CC BY
51ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
© Ю.Ю.ФИЛИППОВА, А.Л.БУРМИСТРОВА, 2017
Ю.Ю.Филиппова, А.Л.Бурмистрова
КОГНИТИВНАЯ ОСЬ СТАРОСТИ: ВОСПАЛЕНИЕ - МИКРОБИОТА ТОНКОГО КИШЕЧНИКА
Челябинский государственный университет
Цель. Выявить взаимосвязь когнитивной дисфункции у людей пожилого возраста с системным воспалительным профилем и структурой микробиоты тонкого кишечника. Материалы и методы. В исследование были включены 42 человека пожилого возраста. По результатам оценки психического статуса все обследованные были разделены на 2 группы: 20 человек с умеренными когнитивными расстройствами — группа «активное долголетие» и 22 человека, с выраженной когнитивной недостаточностью — группа «милосердие». У всех лиц пожилого возраста определяли системный воспалительный статус и структуру и количественный состав микробиоты тонкого кишечника с помощью метода газовой хроматографии масс-спектрометрии микробных маркеров. Результаты. Определена взаимосвязь между системным уровнем цитокинов и структурой микробиоты тонкого кишечника у людей пожилого возраста с разным когнитивным статусом. Впервые обнаружены значимые корреляции между концентрацией провоспалительного цитокина интерлейки-на-6 в плазме крови, количеством микроорганизмов Propionibacterium jensenii, Moraxella spp., Bacillus cereus и Fusobacterium spp. в тонком кишечнике и степенью выраженности когнитивной несостоятельности у лиц пожилого возраста. Заключение. Полученные показатели могут быть использованы в качестве предиктовых биомаркеров когнитивной дисфункции у пожилых людей.
Журн. микробиол., 2017, № 5, С. 3—9
Ключевые слова: цитокины, микробиотатонкого кишечника, пожилые люди, когнитивная несостоятельность
Yu. Yu.Filippova, A.L.Burmistrova
COGNITIVE AXIS OF AGING: INFLAMMATION - MICROBIOTA OF SMALL INTESTINE
Chelyabinsk State University, Russia
Aim. Detect connection between cognitive dysfunction in senior people with systemic infection profile and small intestine microbiota structure. Materials and methods. 42 senior individuals were included into the study. All the examined have been divided into 2 groups based on the results of psychic status: 20 individuals with moderate cognitive disorders — «active longevity» group and 22 individuals with pronounced cognitive deficiency — «mercy» group. Systemic inflammation status and structure and quantitative composition of microbiota of small intestine was determined in all the senior individuals using gas chromatography mass-spectrometry of microbial markers. Results. Interconnection between systemic level of cytokines and microbiota structure of small intestine in senior people with various cognitive status was determined. Significant correlations between levels of pro-inflammatory cytokine IL-6 in blood plasma and quantity of Propionibacterium jensenii, Moraxella spp., Bacillus cereus and Fusobacterium spp. in small intestine and the degree of cognitive failure were detected for the first time. Conclusion. The parameters obtained could be used as predictive biomarkers of cognitive dysfunction in senior people.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2017, No. 5, P. 3-9
Keywords: cytokines, small intestine microbiota, senior people, cognitive failure ВВЕДЕНИЕ
Старение — это естественный мультифакторный феномен, характеризующийся накоплением дегенеративных процессов, которые, в свою очередь, поддерживаются многочисленными изменениями или повреждениями молекулярных механизмов клеточных функций [13]. Одним из наиболее известных эффектов старения является нарушение регуляции функций иммунной системы в результате дефектов в инициации и завершении иммунных реакций — иммунное старение. Иммунное старение сопровождается низко-градуированным хроническим провоспалительным состоянием во многих тканях, характеризующимся повышенной продукцией провоспалительных цитокинов, таких как IL-6 и TNF-a, острофазовых белков, активных форм кислорода и аутоантител. Это провоспалительное состояние является весьма существенным фактором риска развития патофизиологических процессов и смертности среди пожилых людей, так как большинство, если не все, воз-раст-ассоциированные заболевания, включая нейродегенеративные (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, рассеянный склероз и деменция), имеют воспалительный патогенез [Franceschi С. et al., 2014]. В настоящее время «провоспалительный профиль старости» все чаще связывают с изменением композиции кишечной микробиоты при старении [Kim К.А. et al., 2016]. Выдвинута концепция и растет количество доказательств, что микробиота кишечника, иммунная, эндокринная, автономная нервная и кишечная нервная системы, образуя взаимозависимые сетевые системы, формируют ось «микробиота-кишечник-мозг» [4]. Несмотря на значительное количество работ, посвященных изучению функциональных изменений оси «микро-биота-кишечник-мозг» в течение жизни, а именно при решении таких вопросов, как здоровье/болезнь/старение организма, развитие когнитивных нарушений и возраст-ассоциированных заболеваний, большинство исследований сосредоточено на изучении фекальной микробиоты толстого кишечника. В то же время, в последние 10 лет представлен ряд доказательств о фундаментальной роли тонкого кишечника (ТК) и его эндогенной микробиоты в физиологии человека: 1) в метаболическом статусе — в ТК происходят основные события переваривания и абсорбции питательных веществ, которые обеспечивают приблизительно 90% общей энергии, получаемой из пищи; 2) в иммунном гомеостазе — большая масса лимфоидной ткани (кишечно-ассоциированная лимфоидная ткань и Пейеровы бляшки), представленной в подвздошной кишке, гарантирует ^функционирование микробиоты и иммунной системы хозяина в мутуалистическом режиме [5].
Как обсуждается в последние годы, кишечная микробиота способна влиять практически на все функции организма, в том числе, выступать в качестве модулятора пластичности мозга, его когнитивных функций и в целом поведения персоны в ходе старения [9]. Вопрос о том, влияет ли хроническое воспаление на изменение структуры микробиоты или изменения композиции кишечной микробиоты при старении и развитии возраст-ассоциированных заболеваний приводят к «провоспалительному профилю старости», остается открытым. В данной работе мы оценили взаимосвязь между системным воспалительным профилем и структурой микробиоты тонкого кишечника у пожилых людей с разным ментальным статусом.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В исследование были включены 42 человека пожилого возраста, проживающих в Челябинском геронтологическом центре. Средний возраст обследованных составил 79+5 лет. Всем пожилым людям врачами-клиницистами центра был проведен мониторинг когнитивных нарушений с использованием шкалы «Mini Mental State Examination» и классификации стадий дисциркуля-торной энцефалопатии Н.Н. Яхно и др. (2003). По результатам оценки психического статуса все обследованные были разделены на две группы: 20 человек с умеренными когнитивными расстройствами — группа «активное долголетие» (А/Д) и 22 человека с выраженной когнитивной недостаточностью, проявляющейся, в основном, сосудистой деменцией — группа «милосердие» (М). Пожилые люди обеих групп имели одинаковые возраст-ассоциированные заболевания: кардиоваскулярные, бронхолегочные, заболевания желудочно-кишечного тракта и опорно-двигательного аппарата. При этом из исследования были исключены индивидуумы с ожирением, онкологическими заболеваниями, болезнью Паркинсона и Альцгеймера, врожденными нарушениями центральной нервной системы.
Группу сравнения составили случайным образом отобранные 19 штатных доноров крови Челябинской областной станции переливания крови — группа «доноры» (Д). Средний возраст — 39+4 года. Исследование было одобрено этическим комитетом Челябинского государственного университета (протокол № 1 от 16.05.2016.). Все индивидуумы, которые согласились принять участие в исследовании, подписали форму информированного согласия перед процедурой взятия крови.
Концентрацию цитокинов IL-1(3, IL-18, IL-6, IL-10, IFN-уи TNF-a оценивали в плазме крови методом твердофазного иммуноферментного анализа наборами реагентов ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск).
Для изучения структуры и количественного состава микробиоты тонкого кишечника определяли специфические химические маркеры микроорганизмов (жирные кислоты, альдегиды, спирты и стерины) непосредственно в периферической крови с помощью метода газовой хроматографии масс-спектрометрии микробных маркеров (ГХ-МСММ), который позволяет выявить более 50 родов/видов микроорганизмов [10]. Метод детектирования микроорганизмов по маркерным жирным кислотам сходен с генетическим анализом, поскольку состав жирных кислот детерминирован в ДНК. Это обстоятельство определяет возможность родового или видового анализа инфекций и дисбиозов на преобладающем фоне биологической жидкости непосредственно в клиническом материале [8]. Приготовление образцов и подсчет результатов проводили, как описано в [10]. Сорок микролитров крови высушивали при добавлении равного по объему количества метанола и подвергали кислому метанолизу в 1М НС1 в метаноле в течение 1 часа при 80°С. На этой стадии происходило освобождение жирных кислот и альдегидов из сложных липидов микроорганизмов и других клеток и жидкостей в виде метиловых эфиров и диметилацеталей. Эти компоненты двукратно экстрагировали 200 мкл гексана, высушивали и обрабатывали в течение 15 мин при 80°С 20 мкл N,0-6hc (триметилсилил)-трифторацетамидом для получения триметилси-лильных эфиров окси-кислот и стиролов. Полученную смесь эфиров вводили в инжектор газового хроматографа Маэстро ГХ 7820 (ООО «Интерлаб», Россия) с масс-селективным детектором Agilent Technologies 5975 (США). Образец был хроматографически разделен на капиллярной колонке HP-5ms Hewlett-Packard. Условия хроматографического разделения: начальная температура
130°С, выдержка при начальной температуре 0,5 мин, нагрев температуры со скоростью 70/мин до 320°С, выдержка при конечной температуре 6 мин. Режим селективных ионов. Газ-носитель гелий, поток 1,2 мл/мин в режиме без деления потока. В результате проведенных исследований получали хромато-граммы жирных кислот и других продуктов жизнедеятельности микробных сообществ тонкого кишечника, которые были соотнесены с соответствующим типом и количеством микроорганизмов с помощью программы, разработанной Осиповым Г.А. [10]. В качестве внутреннего стандарта использовали дейтерометиловый эфир тридекановый кислоты. Чувствительность метода составляет 104 КОЕ/мл.
В ходе статистической обработки данных использовали порядковые статистики и критерии: для оценки центральной тенденции — расчет медиан и 25 — 75 квартилей, для оценки значимости межгрупповых различий — критерий Краскела — Уоллиса с апостериорными парными сравнениями по Ко-новеру — Инману. Различия считали статистически значимыми при р<0,001. В качестве разведывательной техники был применен многомерный экспло-раторный анализ методом нелинейных главных компонент для количественных показателей по алгоритму САТРСА. Все расчеты выполнены в пакетах SPSS for Windows (v. 15.0., SPSS Inc.).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для определения системного воспалительного профиля был измерен уровень цитокинов IL-10, IL-18, IL-6, IL-10, IFN-y и TNF-a в плазме крови доноров и пожилых людей с наличием/отсутствием когнитивной недостаточности. Результаты показали, что у пожилых людей, вне зависимости от когнитивного статуса, был значимо повышен системный уровень IL-6 и TNF-a по сравнению с аналогичными показателями здоровых доноров. При сравнении лиц пожилого возраста с наличием/отсутствием когнитивной дисфункции обнаружено, что у людей с выраженной когнитивной несостоятельностью (группа М) наблюдается статистически значимое повышение концентрации IL-6 в плазме крови, по сравнению с индивидуумами группы без когнитивных расстройств (группа А/Д). В уровнях остальных цитокинов статистически значимых различий не обнаружено.
Изучение структуры и количественного состава микробиоты тонкого кишечника на основе определения специфических липидных маркеров микроорганизмов в периферической крови показало, что у пожилых людей наблюдается дефицит общего числа изученных микроорганизмов в тонком кишечнике, достигая статистической значимости для группы людей с когнитивной недостаточностью (2,3х109 КОЕ/мл: 2,4х109 КОЕ/мл: 2,8х109 КОЕ/мл для групп М: А/Д: Д соответственно). Данный дефицит был обусловлен значимым снижением количества микроорганизмов типа Actinobacteria, а также тенденцией к снижению числа бактерий типа Firmicutes. Количество микроорганизмов типа Fusobacteria, наоборот, было статистически значимо повышено у людей группы «милосердие», по сравнению с аналогичным показателем группы «доноров». В тонком кишечнике пожилых людей группы «активное долголетие» также был повышен уровень бактерий типов Bacte-roidetes и Proteobacteria по сравнению с результатами здоровых индивидуумов. При сравнении показателей у людей пожилого возраста с разным когнитивным статусом значимые различия наблюдались только в количестве представителей типа Fusobacteria, которое было понижено в группе пожилых людей с выраженной когнитивной дисфункцией.
Для оценки взаимосвязи и интегрального вклада цитокинов плазмы крови и структуры сообщества бактерий тонкого кишечника в различия между группами молодых лиц и пожилых людей с разным когнитивным статусом был использован нелинейный анализ главных компонент по алгоритму САТРСА с наложением на показатели данных о разделении групп в зависимости от возраста (молодые/пожилые) и степени когнитивных расстройств (с наличием/отсутствием когнитивной недостаточности). В результате анализа главных компонент были выделены три паттерна взаимосвязанных показателей (ГК1, ГК2, ГКЗ), объясняющие в сумме 37,2% общей изменчивости показателей.
В первый паттерн (ГК1), объясняющий 15,9% общей дисперсии, с высокой силой связи (>0,5) вошли показатели цитокинов плазмы крови IL-6 и TNF-a и представителей микробиоты тонкого кишечника Prevotella spp., Bifidobacterium spp., Eubacterium spp., Clostridium perfringens, Bacillus cereus, Fusobacterium spp. и Alcaligenes spp. Показатели, вошедшие в этот паттерн, позволяют разделить обследуемых людей на молодых доноров и лиц пожилого возраста (вне зависимости от когнитивного статуса). При этом показатели Bifidobacterium spp. и Eubacterium spp. были статистически значимо снижены, а остальные показатели первого паттерна — значимо повышены в группах пожилых людей, по сравнению с данными группы доноров.
Основу второго паттерна (ГК2; 11,2% общей изменчивости показателей) составили показатели цитокинов плазмы IL-ip, IL-18 и IL-10, имеющие высокую силу корреляционных связей между собой (значения показателей >0,9) и низкую корреляцию с показателями микробиоты тонкого кишечника.
Третий паттерн взаимосвязанных показателей (ГКЗ; 10,1% общей дисперсии) позволил разделить пожилых людей в зависимости от когнитивного статуса. В него с высокой положительной нагрузкой вошли показатели IL-6, Lactobacillus spp., Staphylococcus aureus и Campilobacter mucosalis; с высокой отрицательной нагрузкой — Corynebacterium spp., Propionebacterium jensenii и Moraxella spp., а также В. cereus и Fusobacterium spp. — со средней силой связи. При этом уровень IL-6 был статистически значимо повышен, а количество микроорганизмов P. jensenii, Moraxella spp., В. cereus и Fusobacterium spp. значимо снижено у людей с выраженными когнитивными расстройствами (группа М) по сравнению с лицами пожилого возраста без значительных когнитивных нарушений (группа А/Д). Изменения остальных показателей, вошедших в третий паттерн, не достигали статистической значимости.
ОБСУЖДЕНИЕ
В этой статье мы рассмотрели возраст-ассоциированные различия в системном воспалительном статусе и структуре микробиоты тонкого кишечника, а также вклад данных показателей в развитие когнитивной недостаточности у пожилых людей. Нами обнаружено статистически значимое повышение системного уровня провоспалительных цитокинов (IL-6 и TNF-a) у пожилых людей, что согласуется с концепцией развития с возрастом системного хронического низкоградуированного воспаления [Franceschi С. et al., 2014]. Системный воспалительный уровень этих цитокинов у лиц пожилого возраста коррелировал с изменением структуры сообщества микробов тонкого кишечника: наблюдалось снижение количества бактерий типов Firmicutes (особенно бактерий рода Eubacterium spp.) и Actinobacteria (рода Bifidobacterium spp.), по сравнению с молодыми донорами. Освободившуюся нишу заняли микроорганизмы типов Fusobacteria, Bacteroidetes и Proteobacteria. Таким образом, нами показано, что в тонком кишечнике пожилых людей также, как и
в фекальной микробиоте [12], происходит изменение соотношения типов Bacteroidetes/Firmicutes в сторону увеличения Bacteroidetes. Снижение количества бифидобактерий, которые являются важными пробиотиками, участвующими в поддержании гомеостаза кишечника и предотвращении инфекции [2], и увеличение числа «патобионтов», таких как С. perfringens, В. cereus, Fusobacterium spp. и Alcaligenes spp., может являться ответом на системное воспаление или одним из его триггеров [7]. Интересно отметить, что показатели микробиоты тонкого кишечника имели корреляционные связи только с IL-6 и TNF-a, тогда как системный уровень остальных исследуемых цитоки-нов (IL-lß, IL-18 и IL-10 и IFN-y) образовывал обособленный кластер, абсолютно не взаимосвязанный со структурой микробиоты.
При сравнении уровня системного воспаления в группах людей пожилого возраста обращает на себя внимание, что у пожилых людей без серьезных когнитивных нарушений концентрация в плазме всех исследуемых цитокинов (как провоспалительных, так и IL-10) была выше, чем у доноров, т.е. можно говорить о «сбалансированном» хроническом низкоградуированном воспалении. Для лиц пожилого возраста с выраженными когнитивными расстройствами характерен высокий уровень только провоспалительных цитокинов IL-6 и TNF-a, по сравнению с донорами, концентрация остальных исследуемых цитокинов была ниже или равна показателям доноров. Обращает на себя внимание, что у индивидуумов с выраженными когнитивными нарушениями обнаружен статистически значимо высокий системный уровень IL-6, по сравнению с пожилыми людьми без когнитивной дисфункции. Известно, что высокий системный уровень IL-6 является сильным предиктором развития сердечно-сосудистых заболеваний, сосудистой деменции и смертности у людей пожилого и старческого возраста [3]. Ранее нами было показано [1], что такая воспалительная реакция может быть обусловлена, в том числе, эндокринными изменениями: в ответ на физиологический уровень адренокорти-котропного гормона у пожилых людей с сосудистой деменцией вырабатывается избыточное количество кортизола. По данным Gupta D. et al. это может привести к развитию хронического стресса и к дестабилизации областей мозга, отвечающих за когнитивные функции (префронтальной коры, паравен-трикулярных нейронов, гипокампа). Такие изменения, в свою очередь, могут способствовать развитию депрессии, когнитивных расстройств и болезни Альцгеймера у пожилых людей [6].
Филотипическая структура микробиоты тонкого кишечника в целом не отличалась в разных группах пожилых людей, однако наблюдались значимые различия в видовом/родовом составе: количество микроорганизмов P. jensenii, В. cereus, Moraxella spp. и Fusobacterium spp. было значимо снижено у людей с выраженными когнитивными расстройствами. Наибольший интерес представляют данные о снижении числа Р. jensenii, которые наряду с Propione-bacterium fredenreichii выделяют вещества, обладающие противовоспалительными, антибактериальными и антимутагенными свойствами, а также участвует в производстве пропионовой кислоты и витамина В12, дефицит которого может приводить к неврологическим расстройствам [11]. Полученные нами результаты позволяют предположить, что сигнатура бактериального сообщества тонкого кишечника в ассоциации с высоким системным уровнем IL-6 и когнитивной несостоятельностью у пожилых людей могут презентовать функциональную ось: микробиота тонкого кишечника-иммунная система-мозг. Кроме того, полученные нами показатели могут быть использованы в
качестве биомаркеров для диагностики нарушений когнитивной несостоятельности в пожилом возрасте и для конструирования психобиотиков на основе нейроактивных компонентов и штаммов пробиотиков, способных снижать уровень провоспалительных цитокинов.
ЛИТЕРАТУРА
1. БурмистроваА.Л., ФилипповаЮ.Ю., МихайловаА.С. Нейро-иммуноэндокриннаяось улюдей пожилого возраста с разным качеством жизни. Российский иммунологический журнал. 2015, 9(18): 198-200.
2. Бухарин О.В., Иванова Е.В., Перунова Н.Б. и др. Метаболический профиль бифидоф-лоры при различных микроэкологических состояниях биотопа толстого кишечника человека. Журн. микробиол. 2017, 1:3-11.
3. Bruunsgaard Н. Effects of tumor necrosis factor-alpha and interleukin-6 in elderly populations. Eur. Cytokine Netw. 2002, 13 (4): 389-391.
4. Collins S.M., Surette M., Bercik P. The interplay between the intestinal microbiota and the brain. Nat. Rev. Microbiol. 2012, 10 (11): 735-742.
5. El Aidy S., van den Bogert В., Kleerebezem M. The small intestine microbiota, nutritional modulation and relevance for health. Curr. Opin. Biotechnol. 2015, 32: 14-20.
6. Gupta D., Morley J.E. Hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis and aging. Compr. Physiol. 2014,4(4): 1495-1510.
7. Hollister E.B., Gao C., Versalovic J. Compositional and functional features of the gastrointestinal microbiome and their effects on human health. Gastroenterology. 2014, 146 (6): 14491458.
8. Larsson L. Determination of microbial chemical markers by gas chromatography-mass spectrometry — potential for diagnosis and studies on metabolism in situ. APM1S. 1994,102:161169.
9. Leung K., Thuret S. Gut microbiota: A modulator of brain plasticity and cognitive function in aging. Healthcare. 2015, 3 (4): 898-916.
10. Osipov G.A., Boiko N.B., Fedosova N.F. et al. Comparative gas chromatography-mass spectrometry study of the composition of microbial chemical markers in feces. Microbial. Ecol. Health Dis. 2009,21: 159-171.
11. Rai R.V., Bai J.A. Beneficial microbes in fermented and functional foods. CRC Press. 2015, 551-571.
12. Saraswati S., Sitaraman R. Aging and the human gut microbiota—from correlation to causality. Front. Microbiol. 2014, 5: 764.
13. Wagner K.H., Cameron-Smith D., Wessner B. et al. Biomarkers of aging: From function to molecular biology. Nutrients. 2016, 8 (6): 338.
Поступила 25.05.17
Контактная информация: Филиппова Юлия Юрьевна, к.б.н., 454001, Челябинск, ул. Братьев Кашириных, 129, р.т. (351)799-71-76
