CC BY
237
© Коллектив авторов., 2007 УДК 582.912.48:547.586.2
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУММЫ ГИДРОКСИКОРИЧНЫХ КИСЛОТ В ТРАВЕ ВЕРЕСКА ОБЫКНОВЕННОГО ИЗ РАЗЛИЧНЫХ МЕСТ ПРОИЗРАСТАНИЯ
С.В. Онегин, Н.С. Фурса
Ярославская государственная медицинская академия
В статье представлены материалы по разработке методики количественного определения гидроксикоричных кислот в траве вереска обыкновенного и результаты количественного определения их суммы в образцах из различных мест произрастания в Российской Федерации и Беларуси.
Вереск обыкновенный (Calluna vulgaris (L.) Hull) - известное лекарственное растение, используемое в аллопатии и гомеопатии [8]. Оно относится к монотипному роду семейства вересковые (Ericaceae Juss.), подсемейства вересковые (Ericoideae Druge). Его родиной является Юго-Восточная Азия, но ареал обширен (от Северной Африки до Арктики). На территории России вереск произрастает в лесной зоне Европейской части (все районы от севера до степей), Западной и Восточной Сибири [2,9,10]. Он цветет в июле-августе, а в южных частях ареала и в сентябре. Цветение продолжается до глубокой осени [4,7].
Лекарственным сырьем растения служат цветки или надземная часть, которую собирают во время цветения, срезая вер-хутттки побегов и облиственные ветки с цветками. Высушенное сырье представляет собой частично обмолоченную траву с мелкими частичками «голых» и облиственных веточек, покрытых темно-коричневой корой, отдельными зелеными листочками и розовато-лиловыми цветками. Запах слабый, ароматный, вкус горьковатый, слегка вяжущий.
Действующие вещества вереска представлены обширным набором биологически активных веществ, среди которых основ-
ными являются фенольные соединения, в частности флавоноиды, кумарины, гидроксикоричные кислоты, полифенольные окисляемые соединения. Из гидроксикоричных кислот преобладают производные хлорогеновой кислоты [5,8].
Материалы и методы
Материалом для исследования служила трава вереска, собранная в Ярославской и прилегающих к ней (Костромской, Ивановской, Вологодской, Тверской) областях, а также в республиках Беларусь, Карелия, Коми, Мурманской, Архангельской и Брянской областях в июле-сентябре с 1994 по 2004 год.
Для определения количества гидроксикоричных кислот в траве вереска использовали двумерную хроматографию на бумаге (FN-4, производства Германия) в системах растворителей: 1 направление - н-бутанол - уксусная кислота - вода в соотношении 4:1:2; 2 направление - 2% раствор уксусной кислоты восходящим методом.
Для выявления преобладающего компонента суммы гидро-ксикоричных кислот провели сравнение дифференциальных спектров поглощения извлечения вереска и стандартов кислот (кофейной, феруловой, хлорогеновой).
Для количественного определения суммы гидроксикорич-ных кислот мы применили спектрофотометрический метод в УФ-области [1]. При разработке методики их количественного определения для установления полноты экстракции исследовали степень влияния на нее экстрагента, а также времени и кратности экстрагирования.
Результаты и их обсуждение
При хроматографическом изучении спиртового извлечения травы вереска нами обнаружено не менее 8 веществ (табл. 1), из которых по окраске до и после проявления, по показателю Rf при сравнении с достоверным образцом идентифицирована хлорогеновая кислота. По площади пятна и интенсивности окраски после проявления диагностическими реактивами следует, что она является доминирующей гидроксикоричной кислотой надземной части. Тем более, что совпадение максимумов дифференциальных спектров поглощения извлечения вереска обыкновенного и стан-
дарта хлорогеновой кислоты производства фирмы Sigma (Германия) (рис.) позволили использовать ее в качестве стандартного вещества.
Таблица 1
Результаты хроматографического анализа гидроксикоричных
кислот травы вереска обыкновенного
№ пятна Значения Rf в системах Окраска в УФ-свете
до проявления после проявления 2% р-р 2гОСЬ, парами квдн
I II
1 0,55 +++ 0,61 +++ голубой слабо- салатный
2 0,49 0,66 ++ - салатный
3 0,38 0,70 - салатный
4 0,48 +++ 0,71 +++ голубой слабо- салатный
5 0,58 0,72 - слабо- салатный
6 0,34 + 0,78 ++ салатный слабо- салатный
7 0,56 + 0,79 ++ слабо- фиолетовый слабо- салатный
8 0,44 + 0,87 ++ слабо- фиолетовый фиолетовый
Условные обозначения. Система I - н-бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:2). Система II - 15% уксусная кислота; + - слабо выраженная окраска, ++ - умеренно
выраженная окраска, +++ - сильно выраженная окраска.
УФ-спектр спиртового извлечения травы вереска
УФ-спектр хлорогеновой кислоты
■УФ-спектр кофейной кислоты
■УФ-спектр феруловой кислоты
Длина волны
Рис. УФ-спектры поглощения спиртового извлечения вереска и стандартов гидроксикоричных кислот.
При выборе экстрагента для извлечения гидроксикоричных кислот из сырья использовали различной концентрации водноспиртовые смеси, в частности 40, 50, 70, 90 и 96%-ный спирт этиловый. При этом нами отмечено, что максимальное количество анализируемых веществ наблюдалось при экстракции 90%-ным этанолом (табл. 2).
Таблица 2
Выбор оптимальной концентрации спирта для экстракции суммы гидроксикоричных кислот из травы вереска
Концентрация спирта, % 40 50 70 90 96
Содержание гидроксикоричных кислоты, % 1,65± 0,0253 1,86± 0,0334 3,12± 0,0195 3,24± 0,0396 2,69± 0,0437
Для установления времени и кратности наиболее полного экстрагирования веществ извлечение проводили однократно, двукратно, трехкратно и четырехкратно на протяжении 15 и 30 минут. Результаты исследования показали, что полнота экстрагирования гидроксикоричных кислот достигалась после четырехкратного экстрагирования в течение 30 минут (табл. 3).
Таблица 3
Выбор оптимальных условий экстрагирования суммы гидроксикоричных кислот из травы вереска________
Номер опыта Количество экстракций Время одного экстрагирования, мин Выход суммы гид-роксикоричных кислот, %
1 1 15 3,96±0,0400
2 1 30 3,53±0,0325
3 2 15 4,18±0,0340
4 2 30 4,40±0,0679
5 3 15 4,59±0,0566
6 3 30 4,83±0,0769
7 4 15 4,78±0,0486
8 4 30 5,35±0,0934
На основании вышеизложенных данных количественное определение гидроксикоричных кислот в траве вереска провели по приведенной ниже методике.
Методика количественного определения суммы гидроксикоричных кислот в траве вереска
1,0 г сырья (точная навеска) помещали в колбу на 100 мл, заливали 20 мл 90% спирта этилового, соединяли с обратным холодильником и нагревали на кипящей водяной бане 30 минут. Извлечение фильтровали в мерную колбу на 100 мл. Экстракцию повторяли четыре раза. Полученное извлечение доводили до метки 90% спиртом этиловым. 1 мл извлечения переносили в мерную колбу на 50 мл, доводили до метки 90% этанолом и измеряли оптическую плотность на спектрофотометре СФ-46 в УФ-области при длине волны 325 нм. В качестве раствора сравнения использовали чистый растворитель (90% спирт этиловый).
Содержание суммы гидроксикоричных кислот в сырье (Х,%) в пересчете на хлорогеновую кислоту вычисляли по формуле:
Б х 100 х 50
Х,% =--------------, где
х a х 1
О - оптическая плотность исследуемого элюата,
100 и 50 - объёмы мерных колб, используемых для анализа,
мл;
1 - объём извлечения травы вереска, взятого на разве-
дение, мл;
а - навеска травы вереска, г;
- удельный показатель поглощения хлорогеновой кислоты при 325 нм [6].
Статистическую обработку проводили в соответствии с ГФ XI издания [3]. Метрологическая характеристика методики количественного определения гидроксикоричных кислот представлена в таблице 4.
Таблица 4
Метрологическая характеристика
n f хсред. S2 S Sx Р, % Ах s, %
10 9 4,442 0,0005511 0,0234755 0,0078251 95 0,0177 0,398
Результаты количественного определения гидроксикорич-ных кислот в траве вереска обыкновенного обобщены в таблице 5.
Таблица 5
Содержание гидроксикоричных кислот в траве вереска
из различных регионов РФ
№ образ- ца Содержание гид-роксикоричных кислот, % № образ- ца Содержание гид-роксикоричных кислот, % № образ- ца Содержание гид-роксикоричных кислот, %
1 4,б58±0,0570 14 4,5б9±0,0412 27 5,4б7±0,0б35
2 2,883±0,0327 15 4,б23±0,0б53 28 5,319±0,0533
3 2,343±0,0384 1б 5,977±0,0905 29 3,б78±0,0433
4 5,880±0,0927 17 4,593±0,0б13 3G 4,3б8±0,0527
5 4,558±0,0738 18 4,908±0,0843 31 4,272±0,0535
б 9,139±0,1414 19 3,885±0,0б43 32 3,б48±0,0402
7 5,710±0,0б39 2G 5,248±0,0583 33 4,352±0,0543
8 4,781±0,0595 21 4,341±0,0382 34 7,б52±0,1173
9 5,508±0,09б9 22 5,520±0,0798 35 5,02б±0,0409
1G 4,220±0,0594 23 4,520±0,0517 3б 5,00б±0,0521
11 5,7б9±0,04б4 24 б,018±0,0б97 37 4,5б0±0,0435
12 4,303±0,0389 25 4,837±0,0710
13 4,713±0,0437 2б 5,270±0,0551
Примечание. Места сбора образцов: 1 - окр. дер. Слободка Вишегорского района Архангельской обл., август 2002 г.; 2 - окр. г. Витебск Республики Беларусь, август 2003 г.; 3 -
окр. г. Брянск, сентябрь 1999 г.; 4 - окр. с. Оларево Сокольского района Вологодской обл., август 2002 г.; 5 - окр. озера Вохи Кирилловского района Вологодской обл., июль 2002 г.; 6 - окр. пос. Смирдомский Чагодощенского района Вологодской обл., июль 2003 г.; 7 - окр. дер. Шулма Череповецкого района Вологодской обл., июль 2003 г.; 8 - окр. дер. Новоива-ново Ильинского района Ивановской обл., сентябрь 2003 г.; 9 - окр. г. Петрозаводск Республики Карелия, сентябрь 1999 г.; 10 - окр. дер. Студенец Усть-Вымского района Республики Коми, август 2001 г.; 11 - окр. с. Ужга Койгородского района Республики Коми, август 2004 г.; 12 - окр. г. Кострома, сентябрь 1999 г.; 13 - окр. г. Нея Костромской обл., август 1994 г.; 14 - окр. с. Унжа Нейского района Костромской обл., август 1999 г.; 15 - окр. дер. Якимово Макарьевского района Костромской обл., август 1995 г.; 16 - окр. г. Мурманск, июль 2004 г.; 17 - окр. г. Остров Псковской обл., август 2004 г.; 18 - окр. г. Удомель Тверской обл., август 1996 г.; 19 - окр. пос. Туношна Ярославского района Ярославской обл., август 1999 г.; 20 - окр. дер. Гаврилово Ярославского района Ярославской обл., август 1997 г.; 21 - Смоленский сосновый бор Ярославского района Ярославской обл., июль 1998 г.; 22 - окр. дер. Ляпино Ярославского района Ярославской обл., август 2003 г.; 23 - окр. пос. Прусово Ярославского района Ярославской обл., август 2003 г.; 24 - окр. пос. Нижний Ярославского района Ярославской обл., август 2003 г.; 25 - окр. дер. Малый Солонец Ярославского района Ярославской обл., сентябрь 1998 г.; 26 - окр. санатория «Малые соли» Некрасовского района Ярославской обл., август 1997 г.; 27 - окр. дер. Тощиха Некрасовского района Ярославской обл., август 1994 г.; 28 - окр. д. Тощиха Некрасовского района Ярославской обл., август 1997 г.; 29 - остров Майский Рыбинского водохранилища Ярославской области, август 1998 г.; 30 - окр. пос. Тихменево Рыбинского района Ярославской обл., июль 1999 г.; 31 - окр. пос. Волжский Рыбинского района Ярославской обл., сентябрь 2000 г.; 32 - окр. с. Коприно Рыбинского района Ярославской обл., август 2003 г.; 33 - окр. дер. Кобостоло Рыбинского района Ярославской обл., июнь 2003 г.; 34 - окр. г. Рыбинск Рыбинского района Ярославской обл., август 1998 г.; 35 - окр. пос. Брейтово Ярославской обл., август 1998 г.; 36 - окр. дер. Остряковка Брейтовского района Ярославской обл., август 2003 г.; 37 - окр. местечка Симак Переславского района Ярославской обл., август 2004 г.
Следовательно, при хроматографическом исследовании спиртового извлечения травы вереска мы выявили не менее 8 гидроксикоричных кислот. По расположению пятна и интенсивности его окраски до и после проявления, сравнением с достоверным образцом нами идентифицирована хлорогеновая кислота. Последующее сравнение дифференциальных спектров поглощения спиртового извлечения травы вереска и этой кислоты показало, что их максимумы совпадают. Исходя из этого, определение содержания суммы гидроксикоричных кислот проводили в пересчете на хлорогеновую кислоту. При разработке методики количественного определения суммы анализируемых кислот в траве вереска с учетом выявления оптимальных условий экстрагирования оказалось, что их больше всего извлекалось с использованием 90% этанола при 4-кратной экстракции на протяжении 30 минут.
Результаты количественного определения суммы гидро-ксикоричных кислот в 36 образцах вереска, собранных главным образом в северных регионах Европейской части РФ, свидетельствуют, что она варьировала в пределах от 2,343±0,0384% до 9,139±0,1414%. Их минимальные концентрации нами отмечены в образцах, заготовленных в окр. г. Брянска, г. Витебска, отдельных местах произрастания в Ярославской области; а наиболее высокие - в образцах из окр. пос. Смирдомский Чагодощенского района Вологодской области, г. Мурманска, Республики Коми, г. Петрозаводска и других (табл. 5).
Выводы
Двумерной хроматографией на бумаге в траве вереска обыкновенного определено наличие 8 гидроксикоричных кислот, среди которых доминировала хлорогеновая кислота, с использованием которой в качестве стандартного вещества разработана методика количественного определения суммы кислот. При ее количественном определении в 36 образцах растения, собранных в 10 регионах РФ и в Республике Беларусь, обнаружено, что она, с одной стороны, варьировала в широких пределах в зависимости от места произрастания, а с другой, в известной мере прослеживалась тенденция к более высокому накоплению анализируемых веществ в северных регионах РФ.
ЛИТЕРАТУРА
1. А.П. Арзамасцев [ и др.] Новый способ идентификации многоатомных фенолов / А.П. Арзамасцев // Фармация. - 1994. -№2. - С.47-49.
2. Ареалы деревьев и кустарников СССР: в 3-х т. / С. А. Соколов [ и др.] - М., 1986. - Т.3. - 182 с.
3. Государственная фармакопея СССР, (XI изд.) - М.: Медицина, 1987. Т. 1 . - 336 с.; - Т. 2 - 397 с.
4. Жизнь растений: в 5 т. / под ред. А.Л. Тахтаджяна. - М., 1981. - Т. 5(2). - С. 92-95.
5. Зозуля Р.Н., Регир В.Г., Попко Я.И. Химические и фармакологические особенности вереска обыкновенного / Зозуля Р.Н. // Растит. ресурсы. - 1974. - Т.10, вып.2. - С. 247 - 248.
6. Коротаева М.С. Фармакогностическое изучение четырех видов рода Ledum L.: Автореф. дис. ... канд. фармац. наук. / Коротаева М.С. //. - Ярославль, 2006. - 23 с.
7. Мамчур Ф.І. [ и др.] Верес звичайний як лікарська рослина / Мамчур Ф.І. // Фармац. журнал. - 1986. - №4. - С. 70-71.
8. Растительные ресурсы СССР. Цветковые растения, их химический состав, использование. Семейства Paeoniaceae -Thymelaeaceae / отв. ред. П.Д. Соколов. - Л., 1986. - 336 с.
9. Tевс ВТ. Материалы к географическому распространению вереска обыкновенного / Tевс ВТ. // Вопр. фармакогнозии. -1964. - Вып. 2. - С. 29-37.
10.Флора СССР. Семейство вересковые - Ericaceae / под ред. В.Л. Кострова. - М.; Л.,1952. - T. 18. - С. 8-104.
QUANTITATIVE DETERMINATION OF THE SUM OF HYDROXYCINNAMIC ACIDS IN A GRASS HEATHER DACE OF DIFFERENT REGIONS
S.V. Onegin, N.S.Fursa
The chromatographic research of alcohol extraction of a grass heather is conducted, during which one it is revealed not less than 8 materials, basic of which the chlorogenic acid is. The technique of quantitative determination of the sum of hydroxycinnamic acids in a grass heather with allowance for of optimum conditions of abstraction is designed, on which one by us the contents of the sum of hydroxycinnamic acids in 36 samples of plant collected mainly in northern locales of an European part of Russian Federation is revealed.
