CC BY
208
УДК 543.544 Кубанский научный медицинский вестник № 3 (108) 2009
Г. Б. ГОЛУБИЦКИЙ
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХОЛЕКАЛЬЦИФЕРОЛА
В СИРОПЕ С КАЛЬЦИЕМ
ОАО «Фармстандарт-Лексредства», Россия, 305909, г. Курск, ул. 2-я Агрегатная, 1а/18, тел.: (47122) 6-01-65, 8-903-877-26-32. E-mail: iirogirg@narod.ru
Разработана экспрессная экстракционно-хроматографическая методика определения холекальциферола в детской лекарственной форме. Преимущество предлагаемой методики по сравнению с опубликованной другими авторами - техническая простота. Показано, что снижение температуры выпаривания экстракта позволяет исключить использование антиоксиданта и не требует инертной атмосферы. Доказаны достоверность и точность результатов, обеспечиваемых методикой. Методика использована при разработке технологии препарата и предложена для включения в нормативную документацию.
Ключевые слова: детская лекарственная форма, экспрессное определение, экстракционно-хроматографическая методика, температура выпаривания экстракта, достоверность и точность результатов.
G. B. GOLUBITCKII
QUANTITATIVE DETERMINATION OF CHOLECALCIFEROL IN CALCIUM SYRUP
JSC «Pharmstandard-Lecsredstva»,
Russia, 305909, Kursk, 2-d Agregatnaya str, 1a/18, tel.: (47122) 6-01-65, 903-877-26-32. E-mail: iirogirg@narod.ru
A method was developed for rapid extraction-chromatohraphic determination of cholecalciferol in child drug preparation. The advantage of this metod is technical simplicity in comparison with previously proposed by other authors. It was shown that decreasing extract evaporation temperature allow to avoid the use of anti-oxidant and inert atmosphere. The accuracy and precision of results were proved. This method was used in technology development and proposed for technical specification.
Key words: child drug preparation, rapid determination, extraction-chromatohraphic method, extract evaporation temperature, the accuracy and precision of results.
Введение
Сироп холекальциферола (витамина D3) с кальцием -оригинальный лекарственный препарат для детей, содержащий холекальциферол (ХК), кальция лактат глюконат, а также консерванты нипагин и нипазол. Для обеспечения качества препарата необходимы точные аналитические методики контроля его качественного и количественного состава. Наиболее сложной задачей является определение ХК - вещества, не устойчивого на свету и в присутствии кислорода [4], содержащегося в сиропе в относительно малой концентрации (1,25 мкг в 5 мл).
В таблице 1 представлены литературные данные по хроматографическому анализу жирорастворимых витаминов и их смесей. В работах [1, 7] проведена оптимизация разделения смеси, но количественный анализ не проводили. Публикации [2, 3] посвящены количественному анализу твердых форм поливитаминных препаратов, в которых содержание ХК в одной таблетке составляло от 5,0 до 12,5 мкг. Поскольку эти содержания в несколько раз выше, чем в дозе исследуемого сиропа, то и задача количественного определения относительно проще: испытуемые растворы могут быть приготовлены без концентрирования. При необходимости определения более низких концентраций возможно использование твердофазной экстракции. Эта процедура позволяет не только анализировать пробы с относительно низким содержанием ХК (концентрация испытуемого раствора 0,0004 мг/мл), но и провести предварительное разделение водо- и жирорастворимых витаминов. Недостатком такого подхода является низкая степень извлечения ХК - 73% [6]. В работе [5]
проведено определение жирорастворимых витаминов в молоке, причем концентрация ХК в пробах составила 0,00088 мкг/мл. Высокой чувствительности удалось достичь за счет применения капиллярной ВЭЖХ, а также концентрирования проб при помощи экстракции и выпаривания. Данный подход требует применения нестандартной аппаратуры (насос, обеспечивающий низкие расходы, детектор с микроячейкой). Кроме того, описанная процедура концентрирования относительно сложна (добавление антиоксиданта, выпаривание экстракта в потоке азота). Несмотря на отмеченные недостатки, такой способ пробоподготовки для определения относительно низких концентраций ХК представляется нам перспективным. В то же время, на наш взгляд, для методики серийного анализа фармацевтической продукции его следует упростить.
Решение этой задачи, представляющей научный и практический интерес, освещается в предлагаемой статье.
Методика исследования
В работе использовали жидкостный хроматограф Waters Alliance 2695 с диодно-матричным детектором 2996. Анализ проводили на колонке размером 125х4,0 мм с защитной предколонкой размером 8,0х4,0 мм, заполненных сорбентом Superspher RP 18 ec с размером частиц 4,0 мкм (Agilent Technologies). Использовали ацетонитрил, изопропиловый спирт и н-гексан «для хроматографии» фирмы «Мерк» (Германия), спирт этиловый ректификованный 96%-ный (сорт высший), сверхчистую воду из установки Direct Q5 (Millipore), а также действующие вещества препарата и консерванты фармацевти-
ческого качества с паспортом производителя. В качестве стандарта ХК использовали кристаллический препарат фирмы «Сигма» (США) с содержанием основного вещества согласно сертификату производителя 99,9%.
Для приготовления испытуемого раствора в делительную воронку вместимостью 250 мл помещали около 30,0 г (точная навеска) анализируемого сиропа, 25 мл воды, 50 мл спирта этилового ректификованного 96%-ного и перемешивали. Экстрагировали полученный раствор 50 мл н-гексана в течение 6 мин. После разделения фаз помещали водный раствор в такую же делительную воронку, органическую фазу - в коническую колбу вместимостью 250 мл. Экстракцию порциями по 50 мл н-гексана повторяли еще дважды по 3 мин и помещали экстракты в ту же коническую колбу. В объединенные экстракты добавляли 2 г натрия сульфата безводного, перемешивали и фильтровали полученный раствор в перегонную колбу роторного испарителя через бумажный фильтр «синяя лента». Промывали бумажный фильтр 20 мл н-гексана, присоединяя промывной раствор к раствору в перегонной колбе.
Выпаривали н-гексан при температуре водяной бани 40±2° С и остаточном давлении в перегонной колбе 0,6-0,7 атм. Нагревание прекращали сразу же по окончании отгонки растворителя. Сухой остаток растворяли в 5,0 мл подвижной фазы и фильтровали через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм.
Для приготовления раствора стандартных образцов (СО) в мерную колбу вместимостью 100 мл помещали 0,0200 г (точная навеска) ХК кристаллического, прибавляли 20 мл подвижной фазы и перемешивали до растворения вещества. Доводили полученный раствор подвижной фазой до метки и перемешивали. 1,0 мл полученного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 200 мл, доводили объем раствора подвижной фазой до метки, перемешивали и фильтровали через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм.
Разделение компонентов сиропа проводили в изок-ратическом режиме с использованием в качестве подвижной фазы смеси (4:1) ацетонитрил - изопропиловый спирт. Расход подвижной фазы составил 1,0 мл/ мин, объем пробы 50,0 мкл. Количество ХК в 5 мл анализируемого сиропа Х в микрограммах рассчитывали по формуле:
Эо* а0* р* 5*100 *106
Х =------------------------,
S0 * г * m * ф
где Б1 и Б0 - площади пика ХК на хроматограммах испытуемого раствора и раствора СО соответственно, в мкВ * с;
а0 - навеска кристаллического ХК, взятая для приготовления раствора СО, в граммах;
т - навеска анализируемого сиропа, взятая для анализа, в граммах;
р - плотность анализируемого сиропа, в г/мл;
г - коэффициент, учитывающий разведения растворов;
ф - степень извлечения ХК, в процентах.
Для определения степени извлечения ХК из раствора раствор СО готовили аналогично испытуемому, но в делительную воронку вместо сиропа добавляли 5,0 мл раствора СО ХК. Степень извлечения ХК из раствора Y в процентах определяли по формуле:
^отг * соо ^
Y =------------* 100 =----------* 100,
^ * с Э
ОО отг исх
где Ботг и БСО - средние значения площадей пиков ХК на хроматограммах, полученных для растворов СО, прошедшего все стадии пробоподготовки и исходного соответственно;
Таблица 1
Анализ смесей жирорастворимых витаминов хроматографическими методами
Вещество (образец) Колонка, мм Сорбент (размер, мкм) Подвижная фаза (расход, мл/мин) ^ °О Детектор (условия) Лит.
А (ацетат), D2, D3, Е, Е (ацетат), К1 150х4,6 УМО-раек ODS-/K (95:5) ОН3ОН - вода (68:32) ТГФ - вода (1,8) 30 ДМ (280 нм) [7]
А, D3, Е, К3 64х2,0 Силасорб С18 (5,0) (30:70) вода - изо-С3Н7ОН СФ (254 нм) [4]
А (I), D (II), Е (III) (таблетки) 120x2,0 Сепарон SCX (5,0) (99:1) СН3ОН - вода СФ (I - 326 нм, II - 264 нм, III - 286 нм) [2]
А (I), D2 (II), D3 (III) (капсулы, премиксы) 75x2,0 №с1еовП 100-5 О18 (5,0) (95:5) ОН^ - вода 35 СФ (I - 290 нм; II, III - 260 нм) [1]
А, D3, Е 150x3,9 ^эуа-Рак С18 (4,0) (95:5) СН3ОН - СН^ (2,0) СФ (285 нм) [6]
А (I), D2 (II), Dз (III), Е (IV), К (V) (молоко) 150x0,3 НурегвИ BDS О18 (3,0) А: (99:1) ОН3ОН - вода; Б: (70:30) ОН3ОН - ТГФ; градиент от 0 (0-4 мин) до 100 об. % Б за 6 мин (0,006) 20 СФ (I - 325 нм; II, III - 264 нм; IV, V - 280 нм) [5]
Примечание: СФ - спектрофотометрический; ДМ - диодно-матричный; ТГФ - тетрагидрофуран; все соотношения приведены по объему, если не указано иное.
Кубанский научный медицинский вестник № 3 (108) 2009
Кубанский научный медицинский вестник № 3 (108) 2009
Таблица 2
Метрологические характеристики методики количественного определения холекальциферола в сиропе с кальцием (п=51; Р=0,95)
втах в2 тах £ , % тах е , % г ср’ Дег % е , % г тах К корр
6,328 * 10-2 4,004 * 10-3 16,48 -0,526 0,641 5,761 0,987
Таблица 3
Результаты определения холекальциферола в сиропе с кальцием (п = 9; Р = 0,95)
Содержание по НД, мкг/5 мл Образец хср в вхср ^хср £,%
1 1,570 7,80 * 10-2 1,84 * 10-2 3,86 * 10-2 2,46
1,00-1,75 2 1,515 4,50 * 10-2 1,06 * 10-2 2,23 * 10-2 1,47
3 1,497 4,80 * 10-2 1,13 * 10-2 2,38 * 10-2 1,59
сотг = сСО - концентрация раствора СО ХК, в мг/мл. Для определения суммарной степени извлечения ХК в делительную воронку вместо сиропа добавляли соответствующее количество используемой субстанции - премикса ХК и далее проводили анализ по методике. Суммарную степень извлечения ф в процентах определяли по формуле:
Б * с
прем СО
• * 100,
Б * с
СО прем
где Б и Б..
т прем СО
средние значения площадей пиков ХК на хроматограммах, полученных для растворов пре-микса, прошедшего все стадии пробоподготовки, и исходного раствора СО соответственно;
спрем и сСО - концентрации ХК в растворе премикса, прошедшего все стадии пробоподготовки (рассчитана согласно значению в сертификате производителя), и исходного раствора СО соответственно, в мг/мл.
Для подтверждения достоверности получаемых результатов готовили и анализировали модельные растворы, содержащие ХК, и все остальные компоненты препарата (плацебо). Диапазон концентраций ХК в модельных растворах составил от 60 до 160% от заявленного количества.
Результаты и их обсуждение
Частицы порошка субстанции представляют собой капельки раствора витамина D3 в арахисовом масле диаметром 1-2 мкм, включенные в матрицу из желатина и сахарозы с оболочкой из модифицированного крахмала [4]. В связи с этим при растворении в воде, водно-органическом или органическом растворителе субстанция образует коллоидный раствор. Как показали наши эксперименты, фильтрация полученных мутных растворов через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм не позволяет получить истинные растворы ХК, так как коллоидные частицы субстанции проходят через поры фильтра. В связи с этим для получения раствора ХК необходима стадия экстракции органичес-
ким растворителем, не смешивающимся с водой, с последующим выпариванием экстракта и растворением сухого остатка в полярном растворителе. Такой подход позволяет не только получить истинный раствор ХК, но и произвести его концентрирование [5].
В методике [5] выпаривание экстрагента проводят в токе азота в присутствии антиоксиданта - бутилгидрок-ситолуола. Как показали проведенные нами эксперименты, данный процесс может быть упрощен и проведен без введения антиоксиданта и без создания инертной атмосферы. В то же время для предотвращения термического разложения определяемого вещества и получения стабильных результатов температура экстракта при вакуумной отгонке не должна превышать 40° С. При таких условиях степень извлечения ХК из раствора У составила 102,8%, то есть с учетом возможной погрешности эксперимента получен стопроцентный результат.
Согласно нашим данным, суммарная степень извлечения ХК ф составила 90,2%. Эта величина может свидетельствовать об одном из трех фактов (или обо всех одновременно). Во-первых, содержание ХК в суб-станции-премиксе с момента ее изготовления могло снизиться, и величина, указанная в сертификате, не соответствовала фактической. Во-вторых, не весь ХК мог извлечься из премикса в процессе анализа. В-третьих, в соответствии с информацией, приведенной в компендиуме [8], ХК может находиться в двух формах. Это прехолекальциферол и трансхолекальциферол (основная форма). Определение обеих форм возможно в условиях нормально-фазовой хроматографии, приведенных в [8]. В обращенно-фазовых условиях определяется только трансформа, но соответствующая методика проще и удобнее для серийного контроля.
Поскольку полученные значения ф от опыта к опыту воспроизводились, мы включили данную величину в расчетную формулу методики, а также использовали в расчетах правильности по методу «введено - найдено».
При исследовании условий хроматографирования ХК в обращенно-фазовой системе было установлено, что приемлемые результаты (полное отделение пика ХК от других компонентов сиропа при длительности
Ф
Рис. 1, а, б. Хроматограмма испытуемого раствора сиропа для определения холекальциферола:
1 - консерванты + сорбит; 2 - холекальциферол
а
б
одной хроматограммы 7-10 мин) можно получить при использовании в качестве подвижной фазы метанола или ацетонитрила. Ацетонитрил более предпочтителен в связи с меньшей токсичностью и меньшим поглощением в в ультрафиолетовой области спектра. В то же время подвижная фаза на основе 100%-ного ацетонитрила не обеспечивает стабильности потока. Было установлено, что ситуация исправляется при добавлении в подвижную фазу изопропилового спирта. По этой причине в работе использовали смесь (4:1) ацетонитрил - изопропиловый спирт.
Детектирование вели при длине волны, соответствующей максимуму поглощения ХК в подвижной фазе (265 нм). Хроматограмма испытуемого раствора сиропа представлена на рисунке 1, а, б.
Результаты анализа модельных растворов суммированы в таблице 2. При определении ХК среднее значение относительной погрешности егср меньше соответствующего доверительного интервала Дег. Следовательно, систематическая погрешность анализа отсутствует. Диапазон определяемых концентраций составил от 0,75 до 2,0 мкг ХК в 5 мл сиропа. Площадь пика ХК в этом диапазоне линейно зависит от его концентрации (Ккорр > 0,98). По-видимому, с помощью предлагаемой методики можно определить более низкие концентрации ХК, но проверка этого предположения выходит за рамки настоящей работы.
По предлагаемой методике были проанализированы три образца сиропа. Полученные результаты представлены в таблице 3. Все образцы соответствуют требованиям нормативной документации, результаты анализа имеют удовлетворительную воспроизводимость.
Таким образом, разработанная методика позволяет получить достоверные и точные результаты содержания ХК в сиропе с кальцием. Достоинство методики - техническая простота по сравнению с аналогом, описанным в литературе [5], при сохранении достоверности и точности результатов. Методика экспрессна:
время пробоподготовки составляет около 30 мин, одного разделения - около 10 мин.
Методика использована при разработке технологии препарата и предложена для включения в проект нормативной документации.
ЛИТЕРАТУРА
1. Денисова Л. В., Филимонов В. Н., Балятинская Л. Н., Колосова И. Ф. Хроматографическое поведение жирорастворимых витаминов в режиме обращенно-фазовой жидкостной хроматографии с подвижной фазой вода - изопропанол // Ж. аналит. химии. -1997. - Т. 52. № 9. - С. 967-969.
2. Кожанова Л. А, Федорова Г. А, Барам Г. И. Определение водо- и жирорастворимых витаминов в поливитаминных препаратах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Ж. аналит. химии. - 2002. - Т. 57. № 1. - С. 49-54.
3. Козлов Э. И., Солунина И. А, Любарева М. Л., Надточий М. А. Определение витаминов А, D, Е в поливитаминных препаратах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии // Хим. фарм. журнал. - 2003. - Т. 37. № 10. - С. 50-53.
4. Продукты для фармацевтической и пищевой промышленности: техническая информация / Фирма BASF, 1996. - С. 43.
5. Gomis D. B., Fernández M. P., Gutiérrez Alvarez M. D. Simultaneous determination of fat-soluble vitamins and provitamins in milk by microcolumn liquid chromatography // J. Chromatogr. A. -2000. - V. 891. № 1. - P. 109-114.
6. Moreno P., Salvado V. Determination of eight water- and fat-soluble vitamins in multi-vitamin pharmaceutical formulations by highperformance liquid chromatography // J. Chromatogr. A. - 2000. -V. 870. № 1-2. - P. 207-215.
7. Nsengiyumva C., de Beer J. O., Van de Wauw W., Vlietinck A. J., de Swaef S., Parmentier F. Optimization of solvent selectivity for the chromatographic separation of fat-soluble vitamins using a mixture-design statistical technique // Chromatographia. - 1998. - V. 47. № 7/8. - P. 401-412.
8. USP30 - NF25. The United States Pharmacopeia & National Formulary // The United States Pharmacopeial Convention. - 2006. - P. 1742.
Поступила 19.03.2009
Кубанский научный медицинский вестник № 3 (108) 2009
