CC BY
16
ЛИТЕРАТУРА
1. Ершов Ф.И. Система интерферона в норме и при патологии. - М., Медицина, 1996. - 239 с.
2. Соловьев В.Д., Бектемиров ТА. Интерферон в теории и практике медицины. - М., Медицина, 1981. - 366 с.
3. Кузменко Л.Э., Малиновская В.В., Саляева М.В. и др. // Врач. - 1994. - №3. - С. 29-29.
4. Нецеевская МА. Клинико-иммунологические критерии прогнозирования гестоза: Автореф. дис. канд. мед. наук. - М., 2000. - 34 с.
5. Бондарь О.Е., Ванько Л.В., Логинова Н.С. и др. // Вопр. гинекологии, акушерства и перинатологии. -2004. - Т.3, №3. - С. 62-66.
6. Кешишян Е.С., Малиновская В.В., Дементьева Г.М. и др. // Современные подходы в лечении некоторых актуальных инфекций в педиатрической и акушерской практике. Сб. метод. рекомендаций и пособий для врачей. / Под ред. Н.В. Скрипченко. - М., 1999. - С. 44-48.
7. Манухин И.Б., Совдагарова Ю.Э. // Вопр. гинекологии, акушерства и перинатологии. - 2003. - Т.2, №1. - С.36-39.
8. Gibson L., Piccinini G., Lilleri D. et al. // J. Immunol. - 2004. - Vol. 172. - P. 2256-2264.
9. Киселев О.И. и др. Определение интерферонового статуса как метод оценки иммунореактивности при различных формах патологии. Пособие для врачей. - М.,
2002.-25 с.
10. Королева Л.И., Евсюкова ИИ, Сельков СА. и др. // Физиология человека. - 2003. - Т. 29, №5. - С. 156-158.
11. Ожегов А.М., Мальцев С.В., Мякишева Л.С. // Педиатрия.- 2001.- №2.- С. 26-31.
12. Евсюкова И.И., Королева Л.И. // Педиатрия. -
2003. - №2. - С. 82-87.
13. Пинаева А.В. Состояние цитокиновой системы и клеточного иммунитета при инфекционно-воспалитель-ных заболеваниях у новорожденных детей: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - М., 2002. - 23 с.
14. Matsuoka T., Matsubara T., Katayama K. et al. // Pediatrics International. - 2001. - Vol. 43. - P. 453-457.
У 118 детей, начиная с 1-го дня рождения и в дальнейшем в разные сроки до конца 1-го года жизни, а также у 118 их матерей прослежена динамика заселения кишечника детей E. coli и динамика распространения в их популяциях плазмидных факторов колициногенности (Col) и множественной лекарственной устойчивости (R). Установлено, что уже в первый день жизни в кишечнике новорожденных обнаруживаются колициногенные и антибиотикоустойчивые особи E. coli. Число таких особей в составе популяций может быть незначительным (9% Col+, 19,9% R+) и поэтому их можно обнаружить только при исследовании значительного числа особей популяции (не менее 100). Пропорция колициногенных и антибиотикоустойчивых особей в составе популяций кишечных палочек увеличивается с возрастом ребенка, что может оказать влияние на стабильность нормальной микрофлоры детей и результаты лечения их антибиотиками.
Authors followed dynamic of intestinal colonization by E. coli and dynamic of colicinogenicity plasmid factors and multiple drug resistance spread in their population in 118 children since 1st day of life and in different terms up to the end of 1st year of life and in their 118 mothers. They showed that colicinogenous and antibiotic-resistant E. coli specimens were present in neonatal intestine even in 1st day of life. The number of such specimens in population could be minor and so they could be detected only during examination of significant number of individuals (not less than 100 persons). The rate of colicinogenous and antibiotic-resistant specimens in E. coli population was increased with ageing of patients and this fact could influence upon stability of normal intestinal microflora of children and upon the results of antibiotic therapy.
© Бельский В.В., Московцева А.И., 2006
В.В. Бельский, А.И. Московцева
КОЛОНИЗАЦИЯ ESCHERICHIA COLI КИШЕЧНИКА И ЧАСТОТА ВЫЯВЛЕНИЯ ПЛАЗМИДНЫХ ФАКТОРОВ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ И КОЛИЦИНОГЕННОСТИ У ДЕТЕЙ НА ПРОТЯЖЕНИИ ПЕРВОГО ГОДА ЖИЗНИ
Курский Государственный медицинский университет, г. Курск, РФ
Известно, что возникновение, течение и исход кишечных инфекций, особенно в детском возрасте, а также эффективность лечебных мероприятий во многом зависят от состояния нормальной микрофлоры кишечника и, в частности, от количественного состава и качественной характеристики одного из основных его обитателей - кишечных палочек. По данным литературы [1, 2], формирование нормальной микрофлоры кишечника человека происходит в течение 1-го года жизни. В связи с этим представляет интерес изучение динамики заселения кишечника кишечными палочками, а также наличие и распространение среди них плазмид-ных факторов множественной лекарственной устойчивости (R-плазмида) и колициногенности (Col-плазмида). Важность этих вопросов подтверждается данными многих авторов о том, что представители нормальной микрофлоры, и прежде всего кишечные палочки, являясь постоянными обитателями кишечника, играют роль в сохранении и распространении на видовом и межродовом уровнях трансмиссивной лекарственной устойчивости [3, 4]. Плазмиды колициногенности эшерихий могут определять характер микробного ценоза и взаимоотношение микробов в естественных ассоциациях [5, 6]. Однако опубликованные до настоящего времени материалы о распространении R- и Col-плазмид, в том числе и среди эшерихий, выделенных от детей, базируются на изучении единичных колоний из многочисленной популяции кишечных палочек, населяющих кишечник. Следует отметить, что такая методика не может отразить истинное состояние как в отношении частоты носитель-ства R+ и Col+ кишечных палочек, так и удельного веса их в составе популяций.
Целью настоящего исследования было определение времени заселения кишечника детей кишечными палочками с первых дней жизни и динамики распространения среди них плазмидных R- и Col-факторов в течение 1-го года жизни с анализом большого количества представителей популяций (не менее 100).
Материалы и методы исследования
Обследовано 118 детей в родильном доме в 1-й день и на 7-8-й день после рождения, а затем через 3, 6 месяцев и 1 год после рождения. У 118 матерей - родильниц материал для исследования брали при поступлении в родильный дом и при выписке из родильного дома.
Для определения клональной структуры популяций кишечных палочек по признакам лекарственной устойчивости и колициногенности из каждого посева испражнений на среде Эндо отбирали по 100 типичных колоний E. coli и производили посев каждой колонии на другие чашки со средой Эндо. После подращивания в течение 18-20 ч делали отпечатки по методике Ледербергов [7] в нашей модификации [8] на среды, содержащие антибиотики (левомицитин, стрептомицин, тетрациклин) и на
чашки с простым агаром (контроль). Колициногенность эшерихий определяли по методике Фредерика [5], типы колицинов, продуцируемых кишечными палочками, определяли с помощью набора штаммов-индикаторов [9]. Для изучения передачи R-плазмид в опытах конъюгации in vitro использовали методы, описанные японскими исследователями [10]. Всего изучено 59 800 культур кишечных палочек, из них 36 200 культур выделены от детей в различные периоды 1-го года жизни, 23 600 культур - от рожениц и родильниц. Трансмиссивность признаков лекарственной устойчивости изучена у 518 культур, типы колицинов - у 660 культур.
Результаты и их обсуждение
Из 118 новорожденных в 1-й день после рождения кишечные палочки были выделены из меко-ния только у 17 (14,4%), на 7-8-й день - у 69 (58,6%). Начиная 3-месячного возраста и до конца 1-го года жизни E. coli выделились у всех обследованных детей.
Поскольку известно, что наличие колицино-генных кишечных палочек является важным фактором в стабилизации микробного ценоза кишечника и, в определенной степени, определяет резистентность макроорганизма к бактериальным инфекциям [6], мы проследили динамику распространения колициногенных кишечных палочек у детей 1-го года жизни, то есть в процессе формирования нормальной микрофлоры кишечника.
Оказалось, что из 17 новорожденных, у которых были выделены кишечные палочки, колици-ногенные клоны в составе популяций E. coli обнаружены у 5 детей, на 7-8-й день жизни - у 22. В дальнейшем число детей, носителей колициноген-ных клонов, непрерывно увеличивалось с возрастом, достигая к концу 1-го года жизни 50,6% всех обследованных детей (см. таблицу).
Однако, следует отметить, что пропорция коли-циногенных особей в составе популяций кишечных палочек (из 100 изученных) оставалась незначительной и в большинстве случаев различалась в разные периоды у одного и того же ребенка и у разных детей. Тем не менее пропорция Col+ кишечных палочек в составе их популяций увеличивалась с возрастом от 9% в 1-й день до 15,1% и 12,2% на 6-й месяц жизни ребенка и к одному году. Эти результаты подчеркивают справедливость высказанного ранее предположения о том, что исследование одной или нескольких колоний после посева материала не может достоверно установить наличие того или иного признака у кишечных палочек, в частности признака колициногенности.
С целью определить, меняются ли расы коли-циногенных кишечных палочек у детей на протяжении 1-го года жизни, мы изучали смену типов колицинов у 49 детей. Установлено, что у изученных культур кишечных палочек во всех периодах обследования преобладали типы колицинов E, I и D. Оказалось, что полная смена типа колицинов на-
блюдалась только у 3 детей (из 49). Основываясь на установившемся в литературе представлении о генетической стабильности признаков, контролирующих продукцию указанных типов колицинов [6], можно предположить, что у большинства обследованных нами детей сохранились одни и те же расы кишечных палочек от момента заселения ими кишечника и до конца срока наблюдения.
С точки зрения практической медицины особенно важно было установить, попадают ли в кишечник новорожденных детей и приживаются ли в нем устойчивые к антибиотикам кишечные палочки. Представляют также интерес частота этого явления и динамика распространения лекарственно-устойчивых эшерихий с возрастом в популяциях эшерихий у разных детей. Для принципиального решения этого вопроса была определена резистентность к ограниченному числу антибиотиков (тетрациклин (т), стрептомицин (с), левомицетин (л)), которые уже длительное время и часто применяются в лечебной практике.
Оказалось, что устойчивые к антибиотикам клоны обнаруживались в популяциях E. coli уже в 1-й день жизни в 8 случаях из 17 детей, носителей кишечных палочек на этот срок. При выписке из родильного дома резистентные к антибиотикам эшерихии обнаружены уже у 33 детей (47,8%), к 3 месяцам жизни процент детей, носителей резистентных к антибиотикам кишечных палочек, возрастает до 80%, а концу 1-го года жизни - 92,7%.
С учетом этих результатов важно было не только обнаружить клоны резистентных микробов, но и установить их пропорцию в популяциях, что было осуществлено с помощью применяемой нами методики. По данным литературы [11], при наличии
в популяции 10% и более резистентных клонов после начала применения соответствующих антибиотиков вся популяция становится однородной, то есть резистентной.
При анализе клональной структуры популяций кишечных палочек, полученных от детей, у большинства обследованных была обнаружена гетерогенность их как в отношении наличия или отсутствия лекарственно-устойчивых особей, так и в отношении спектров резистентности отдельных клеток. Наши исследования показали, что у новорожденных детей пропорция эшерихий с множественной лекарственной устойчивостью в составе их популяций весьма велика: из 337 антибиотикоустой-чивых колоний резистентными к 3 антибиотикам были 285 (84,6%). В дальнейшем процент таких клонов в популяциях снижается до 48,3% к концу 1-го года жизни.
Таким образом, было установлено, что полирезистентные кишечные палочки проникают в кишечник детей уже в первые дни после рождения. Важно подчеркнуть, что они не только приживаются в кишечнике, но в первые 6 месяцев являются преобладающими в составе их популяций. Полученные данные позволили предположить трансмиссивный характер признаков полирезистентности кишечных палочек за счет конъюгативных R-плазмид.
Способность к передаче признаков устойчивости к антибиотикам в процессе конъюгации in vitro изучена у 467 штаммов кишечных палочек, в том числе у 326 штаммов, полученных от детей 1-го года жизни в различные сроки исследования, и у 141 штаммов, выделенных от их матерей при поступлении и выписке из родильного дома. Всего проведено 979 скрещиваний, из которых 64,7% оказались поло-
Таблица
Динамика заселения кишечника E. coli и распространения среди них плазмидных факторов (R и Col) у детей первого года жизни
Возраст детей Всего обследовано Обнаружено E. coli, % Из них Обнаружены антибиотико-устойчивые штаммы, % Из них
всего,% пропорция, % пропорция, % с множественной анти-биотико-устойчивостью, % сочетание, %
1-й день 118 14,4 29,4 9,0 47,2 19,9 84,6 17,6
7—8-й день 118 58,6 31,8 9,1 47,8 28,4 56,4 24,6
3 месяца 102 100,0 33,2 8,3 80,0 35,7 82,6 41,0
6 месяцев 91 100,0 42,8 15,1 67,0 41,7 51,7 30,8
1 год 83 100,0 50,6 12,2 92,7 40,1 48,3 42,2
жительными, то есть имела место передача от донора (исследуемые штаммы E. coli) к реципиенту (E. coli С 600). Эти данные свидетельствуют о значительной распространенности конъюгативных R-плазмид среди изученных штаммов кишечных палочек.
Особого внимания заслуживает факт выявления в наших опытах сочетания признаков полирезистентности к антибиотикам и колициногенности. Такие популяции кишечных палочек могут выступать в роли «хранителей» одновременно нескольких важных свойств и способствовать их распространению как в микрофлоре кишечника носителя, так и во внешней среде. Оказалось, что уже на следующий день после рождения из 17 детей, у которых были обнаружены кишечные палочки, у 3 детей выделялись эшерихии, обладающие одновременно колици-ногенностью и лекарственной устойчивостью. В дальнейшем число детей, у которых обнаруживались эшерихии с двойным признаком, увеличивалось, достигая к концу 1-го года жизни 42%.
Возникает вопрос об источниках заселения кишечника детей первого года жизни эшерихиями, в том числе и обладающими признаками лекарственной устойчивости и колициногенности. Сравнение свойств кишечных палочек, выделенных от детей и их матерей, показало, что в 70% случаев свойства эшерихий, выделенных от детей и их матерей, по признакам лекарственной устойчивости, колицино-генности и типам колицинов совпадали. Следовательно, можно констатировать, что основным источником заселения кишечника детей кишечными палочками в 1-й год их жизни являются их матери, которые в этот период находятся со своими детьми в тесном контакте.
Заключение
Таким образом, при наблюдении в динамике 118 детей на протяжении 1-го года жизни установлено, что заселение кишечника детей кишечными палочками начинается уже с 1-го дня жизни ребен-
ка, а с 3-месячного возраста E. coli обнаруживаются у всех обследованных детей. Важно подчеркнуть, что уже в 1-й день после рождения в кишечнике детей обнаруживаются эшерихии, обладающие клинически значимыми признаками - колицино-генностью и множественной лекарственной устойчивостью к антибиотикам. При этом пропорция особей в популяциях кишечных палочек, обладающих указанными признаками, может быть сравнительно небольшой: от 9 % до 12% - для признака колициногенности и от 19,9% до 41,7% - для антибиотико-устойчивых особей. Следовательно, выявить наличие плазмидных признаков (Col и R) можно только при исследовании большого числа (не менее 100) особей популяции.
Установлено также, что пропорция колицино-генных клонов кишечных палочек в динамике исследований увеличивается незначительно от периода новорожденности до первого года жизни. В то же время число антибиотикорезистентных клонов за этот же период непрерывно увеличивалось и к концу 1-го года жизни достигло 40,1% от состава популяции.
В соответствии с данными литературы эти особенности распространения плазмидных факторов можно объяснить следующим образом. Колици-ногенность является стойким генетическим признаком и передается в основном по вертикали дочерним клеткам. Известно, что из обнаруженных нами типов колицинов, колицин D не передается в процессе конъюгации от клетки к клетке (по горизонтали), а типы колицинов I и E передаются по горизонтали сравнительно редко [6]. В отличие от плазмид колициногенности факторы множественной лекарственной устойчивости (R) почти всегда являются конъюгативными и поэтому быстро распространяются в популяциях микробов путем передачи от клетки к клетке [10]. Это подтверждается и в наших исследованиях: из 979 проведенных скрещиваний в 64,7% наблюдалась передача R- плазмид от донора к реципиенту.
ЛИТЕРАТУРА
1. Циклинская П.В. // I Всерос. съезд детских врачей.-М.,1912. - С. 12-15.
2. Перетц Л.Г. Значение нормальной микрофлоры для организма человека. - М.,1955. - 436 с.
3. Mitsuhashi S., Harada К., Hashimoto // Jap. J. Exp. Med. - 1960. - Vol. 30. - P. 156-158.
4. Линееич Ю.Г., Зуева B.C., Рыбаков В.Н., Могильная С.П. Химиотерапия инфекций и лекарственная устойчивость микроорганизмов. - М., 1973. - 228 с.
5. Frederieq Р. // Ann. Rev. microbiol. - 1957. - №11. - P.7-10.
6. Кудлай Д.Г., Лиходед В.Г. - Бактериоциногения.
- М., 1966. - 203 с.
7. Lederberg S, Lederberg Е.М. // J. Bact. - 1952. -Vol. 63, №3. - Р. 399-406.
8. Вельский В.В., Московцева А.И. // Лаб. дело. -1972. - №8. - С. 488-490.
9. Кудлай Д.Г., Аникейчева Н.В.// Лаб. дело. - 1972.
- №6. - С. 362-365.
10. Watanabe T.// Вестн. АМН СССР. - 1986. - №2.
- С.20-23.
11. Смолянская А.З., Сакалян Н.Н., Дронова О.М. и др.// Эпидемиология и микробиология раневых инфекций. - М.,1986. - С. 14-15.
