Компетентность к разитию завершивших фазу роста in vivo или in vitro ооцитов Sus Scrofa Domesticus из яичников на разных стадиях овариального цикла Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

_МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «ИННОВАЦИОННАЯ НАУКА» №02-2/2017 ISSN 2410-6070_

БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ

УДК 636.2:612.621

Т.И. Кузьмина, д.б.н., профессор Т.И. Станиславович, к. с.-х. н.

ФГБНУ ВНИИГРЖ г. Санкт-Петербург - Пушкин, Российская Федерация И.Я. Шахтамиров, д.б.н., профессор Х.М. Мутиева, к. с.-х. н., доцент ФГБОУ ВО «Чеченский государственный университет» г. Грозный, Чеченская Республика

КОМПЕТЕНТНОСТЬ К РАЗИТИЮ ЗАВЕРШИВШИХ ФАЗУ РОСТА IN VIVO ИЛИ IN VITRO ООЦИТОВ SUS SCROFA DOMESTICUS ИЗ ЯИЧНИКОВ НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ ОВАРИАЛЬНОГО ЦИКЛА

Аннотация

Сравнительный анализ показателей оплодотворяемости исходной популяции донорских ооцитов свиней выявил высокие потенции к развитию ооцитов, завершивших фазу роста in vivo, выделенных из яичников в фолликулярную фазу овариального цикла. Доля раздробившихся клеток составила 56%, а выход бластоцист - 38%. Напротив, растущие ооциты, аспирированные из яичников в лютеиновую или фолликулярную фазу, имели низкие показатели оплодотворяемости (% дробления - 26% и 31%, выход бластоцист - 9% и 11%).

Ключевые слова

Яичники, ооциты, оплодотворение in vitro, Sus Scrofa. Domesticus.

T.I. Kuzmina

Dr. of Biological Sciences, Professor T.I. Stanislavovich The candidate of agricultural Sciences All-Russian Research Institute for Farm Animal Genetics & Breeding

St. Petersburg - Pushkin, Russian Federation

I.Y. Shakhtamirov Dr. of Biological Sciences, Professor H. M. Mutieva The candidate of agricultural Sciences, docent the Chechen State University Grozny, the Chechen Republic

DEVELOPMENT COMPETENCE OF PORCINE OOCYTES THAT HAVE FINISHED THE GROWTH PHASE IN VIVO OR IN VITRO FROM THE OVARIES AT DIFFERENT

STAGES OF THE OVARIAN CYCLE

Abstract

Comparative analysis of fertility of donor's porcine oocytes has showed high development competence of the oocytes that have finished growth phase in vivo and isolated from the ovaries in follicular phase of the ovarian cycle. Percentage of cleavage was 56%, and the yield of blastocysts - 38%. On the contrary, the growing oocytes, have aspirated from the ovaries in the luteal phase or in follicular phase had low rates of fertility (percentage of cleavage - 26% and 31%, yield of blastocysts - 9% and 11%).

_МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «ИННОВАЦИОННАЯ НАУКА» №02-2/2017 ISSN 2410-6070_

Key words

Ovaries, oocytes, in vitro fertilization, Sus Scrofa Domesticus.

Донорские ооциты свиней - источник получения нативных и реконструированных эмбрионов для использования в животноводстве (создание высокопродуктивных пород) и биомедицине (создание линий эмбриональных стволовых клеток, ксенотрансплантация органов). Качество ооцита - один из самых важных факторов, определяющих успех или неудачу технологии экстракорпорального созревания женских гамет. В последнее десятилетие для оценки исходной популяции донорских ооцитов активно используется ВСВ-диагностика, основанная на использовании витального красителя бриллиантового кристаллического голубого (brillant cresyl blue - BCB) - индикатора активности глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы [1, P. 830838]. ВСВ детерминирует интрацеллюлярную активность глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы, которая играет важную роль в клеточном росте и является маркером завершенности фазы роста ооцита. Эффективность ВСВ-диагностики женских гамет свиней в настоящее время показана зарубежными исследователями и в наших работах [2, P. 72-80; 3, P. 604; 4, P. 366-372, 5, С. 212 - 214]. Полученные ранее результаты указывают на возможность использования для получения эмбрионов in vitro в качестве донорских ооцитов, гаметы, выделенные из фолликулов разного диаметра (менее 3 мм, 3-5 мм, 6-8 мм), предварительно оцененные ВСВ-тестом, как завершившие фазу роста in vivo [3, P. 604]. Ооциты извлекают из яичников на разных стадиях овариального цикла. Вопрос о компетентности ооцитов, выделенных из яичников на разных стадиях овариального цикла, остается открытым. В связи с вышеизложенным, цель настоящего исследования представлена в следующей формулировке: проанализировать показатели оплодотворяемости ооцитов свиней, завершивших фазу роста in vivo или in vitro, выделенных из яичников на разных стадиях овариального цикла.

В экспериментах использовали постмортальные яичники (лютеиновая или фолликулярная фаза) циклирующих особей свиней породы Ландрас. Ооциты округлой формы с тонко гранулированной ооплазмой, с равномерной по ширине зоной пеллюцида и окруженные 5-ю и более слоями клеток кумулюса выделяли из антральных фолликулов диаметром 6-8 мм, с широко разветвленной сетью капилляров, с высоким тургором, прозрачной оболочкой. Структурно-логическая схема экспериментов представлена на рис.

Оценка фa itj эгтрального цикла янчника

SfBOwimw ECB (*) ошшты srs(-nmmi

Рисунок - Структурно-логическая схема экспериментов

Для проведения ВСВ - теста ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК) отмывали в растворе Дюльбекко с

_МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «ИННОВАЦИОННАЯ НАУКА» №02-2/2017 ISSN 2410-6070_

добавлением 0,4 % бычьего сывороточного альбумина (A-7888), затем помещали на 90 минут в 13 цМ раствор BCB (B-5388), приготовленного на основе Дюльбекко. Выбор концентрации основывался на данных, полученных Egerszegi I. et al. [1, P. 830 - 838]. ОКК отмывали в растворе Дюльбекко и делили на: ВСВ(+) - ооциты с окрашенной цитоплазмой (завершившие фазу роста in vivo) и ВСВ(-) - неокрашенные ооциты (растущие). Средой для культивирования служила NCSU 23 - синтетическая питательная среда, с гормонами (10 М.Е. хорионического гонадотропина человека и 10 М.Е. хорионического гонадотропина лошади), 10% фолликулярной жидкости (диаметр фолликулов 3- 6 мм), и стенками фолликулов (диаметр фолликулов 3 - 6 мм, секции стенки фолликулов длиной 600-900 цм). ОКК культивировали 44 часа, затем оплодотворяли. Режимы культивирования и оплодотворения ооцитов in vitro, культивирования эмбрионов соответствовал описанным в методических рекомендациях, разработанных в лаборатории биологии развития ФБГНУ ВНИИГРЖ [6, 36 с.]. Все реагенты, использованные в настоящем исследовании производства фирмы Sigma-Aldrich. Для сравнения результатов, полученных в опытных и контрольных группах, использовали критерии %2. Данные обрабатывали с помощью статистической программы Sigma Stat. Достоверность различия сравниваемых средних значений оценивали при трех уровнях значимости: P <0,05; P <0,01; P <0,001.

ОКК-ооцит-кумулюсные комплексы, ЭКС-экстракорпоральное созревание, ЭКО-экстракорпоральное оплодотворение, КЭ-культивирование эмбрионов.

Данные результатов экспериментов по оплодотворению ооцитов представлены в таблице.

Таблица

Анализ показателей оплодотворяемости завершивших фазу роста in vivo или in vitro ооцитов Sus Scrofa Domesticus, выделенных из яичников на разных стадиях овариального цикла (число повторностей - 6, число ооцитов - 309) *

Фаза эстрального цикла ВСВ-тест Число ооцит-кумулюсных комплексов (n) Число (%) дробящихся клеток Число (%) эмбрионов на стадии бластоцисты

Лютеиновая + 89 45/89(51)a 29/89(33) e

- 58 15/58(26)b 5/58(9) f

Фолликулярная + 101 57/101 (56)c 38/101 (38)

- 61 19/61(31)d 7/61(11)k

a:bP<0,001; a;d P<0,01;b:cP<0,001; а:с P<0,05; d:bP<0,05; c:dP<0,01; e:fP<0,001; ejP<0,05; e:kP<0,01; f:jP<0,001; k:jP<0,001(Kpm-epHÜ %-квадрат)

Всего прокультивировано и оплодотворено 309 ОКК. (89 ооцитов завершивших фазу роста и 58 растущих ооцитов выделили из яичников в лютеиновой фазе овариального цикла, из яичников в фолликулярной фазе аспирировали 101 ооцит, завершивший фазу роста, и 61 растущий ооцит). Обнаружены достоверные различия в уровне дробления ооцитов, диагностируемых на основе ВСВ-теста, как завершившие фазу роста in vivo или in vitro, независимо от фазы овариального цикла. Пролонгация культивирования полученных эмбрионов до завершающей стадии предимплантационного развития -бластоцисты подтвердила высокие потенции к развитию ооцитов, завершивших фазу роста in vivo - ВСВ(+) ооцитов, выделенных из яичников в фолликулярной или лютеиновой фазе (38% и 33%, соответственно) по сравнению с компетентностью к развитию ооцитов, находящихся в фазе роста в момент извлечения из яичников (11% и 9%, соответственно). При анализе потенций к оплодотворению завершивших фазу роста in vivo ооцитов, выделенных их яичников на разных стадиях овариального цикла, выявлены достоверные различия в уровнях дробящихся клеток и зародышей. Так, процент дробления в группе, где культивировали и оплодотворяли завершившие фазу роста in vivo ооциты, выделенные из яичников в фолликулярной фазе, превысил долю дробящихся клеток, развившихся из ВСВ(+) ооцитов, аспирированных из яичников в лютеиновой фазе (56% против 51%, Р<0,05). При дальнейшем культивировании эмбрионов до завершающей стадии доимплантационного развития (бластоцисты) вышеуказанная тенденция не

МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ «ИННОВАЦИОННАЯ НАУКА» №02-2/2017 ISSN 2410-6070

изменилась. Выход бластоцист из завершивших фазу роста ооцитов, выделенных из яичников в фолликулярной фазе превысил таковой при развитии зародышей, полученных из ВСВ(+) ооцитов, аспирированных из яичников в лютеиновой фазе (38% и 33%, соответственно, Р<0,05). Т.о., использование превентивного ВСВ-тестирования исходной популяции донорских ооцитов свиней позволило оценить проспективные потенции к развитию ооцитов в зависимости от их функционального статуса (растущие или завершившие фазу роста) и фазы овариального цикла свиней. Ооциты, завершившие фазу роста in vivo, выделенные из яичников в фолликулярной фазе имели максимальные показатели (в представленной в настоящем исследовании серии экспериментов) по уровню дробления и выходу эмбрионов на стадии бластоцисты (56% и 38%).

Список использованной литературы:

1. Egerszegi I. Meiotic progression, mitochondrial features and fertilisation characteristics of porcine oocytes with different G6PDH activities / I. Egerszegi, H. Alm, J. Ratky // Reprod Fertil. Dev. - 2010. - V. 22. - P. 830-838.

2. Ishizaki C. Developmental competence of porcine oocytes selected by brilliant cresyl blue and matured individually in a chemically defined culture medium / C. Ishizaki, H. Watanabe, M. Bhuiyan, Y. Fukui // Theriogenology. - 2009. -72: 72-80.

3. Kuzmina T. Developmental competence of porcine oocytes that have finished growth phase from follicles of different diameter / T. Kuzmina, V. Kravtsov, H. Alm, H. Torner, K.-P. Brussow // Anim. Reprod. -2015. - V.12 (3). - P.604.

4. Wongsrikeao P. Effects of single and double exposure to brilliant cresyl blue on the selection of porcine oocytes for in vitro production of embryos / P. Wongsrikeao, T. Otoi, H. Yamasaki, B. Agung, M. Taniguchi, H. Naoi, R. Shimizu, T. Nagai // Theriogenology. - 2006. - 66: 366-372.

5. Кузьмина Т.И. ВСВ-диагностика донорских ооцитов Bos Taurus и Sus Scrofa Domesticus - перспективы использования в клеточных репродуктивных технологиях / Т.И. Кузьмина, Т.И. Станиславович, Д.Н. Татарская, Х.М. Мутиева, И.Я. Шахтамиров // Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. - 2015. - №2. - C. 212-214.

6. Кузьмина Т.И. Методы получения эмбрионов свиней in vitro / Т.И. Кузьмина, Х. Альм, Х. Торнер // Спб - Пушкин. - 2008. - 36 с.

© Кузьмина Т.И., Станиславович Т.И., Шахтамиров И.Я., Мутиева Х.М., 2017

УДК 574

Р.А. Степень, д.б.н., проф. С.В. Соболева, к. т. н, доцент В.М. Воронин , т. н, доцент СибГАУ. г. Красноярск, Российская Федерация

ОЗДОРОВЛЕНИЕ ВОЗДУШНОЙ СРЕДЫ ГОРОДОВ ЛЕТУЧИМИ ВЫДЕЛЕНИЯМИ

ПИХТОВЫХ НАСАЖДЕНИЙ

Аннотация

В работе проанализированы выход эфирного масла и содержание летучих фитоорганических выделений ассимиляционного аппарата пихты сибирской городских и пригородных посадок г. Красноярска. Предполагается, что часть экскретов пригородных лесов, с учетом господствующей розы ветров, переносятся на территорию города и будут участвовать в оздоровлении воздуха.

Ключевые слова Пихта, экскреты, хвоя, биомасса, перенос ветром.