу нашего исследования входило изучение эффективности способа фиксации ГЕП с помощью МС, стабильности комплекса МС-ГЕП и его антикоагулянтных свойств в различных условиях, в том числе приближенных к гемодинамическим, а также разработка методики определения концентрации ГЕП на поверхности соединительной ткани.
Фармакопейный препарат ГЕП (для инъекций, 5000 ед/мл) для комплексообразования с МС использовали без дополнительной очистки. Для построения калибровочного графика зависимости оптической плотности растворов (после реакции Дише) от концентрации ГЕП последний дважды очищали осаждением в С2Н5ОН и получали его в виде белого порошка. Растворы МС (Мегск, ФРГ) готовили на дистиллированной воде. Карбазол Сl2Н9N дважды очищали перекристаллизацией из безводного С2Н5ОН. УФ-спектры снимали в Н2О (рН 7) на спектрофотометре Specoгd М-40.
Эксперименты по фиксации ГЕП с помощью МС выполняли на кадаверных тканях человека. На фрагменты сосудистой ткани (склерозированной) с измеренной площадью поверхности наносили 1% раствор МС, выдерживали некоторое время (1, 3, 5 и 10 мин), избыток красителя удаляли промоканием салфеткой, затем окрашенную поверхность обрабатывали раствором ГЕП в течение 5 мин, избыток удаляли салфеткой. Ярко-фиолетовая окраска свидетельствовала об образовании комплекса. Один окрашенный фрагмент ткани оставляли без обработки ГЕП, его использовали для приготовления раствора сравнения. Все фрагменты помещали в проточную воду и промывали 10 мин и 24 ч.
Определение ГЕП, комплексно связанного с МС на поверхности биоматериала, по реакции Дише на уроновые кислоты карбазоло-вым методом в 87% Н^04 1 выполняли следующим образом. Каждый фрагмент ткани после соответствующей обработки помещали в пробирку с 5 мл 10% НС1 и добавляли немного цинковой пыли для разрушения комплекса и восстановления красителя МС до бесцветного лейкосоединения, не способного образовывать комплекс с ГЕП и не мешающего проведению цветной реакции Дише.
МС
[Н]
Zn, НС1
Лейкосоединение МС
Из обесцвеченного раствора отбирали пробу V = 0.5 мл, приливали 3 мл конц. Н^04 (о.с.ч.), содержащей буру (0.25 моль/л), нагревали на кипящей водяной бане в течение 10 мин, охлаждали, вносили при сильном встряхивании 0.1 мл 0.1% раствора карбазола в С2Н5ОН (абс.) и снова нагревали в течение 15 мин. Развивалось розово-фиолетовое окрашивание. Поглощение раствора измеряли при 530 нм. В качестве раствора сравнения использовали пробу без фармакопейного ГЕП, таким образом исключая из определения эндогенные гликозаминогликаны, дающие аналогичную окраску в реакции Дише.
Электронный спектр МС при его концентрации в водном растворе 10-5 М характеризуется наличием двух максимумов поглощения: при 600 и 665 нм. Первый максимум принадлежит димерным молекулам МС, второй — мономерной форме красителя. При добавлении
-о-
СЫ20803-
/I О / СОО- \ Мы А О Кон А J —О Гепарин
0803- з ^80' -1 п
МС МС+
мС" соо- ^80-
МС" МС-МС-+
08О3- СОО-
Агрегированные молекулы МС
ОН с°° ^Ы803- О^Оз" СОО 08О3'
^коллагенами гликозаминогликанов" соедийительно йтк
Функциональные
группы
Рис. 2. Фиксация ГЕП на поверхности соединительной ткани посредством красителя
11-14
в раствор избытка ГЕП Ятах сдвигался в коротковолновую область 580 нм, свидетельствуя об образовании комплекса. В равновесных условиях этот комплекс непрочен, при контакте с сывороткой крови он разрушался, и с увеличением концентрации сыворотки оставались пики абсорбции ди- и мономерного МС.
При взаимодействии ГЕП с избытком МС ([МС] > 10-2 М) в неравновесных условиях происходило образование ограниченно растворимого в воде и биологических жидкостях (крови) осадка комплексно-связанного ГЕП. После формирования комплекса МС-ГЕП на поверхности кровеносных сосудов и удаления салфеткой избытка лекарств концентрация ГЕП составляла не менее 200 мкг/см2. Зависимость его концентрации от времени контакта МС с поверхностью (т. е. от интенсивности окрашивания) мы оценивали после промывания образцов тканей в течение 10 мин проточной водой (см. экспер. ч.). Как видно из табл., с увеличением времени контакта наблюдается пропорциональное возрастание иммобилизованного на поверхности антикоагулянта. Было замечено, что сильно склерозиро-ванные сосуды окрашивались эффективнее и, как результат, содержали больше ГЕП. Через 24 ч промывания водой ГЕП обнаруживался в концентрации 5—30 мкг/см2 в количестве, достаточном для проявления атромбогенного действия.
Таблица
Зависимость концентрации ГЕП от времени контакта 1% раствора МС с поверхностью деэндотелизированного кровеносного сосуда
Время контакта, мин Концентрация ГЕП, / 2 мкг/см
1 27.3 ± 6.4
3 60.0 ± 7.8
5 78.7 ± 7.2
10 101.0 ± 5.1
Коагулограммы нативной крови, снятые в присутствии комплекса МС-ГЕП, показали, что антикоагулянтные свойства ГЕП в составе комплекса не меняются.
Клиническая апробация метода атромбо-генной обработки артерий при выполнении открытой эндартерэктомии
В эксперименте на собаках нами было показано, что интраоперационная атромбогенная обработка артерии в зоне эндартерэктомии
1%-ным раствором МС и стандартным раствором ГЕП предотвращает процессы образования пристеночного тромба, уменьшает воспалительную реакцию сосудистой стенки в ответ на повреждение, ускоряет естественную эндо-телизацию дефекта интимы (внутренней эндотелиальной оболочки сосуда).
Учитывая положительные результаты лабораторных исследований и экспериментальной апробации, а также тот факт, что ГЕП и МС являются известными лекарственными препаратами и их совместное использование не требует специального разрешения, мы применили данный способ атромбогенной обработки непосредственно в клинической практике. Атромбогенная обработка деэндотелизиро-ванной поверхности артерии была выполнена 146 больным с окклюзионными поражениями брахиоцефальных артерий. Во всех случаях применения атромбогенной обработки отмечалась несколько большая, чем обычно, кровоточивость ушитой артериотомной раны, что требовало безупречного наложения сосудистого шва, но существенно не влияло на величину суммарной кровопотери. Данная методика ин-траоперационной атромбогенной обработки оказалась простой, позволила в течение короткого времени, не влияющего на продолжительность операции, создать стойкую атромбоген-ную поверхность в области эндартерэктомии.
Для того чтобы оценить влияние интра-операционной атромбогенной обработки сосудистой стенки на результаты реконструкции сонных артерий у пациентов с окклюзионными поражениями брахиоцефальных артерий, нами был проведен анализ осложнений ближайшего и отдаленного послеоперационного периода. Результаты каротидной эндартерэктомии (КЭ), выполненной по методикам De Bakey или Chevalier, с применением метода создания тромборезистентной поверхности в зоне эндартерэктомии (группа 1), были сопоставлены по частоте осложнений с результатами у больных основной группы, которым была выполнена эверсионная КЭ по тем же методикам, но без атромбогенной обработки де-эндотелизированной артериальной стенки (группа 2). Применение атромбогенной обработки артерий во время операции способствовало существенному снижению частоты эмбо-лизации. Так, если в до- и интраоперационном периодах существенные различия по данному показателю между группами больных отсутствовали, то в послеоперационном периоде эпизоды эмболии у больных первой группы
отмечались достоверно реже, чем во второй группе (на 15.9%, р < 0.01) (рис. 3).
12
%
10,4 Е группа 1 - с атромбогенной обработкой □ группа 2 - без атромбогенной обработки 6,5
0,0
3,9
п
1,3
1,3
0,0
0,0
2-3 4-6 7-10 11-30 31-50
Количество эпизодов эмболии
Рис 3. Доля больных с эмболическими эпизодами в первый час послеоперационного периода
Анализ интенсивности эмболизации в зависимости от длительности послеоперационного периода показал, что у больных первой группы эпизоды эмболии наблюдались, главным образом, в первые сутки после операции — у 9 человек (6.2%), во вторые сутки они отмечались только у 2 пациентов (1.4%), тогда как в последующие дни эмболические эпизоды не выявлялись. Частота эпизодов эмболии у этих больных была невысокой как на первые, так и на вторые сутки после операции (рис. 4). В то же время во второй группе эпизоды эмболии регистрировались в течение 7 дней после операции при максимальной частоте в первые двое суток. Следует отметить, что у больных, которым была выполнена ат-ромбогенная обработка деэндотелизированной поверхности артерии, интенсивность эмболи-зации была достоверно ниже, чем у пациентов, которым при реконструкции сонной артерии атромбогенную обработку сосудов не проводили: в первые сутки — на 42.9%, во вторые сутки послеоперационного периода — на 55.6% (р < 0.05).
£10
V
\
S 8
ч
о
0
□ группа 1 - с атромбогенной обработкой
□ группа 2 - без атромбогенной обработки
4
0
п
0
3
0
п
1
2 3 5 7
Дни послеоперационного периода
Рис. 4. Продолжительность и число эмболических эпизодов у больных с эмболическими эпизодами в послеоперационном периоде
Предложенный нами способ атромбоген-ной обработки артерий позволил сократить частоту послеоперационных осложнений (эм-болизации, рестенозов и тромбозов) с 32.5% до 10.3%, т. е. в 3.2 раза (р < 0.01).
Литература
1. Граменицкий Е. М. Прижизненная окраска клеток и тканей.— Л.: Гос. изд. мед. лит., 1963. — 151 с.
2. Машковский М. Д. Лекарственные средства.-М.: Новая волна, 2005.— 1200 с.
3. Bellin J. S., Yankus C. A. // Biochim. et Biophys. Acta.- 1966.- V. 112, №2.- Р. 363.
4. Пат. ГДР №272033, 1989. Bockhorn V., Dietel W., Koenig K. Verfahren zur herstellung eines arzneimittels zur photochemothera-peutischen behandlung von tumoren der harnblase (Способ получения лекарственного препарата для фотохимиотерапевтического лечения опухолей мочевого пузыря).
5. Jockusch S., Lee D., Turro N. J., Leonard E. F. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.- 1996.- V. 93, №15.- P. 7446.
6. Owada T., Yamada Y., Abe H., Hirayama J., Ikeda H., Sekiguchi S., Ikebuchi K. // J. Med. Virol.- 2000.- V. 63, №4.- P. 421.
7. Shanmugam G. // Eur. J. Cardiothorac. Surg. 2005.- V. 28, №5.- P. 705.
8. Dagenais F., Machiue P. // Can. J. Cardiol.-2003.- V. 19, №2.- P. 167.
9. Lawton J.B., Phillips G.O. // J. Chem. Soc. Perkin II.- 1977.- P. 38.
10. Mukeree P., Ghosh A.K., // JACS.- 1970.-V.92, №22.- P. 6403.
11. Пат. РФ №2137507, 1999. Понеделькина И. Ю., Карабанов Ю. Р., Башкатов С. А., Вахитов В. А., Джемилев У. М., Давлетов Э. Г., Гатауллин Н. Г., Костромина Л. Е., Ижбульдин Р. И., Кама-лов А. Р., Чемерис А. В., Щекин С. В.
12. Пат. РФ №2152217, 1999. Понеделькина И. Ю., Карабанов Ю. Р., Башкатов С. А., Джемилев У. М., Вахитов В. А., Давлетов Э. Г., Гатауллин Н. Г., Камалов А. Р., Костромина Л. Е., Ижбульдин Р. И., Чемерис А. В., Щекин С. В.
13. Ижбульдин Р. И. Местная профилактика ранних реокклюзий при выполнении открытой эн-дартерэктомии из магистральных артерий. Дисс... канд.м.н., 1998.
14. Понеделькина И. Ю. Органические комплексы тиазиновых и акридиновых красителей с лекарственными препаратами. Дисс... канд. хим. наук, 2000.
15. Методы химии углеводов. / Под ред. чл.-корр. АН СССР Н. К. Кочеткова- М.: Мир, 1967.512 с.
6
4
2
2
