CC BY
102Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия «Биология, химия». Том 23 (62). 2010. № 2. С. 218-224.
УДК 576.851.315
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИОНОВ ЦИНКА И МЕДИ МЕТОДОМ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА
Абдураманова Э.Р., Федотова А.А., Кацев А.М.
Крымский государственный медицинский университет им. С. И. Георгиевского
E-mail: e.r.abduramanova@mail.ru
В работе использованы морские светящиеся бактерии Vibrio fischeri F1, Vibrio harveyi Ms1, Photobacterium phosphoreum F2 и Photobacterium leiognathi Sh1. Установлено, что наиболее чувствительным штаммом бактерий к ионам меди (II) и цинка является штамм P. phosphoreum F2. Сравнительное изучение действия ионов металлов на биолюминесценцию различных штаммов фотобактерий показало, что максимальной воспроизводимостью результатов измерений характеризуется штамм V. harveyi Ms1. Погрешность измерений всего диапазона определяемых концентраций анализируемых веществ находится в пределах 2 ^ 20%. Полученные в ходе исследования результаты свидетельствуют о возможности использования биолюминесцентного метода в аналитических целях при строгом соблюдении алгоритма проведения анализа. Ключевые слова: биотестирование, биолюминесцентный анализ, аналитические характеристики.
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время для анализа биоцидности (токсичности) широко применяют биотестирование. Для качественного и количественного определения токсических веществ используют инструментальные методы. В последнем случае о токсичности судят по превышению предельно допустимых концентраций токсикантов. Среди существующих биотестов особое место занимают морские светящиеся бактерии, которые сочетают в себе преимущества биотеста и инструментальных способов регистрации аналитического сигнала. В этом биотесте токсичность определяется по изменению интенсивности биолюминесценции, которая является количественным показателем жизнедеятельности бактериальной клетки и дает возможность оценить интегральное влияние среды на живой организм [1, 2].
Цель работы состояла в изучении аналитических характеристик биолюминесцентного метода биотестирования при количественном определении ионов тяжелых металлов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали морские светящиеся бактерии Vibrio fischeri F1, Vibrio harveyi Ms1 и Photobacterium phosphoreum F2, выделенные из Черного моря, а также бактерии Photobacterium leiognathi Sh1 - из Азовского моря [3]. Объектами исследования также были соли тяжелых металлов: хлориды цинка и меди (II), которые использовали в качестве модельных токсических веществ. Биотестирование проводили по методике определения острой токсичности, при комнатной температуре, в течение 15 минут с регистрацией интенсивности биолюминесценции с помощью биолюминометра БЛМ 8801, СКТБ «Наука», Россия [4]. Все исследования повторялись шестикратно, а результаты анализа представляли в виде эффективных концентраций солей, ингибирующих биолюминесценцию на определенное значение. Полученные результаты статистически обрабатывали с 95% доверительной вероятностью.
РЕЗУЛЬТАТЫ И обсуждение
Особенностью используемого метода, является сочетание биотестирования с инструментальным способом регистрации аналитического сигнала. Светящиеся бактерии сами по себе являются чувствительными индикаторами на различные вещества с токсическими, поверхностно-активными, антибактериальными и другими свойствами, реагируя изменением интенсивности биолюминесценции на различные воздействия [5-7]. Регистрация же излучений в видимой области спектра в настоящее время хорошо разработана и производится с высокой чувствительностью и точностью, что широко используется в различных областях химии и биологии [2]. В связи с этим, возникает возможность использовать этот биотест не только для оценки биологического действия, но и как универсальный аналитический метод количественного анализа. В качестве анализируемых веществ были выбраны две соли тяжелых металлов (CuCl2 ZnCl2), которые одновременно являются международными стандартами при работе со светящимися бактериями [4, 8].
Для определения аналитических характеристик биотеста использовали методику биолюминесцентного анализа на острую токсичность [4], по которой были определены эффективные концентрации токсического фактора. Результаты выражали в процентах от контрольных значений, по которым строили калибровочные графики зависимости интенсивности биолюминесценции (I) от концентрации образца (С) (рис. 1). Кривые имели двухфазный характер, который заключался в резком спаде биолюминесценции бактерий в интервале концентраций ингибитора от 0 до 5 - 20 мкг/мл в зависимости от штамма, и медленном - при дальнейшем возрастании концентрации тяжелых металлов. Средний коэффициент аппроксимации линейных участков калибровочных кривых ионов меди (II) и цинка с участием всех рассматриваемых штаммов бактерий (1 фаза кривой) составлял 0,95.
С использованием полученных калибровочных графиков определяли основные аналитические характеристики метода: пределы обнаружения, интервалы определяемых концентраций, воспроизводимость и точность измерений.
100 I, %
80 60 40 20 0
10
20 30
• ионы меди (II) —I
40
• ионы цинка
50 С ,60 С, мг/л
Рис. 1. Калибровочные графики зависимости интенсивности свечения бактерий V. Ьагуеу1 М81 от концентрации ионов Си2+ и 2и2+.
Результаты статистической обработки регистрируемых сигналов снижения интенсивности бактериального свечения, вызванного введением определенного количества токсического вещества, представлены в Таблице 1.
Таблица 1.
Статистические параметры данных калибровочных графиков
0
Си2+
V. fischeri P. phosphoreum Б2 V. harveyi МБ1 P. leiognathi 8Ы
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
С, мг/л I, % А, % С, мг/л I, % А, % С, мг/л I, % А, % С, мг/л I, % А, %
0,10 93 5,5 0,05 92 5,9 0,50 86 7,9 0,50 95 4,3
0,30 82 8,7 0,10 85 7,3 1,00 79 11,4 1,00 91 6,3
1,00 62 15,6 1,00 55 6,5 10,00 39 15,4 20,00 30 17,1
5,00 13 65,5 5,00 33 27,3 20,00 25 37,3 30,00 19 55,4
10,00 6 78,2 40,00 5 68,7 50,00 7 75,6 50,00 9 78,8
ги2+
V. fischeri P. phosphoreum Б2 V. harveyi мб1 P. leiognathi 8Ы
С, мг/л I, % А, % С, мг/л I, % А, % с, мг/л I, % А, % С, мг/л I, % А, %
0,50 96 3,4 0,1 93 2,7 0,50 96 20,7 0,50 95 4,4
1,00 90 4,5 0,5 71 9,7 1,00 82 14,1 5,00 56 11,6
10,00 53 10,8 1,00 63 24,3 5,00 33 8,8 10,00 32 17,0
20,00 40 22,5 20,00 6 43,5 10,00 19 82,4 20,00 14 47,8
70,00 4 61,7 30,00 5 81,5 40,00 4 113,1 40,00 4 71,8
Обнаружено повышение значений относительных ошибок измерений аналитического сигнала, отвечающего концентрации токсического фактора, находящейся в пределах второй фазы калибровочной кривой, которая характеризуется медленным снижением биолюминесценции (рис. 1). Максимальная воспроизводимость результатов характерна для линейных участков кривых, ограниченных в случае использования штаммов бактерий V. fischeri и .Р. phosphoreum Б2 50% - ным, а в случае V. harveyi М81 и Р. leiognathi 8Ь1 - 70 % - ным ингибированием биолюминесценции бактерий, относительные ошибки измерений которых не превышают 20%.
Критерием нижнего предела обнаружения анализируемых ионов металлов являлось стабильное снижение интенсивности сигнала, значение которого при использовании предложенных штаммов варьировало от 96% до 82% при вероятности (р) в пределах от 0,01 до 0,07. Верхний концентрационный предел ограничивался наименьшим сигналом 7%, отличным от нуля (р<0,05). Данные показатели и лимитировали интервал определяемых концентраций (табл. 2), хотя верхний предел обнаружения может быть в значительной степени повышен за счет простого разведения проб.
Таблица 2.
Интервал определяемых концентраций
Бактерии С, мг/л
Си2+ ги2+
V. 0,10 - 10 0,50 - - 70
Р. phosphorвum Б2 0,05 - - 40 0,10 - - 30
V. harvвyi МБ1 0,50 - 50 1,00 - - 40
Р. lвiognathi 8Ы 0,50 - 50 0,50 - - 40
Биотестирование с различными видами светящихся бактерий показало, что наиболее чувствительным к ионам меди (II) и цинка является штамм Р. phosphoreum Б2, для которого нижние пределы их обнаружения составляют соответственно 0,05 мг/л и 0,1 мг/л, а интервал определяемых концентраций находится в пределах от 0,05 мг/л до 40 мг/л для ионов меди (II) и от 0,1 мг/л до 30 мг/л для ионов цинка.
Аналитические характеристики унифицированных методов определения ионов меди (II) (полярография, колориметрия) и цинка (титриметрия) в воде, выбранных исходя из величин их предельно допустимых концентраций (ПДК), имеют следующие значения: нижние пределы обнаружения ионов меди (II) и цинка составляют соответственно от 0,01 до 0,05 мг/л (в зависимости от выбранного метода) и 0,5 мг/л, а верхние соответственно - 5 мг/л и 10 мг/л [9, 10]. Сравнительный анализ представленных данных показал, что разница в величинах значений нижнего предела обнаружений рассматриваемых ионов металлов для стандартных методов и предлагаемого не превышает 5 единиц, а интервал определяемых концентраций в биолюминесцентном методе значительно расширяется, в частности, в случае ионов меди (II) в 10 раз.
Дальнейшие исследования были связаны с определением значений эффективных действующих концентраций анализируемых ионов металлов, ингибирующих бактериальную биолюминесценцию на 50% (ЭК50), и являющихся критерием их токсичности. Величина ЭК50 находилась по калибровочному графику. Средние значения показателя ЭК50 (Х, мг/л), дисперсия (S2), среднеквадратичное отклонение (S), минимальные (Min, мг/л) и максимальные (Мах, мг/л) значения ЭК50, абсолютные (s, мг/л) и относительные (А, %) ошибки измерений представлены в Таблице 3.
Таблица 3.
Статистические характеристики значений ЭК50
Проба Штамм бактерий Х S2 S Мах Min s А, %
Cu2+ V. fischeri F1 1,8 0,35 0,59 2,3 1,0 0,6 32
P. phosphoreum F2 1,9 0,41 0,64 2,4 1,0 0,6 33
V. harveyi Ms1 7,2 0,58 0,76 8,0 6,5 0,9 12
P. leiognathi Sh1 10,3 4,33 2,08 12 8,0 2,4 23
Zn2+ V. fischeri F1 4,5 2,49 1,58 6,2 2,4 1,6 35
P. phosphoreum F2 3,2 1,01 1,01 4,0 2,0 1,4 45
V. harveyi Ms1 3,5 0,01 0,10 3,6 3,4 0,1 3
P. leiognathi Sh1 6,0 1,59 1,26 7,5 4,3 1,1 19
Данные статистической обработки величин ЭК50 свидетельствуют о хорошей воспроизводимости результатов анализа на основе штамма V. Нагувуг Ы81, для которого значения ЭК50 ионов меди (II) и цинка и относительные ошибки их измерений соответственно равны 7,2 мг/л ± 12% и 3,5 мг/л ± 3%.
Для оценки погрешности биотестирования с использованием светящихся бактерий, как метода количественного анализа, был проведен эксперимент «Внес-определил». Результаты исследования на примере тест-культуры Р. leiognathi 8Ь1 с использованием раствора хлорида цинка отражены в Таблице 4.
Таблица 4.
Оценка точности анализа
Внес, мг/л Определил, мг/л Относительная погрешность, %
5,00 5,33 ±7
6,00 6,17 ±3
7,00 6,86 ±2
8,00 8,44 ±5
10,00 12,00 ±20
Согласно экспериментальным данным точность измерений всего диапазона измеряемых концентраций анализируемых веществ, которая характеризуется величиной относительной погрешности, находится в пределах 2 20%. Высокий
показатель точности характерен для интервала концентраций, ограничивающих первую фазу калибровочных кривых, а максимальные отклонения результатов анализа от истинных значений имеют место в случае концентраций, отвечающих второй фазе калибровочных кривых.
ВЫВОД
Проведение биолюминесцентного анализа требует строгого соблюдения алгоритма экспериментальной работы, так как на чувствительность, точность и воспроизводимость результатов биотестирования посредством бактериальной биолюминесценции оказывает влияние множество факторов: процедура анализа, подготовка бактерий, период пробоподготовки, состав используемых реагентов и т.д. [9, 11]. Учет этих факторов позволит повысить перспективность использования тест-системы на основе фотобактерий в аналитических целях.
Список литературы
1. Improved detection of toxic chemicals using bioluminescent bacteria /S. Girotti, L. Bolelli, A. Roda [et al] // Anal. Chim. Acta. - 2002. - V. 471. - P. 113-120.
2. Monitoring of environmental pollutants by bioluminescent bacteria / S. Girotti, E.N. Ferri, M.G. Fumo [et al] // Ibid. - 2008. - V. 608. - P. 2-29.
3. Кацев А.М. Идентификация светящихся бактерий, выделенных из Черного и Азовского морей / А.М. Кацев, Дж. Макемсон // Ученые записки ТНУ им. В.И. Вернадского, серия «Биология, химия». - 2006. - Т. 19(58), № 4. - С. 111-116.
4. Microtox® bioassay Vibrio fischeri NRRL B-11177 // Ocean Sci. J. - 2005. - V. 40, № 2. - P. 91-100.
5. Sikkema J. Mechanisms of membrane toxicity of hydrocarbons / J. Sikkema, J. de Bont, B. Poolman // Microbiological reviews. - 1995. - Vol. 59, № 2. - P. 201-222.
6. Toxicity of the 13 priority pollutant metals to Vibrio fisheri in the Microtox chronic toxicity test / Hsieha Chi-Ying, Tsai Meng-Hsiun, Ryan David K.[et al] // The Science of the Total Environment. - 2004. -V. 320. - Р. 37-50.
7. Sarter S. Chemiluminescent and bioluminescent assays as innovative prospects for mycotoxin determination in food and feed / S. Sarter, N. Zakhia // Luminescence. - 2004. - № 19. - Р. 345-351.
8. Victor L.K. Jennings. Assessing chemical toxicity with the bioluminescent photobacterium (vibrio fischeri): a comparison of three commercial systems / Jennings Victor L.K., M.H. Rayner-Brandes, D.J. Bird // Wat. Res. - 2001. - V. 35, № 14. - P. 3448-3456.
9. Дмитриев М.Т. Санитарно-химический анализ загрязняющих веществ в окружающей среде / Дмитриев М.Т., Казнина Н.И., Пинигина И.А. - Справ. изд. - М.: Химия, 1989. - 368 с.
10. Унифицированные методы анализа вод. / [под общей ред. Ю.Ю. Лурье]. - М.: Химия, 1971. - 375 с.
11. Interlaboratory study of the bioluminescence inhibition tests for rapid wastewater tixicity assessment / M. Farre, F Arranz., J. Ribo [et al] // Talanta. - 2004. - V. 62. - P. 549-558.
Абдураманова Е.Р. Кшьккне визначення íohíb цинку i купруму методом бшлюмшесцентного анащзу / Е.Р. Абдураманова, А.О. Федотова, А.М. Кацев // Вчеш записки Тавршського нацюнального ушверситету ím. В.1. Вернадського. Серш „Бюлогш, xímím". - 2010. - Т. 23 (62). - № 2. -С. 218-224.
У робот! використат морсью бактери, що свпяться, Vibrio fischeri F1, Vibrio harveyi Ms1, Photobacterium phosphoreum F2 i Photobacterium leiognathi Sh1. Встановлено, що найбшьш чутливим штамом бактерш до юшв купруму (II) i цинку е штам P. phosphoreum F2. П^няльне вивчення до юшв металiв на бюлюмшесценцто рiзних штамтв фотобактерш показало, що максимальною вщтворюватстю результапв вимрювань характеризуемся штам V. harveyi Ms1. Погритсть вимрювань всього даапазону визначуваних
концентраций аналгзованих речовин знаходиться в межах 2 ^ 20%. Отримат в ход дослщження результати свщчать про необыдтсть дотримання строгого алгоритму при проведены бюлюмшесцентного аналгзу, який може бути використаний в аналгтичних щлях.
Ключовi слова: бютестування, бюлюмшесцентний анал1з, аналггичш характеристики.
Abduramanova E.R. Quantitative determination of zinc and copper (II) ions by the method of biotluminescent analysis / E.R. Abduramanova, A.O. Fedotova, A.M. Katsev // Scientific Notes of Tauiida V.Vemadsky National University. - Series: Biology, chemistry. - 2010. - V.23 (62). - № 2. - P. 218-224. The marine luminescent bacteria of Vibrio fischeri F1, Vibrio harveyi Ms1, Photobacterium phosphoreum F2 and Photobacterium leiognathi Sh1 were used. It was found, that the most sensible species of bacteria to the copper (II) and zinc ions were bacteria P. phosphoreum F2. The comparative study of metals ions action on bioluminescence of different species of photobacteria have shown, that the bacteria V. harveyi Ms1 were characterized by maximal reproducibility of the results. Measurement accuracy of the determined concentrations range of analyzing substances was within the limits of 2 ^ 20%. The results got during research have testified to the necessity of strict observance of the algorithm during the bioluminescent analysis that can be used in analytical aims.
Keywords: biotluminescent analysis, analytical characteristecs
Поступила в редакцию 18.05.2010 г.
