CC BY
23
© Е.О.Богданова, О.В.Галкина, И.М. Зубина, В.А.Добронравов, 2016 УДК [616.61-036.12:611.018.2]:546.32+576.3
Е.О. Богданова, О.В. Галкина, И.М. Зубина, В.А. Добронравов
KLOTHO, ФАКТОР РОСТА ФИБРОБЛАСТОВ 23 И НЕОРГАНИЧЕСКИЙ ФОСФАТ НА РАННИХ СТАДИЯХ ХРОНИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ ПОЧЕК
Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, Научно-исследовательский институт нефрологии
E.O. Bogdanova, O.V. Galkina, I.M. Zubina, V.A. Dobronravov
KLOTHO, FIBROBLAST GROWTH FACTOR 23 AND INORGANIC PHOSPHATE IN EARLY STAGES OF CRONIC KIDNEY DISEASE
Pavlov First Saint Petersburg State Medical University Institute of Nephrology
РЕФЕРАТ
ЦЕЛЬ: уточнить, связана ли система aKlotho/FGF23 с изменениями мочевой экскреции неорганического фосфата (Pi) почками на ранних стадиях хронической болезни почек (ХБП). ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ: в исследование включены 80 пациентов (возраст 40,3±16,1 года) с первичной иммунной гломерулопатией и расчетной скоростью клубочковой фильтрации (рСКФ) от 140 до 30 мл/мин на 1,73 м2. Анализировали концентрации Pi, интактного FGF23, интактно-го PTH и белка aKIotho (sKlotho) в крови, концентрацию aKIotho в моче, стандартизированную по креатинину мочи (uKIotho/uCr). Уровень экспрессии белка aKIotho в тубулоинтерстиции (rKIotho) оценивали методом морфометрии. Рассчитывали фракционную (FEPi) и суточную (uPi24) экскрецию Pi почками. РЕЗУЛЬТАТЫ: в группах больных с рСКФ 140-100, 99-70, 69-50 и 49-30 мл/мин на 1,73 м2 достоверных различий sPi и uPi24 выявлено не было. Уровень FEPi достоверно возрастал по мере снижения рСКФ (р<0,001). Экспрессия rKIotho в тубулярном эпителии была достоверно ниже при рСКФ 99-70 мл/мин на 1,73 м2, а концентрация sKIotho - при рСКФ 69-50 мл/мин на 1,73 м2 в сравнении с рСКФ 140-100 мл/мин на 1,73 м2. Последняя имела достоверные связи с рСКФ (r=0,35, p=0,002), выраженностью интерстициального фиброза (r=-0,43, p=0,025) и гломерулосклероза (r=-0,45, p=0,015). По мере снижения рСКФ было выявлено достоверное увеличение PTH, начиная с рСКФ 99-70 мл/мин на 1,73 м2 в сравнении с рСКФ 140-100 мл/мин на 1,73 м2. Значения FGF23 были достоверно выше только в группе пациентов с рСКФ 49-30 мл/мин на 1,73 м2. При корреляционном анализе не выявлено достоверных взаимосвязей показателей обмена Pi, aKIotho и FGF23 в подгруппе больных с рСКФ > 50 мл/мин на 1,73 м2; при рСКФ < 50 мл/мин на 1,73 м2 FGF23 коррелировал с sPi. В этих же подгруппах FEPi имела достоверную корреляционную связь с уровнем PTH. Ни aKIotho, ни FGF23 не вошли в число независимых факторов, связанных с индексами мочевой экскреции Pi, при мультивариантном регрессионом анализе; sPi был независимо связан с FGF23 (р=0,50; р=0,007), a FEPi - с PTH (р=0,43; р=0,003). ЗАКЛЮЧЕНИЕ: снижение уровня aKIotho в почке и циркуляции происходит на ранних стадиях ХБП, предшествует росту концентрации FGF23 и, предположительно, связано с повреждением тубулоинтерстиция. На ранних стадиях ХБП изменение тубулярной реабсорбции и почечной экскреции Pi как важного фактора поддержания нейтрального баланса данного аниона происходит независимо от FGF23, циркулирующего и ренального aKIotho.
Ключевые слова: неорганический фосфат, паратиреоидный гормон, фактор роста фибробластов 23, белок aKIotho, хроническая болезнь почек, почечная экскреция фосфата.
ABSTRACT
THE AIM: to ascertain whether aKIotho and FGF23 are associated with inorganic phosphate urinary excretion in earIy stages of chronic kidney disease (CKD). PATIENTS AND METHODS. The cross-sectionaI study incIuded 80 patients (age 40.3±16.1) with primary immune gIomeruIopathies and estimated gIomeruIar fiItration rate (eGFR) range 30-140 mI/min/1.73 m2. Serum IeveIs of Pi (sPi), intact FGF23, intact PTH, serum aKIotho (sKIotho), urinary aKIotho creatinine ratio (uKIotho/uCr) were anaIyzed. RenaI expression of aKIotho protein (rKIotho) was estimated by morphometric method. EvaIuated parameters of renaI Pi exchange incIuding fractionaI excretion of Pi (FEPi) and 24h urinary Pi excretion (uPi24). RESULTS. There are no significant differences of sPi and uPi24 in groups of patients with eGFR 140-100, 99-70, 69-50 и 49-30 mI/min/1.73 m2. The IeveI of FEPi increased graduaIIy aIong with faII of eGFR of 99-70 mI/min/1.73 m2 (р<0.001). FEPi IeveI significantIy increased during decrease of eGFR (р<0,001). Compared to eGFR 140-100 mI/min/1.73 m2 rKIotho expression in tubuIar epitheIium was significantIy Iower at eGFR 99-70 mI/min/1.73 m2, whiIe sKIotho concentration decreased at eGFR 69-50 mI/min/1.73 m2. sKIotho concentration was significantIy associated with eGFR, interstitiaI fibrosis, and gIomeruIar scIerosis. During eGFR decrease the IeveI of PTH increased significantIy at eGFR 99-70 mI/min/1.73 m2 compared to eGFR 140-100 mI/min/1.73 m2. The IeveI of FGF23 was significantIy higher in patients with eGFR 49-30 mI/min/1.73 m2. In patients with eGFR > 50 mI/min/1.73 m2 no correIations were found between aKIotho/FGF23 and indices of Pi metaboIism. FGF23 was associated with sPi in patients with eGFR < 50 mI/
Богданова Е.О. 197022, Россия, Санкт-Петербург, ул. Л. Толстого, д. 17, корп. 54. Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова. Тел.: (812) 338-69-01; E-mail: [email protected].
min/1.73 m2. In the same groups FEPi was associated with PTH level. Neither Klotho nor FGF23 were associated with indices of urinary Pi excretion in multivariate regression analysis. sPi was independently associated with FGF23 (p=0.50; р=0.007), while FEPi with PTH (p=0.43; р=0.003). CONCLUSION. The decline of aKlotho in serum and kidneys occurs on early stages of CKD and apparently associates with tubulointerstitial injury preceding the increase of FGF23. In early stages of CKD the alterations in tubular reabsorption and renal excretion of Pi as important factor of this anion neutral balance support occur independently of circulating FGF23 and renal aKlotho.
Key words: inorganic phosphate, parathyroid hormone, fibroblast growth factor 23, aKlotho protein, chronic kidney disease, urinary phosphate excretion
ВВЕДЕНИЕ
Повышение концентрации неорганического фосфата (Р1) в плазме крови связано с увеличением смертности пациентов с хронической болезнью почек (ХБП) [1, 2]. Ключевым регулятором баланса Р1 в условиях снижения функции почек принято считать фактор роста фибробластов 23 (FGF23) и его корецептор аК1оШо [3-6]. К основным почечным эффектам FGF23 относят противодействие ретенции Р1 за счет снижения канальцевой реабсорб-ции [7-10]. Именно этим объясняют нормальные концентрации Р1, сохраняющиеся вплоть до выраженного снижения клубочковой фильтрации [10]. Считается, что снижение уровня аК1оШо и рост FGF23 предшествуют росту концентрации РТН [8]. Данная концепция базируется, главным образом, на клинических исследованиях и экспериментальных моделях выраженной дисфункции почек [10-16], в то время как данные об участии FGF23 и аК1оШо в регуляции обмена Р1 на начальных стадиях ХБП ограничены несколькими работами [7-9].
Настоящее исследование предпринято с целью проверки предположения о том, что регуляция экскреции Р1 почками на ранних стадиях ХБП действительно связана с изменениями в системе аK1otho/FGF23.
ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ
В обсервационное исследование включили 80 пациентов с первичной иммунной гломеруло-патией, подтвержденной морфологически (мужчин - 37, женщин - 43, средний возраст 40,3±16,1 года). Критериями исключения были острое повреждение почек, инфекционные заболевания, сердечная/легочная недостаточность, онкологические заболевания. Исследование было одобрено локальным этическим комитетом ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова. Среди обследованных пациентов у 33 диагностировали ^А нефропатию, у 27 - фокально-сегментарный гломерулосклероз, у 13 - мембранозную нефропатию, у 7 - болезнь минимальных изменений. У 22 пациентов расчетная скорость клубочковой фильтрации (рСКФ) составила 140-100 мл/мин на 1,73 м2 (группа 1),
у 24 - 99-7G мл/мин на 1,73 м2 (группа 2), у 17 -69-5G мл/мин на 1,73 м2 (группа 3), у 17 - 49-3G мл/ мин на 1,73 м2 (группа 4). Пациенты не получали препараты Са, витамин D (или его дериваты) и находились на стандартной диете с содержанием белка G,S-1,G г/кг массы тела.
Накануне биопсии почки пациентам назначали сбор суточной мочи, а по его окончанию выполняли взятие образца венозной крови и утренней мочи. Кровь и мочу центрифугировали при 15GG g в течение 1G мин, после чего биоматериал алик-вотировали и хранили при температуре -SG °С до проведения анализов. Биоптат почки фиксировали в 5% нейтральном формалине при температуре 22 °С в течение 1б ч. Гистологическую проводку осуществляли с помощью автоматического процессора Tissue-Tek Vip 5Jr (Sakura Finetek Inc., США) с применением раствора IsoPREP (БиоВи-трум, Россия). Для пропитывания обезвоженной ткани и приготовления блоков применяли среду для заключения HISTOMIX (БиоВитрум, Россия). Срезы толщиной не более 4 мкм изготавливали на ротационном микротоме Accu-cut SRM (Sakura Finetek Inc., США).
Биохимические исследования и иммунофер-ментный анализ
Концентрацию Pi, креатинина (Cr) в сыворотке крови и моче определяли на автоматическом анализаторе SYNCHRON CX DELTA (Beckman tauter, США) с использованием стандартных реагентов «Phosphorus», «Creatinine» (Beckman taulter, США). Расчет СКФ производили по формуле CKD EPI [17].
Расчет фракционной экскреции Pi осуществляли по формуле:
FEp. (%) = [(uPi • sCr)/(sPi • uCr)] • 100, где uPi - концентрация фосфора в моче, sCr - концентрация креатинина в сыворотке, sPi - концентрация фосфора в сыворотке, uCr - концентрация креатинина в моче.
Расчет абсолютной мочевой экскреции Pi осуществляли по формуле:
uPi24 (ммоль) = uPi • D, где
uPi - концентрация фосфора в моче, D - диурез.
Измерение концентрации интактного PTH в сыворотке крови проводили на автоматическом анализаторе Access Immunoassay System (Beckman Coulter, США) с использованием тест-системы «Intact PTH» (Beckman Coulter, США). Измерение концентрации интактного FGF23 в крови и белка aKlotho в крови (sKlotho) и моче (uKlotho) проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощью тест-систем «FGF23 ELISA Kit» (Kainos Laboratories, Inc., Япония) и «Human soluble a-Klotho Assay Kit» (Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd, Япония), соответственно.
Гистологические исследования
Для детекции aKlotho в почке (rKlotho) использовали поликлональные антитела ab69208 (Abcam, Великобритания) в разведении 1:450, систему визуализации REVEAL-Biotin-Free Polyvalent DAB (Spring Bioscience, США). Демаскировку антигена проводили в буфере рН 6,0 при температуре 90 °С в течение 25 мин на приборе для высокотемпературной демаскировки антигена (Thermo Scientific, США). Срезы окрашивали гематоксилином.
Экспрессию rKlotho исследовали в участках препарата с относительно сохранной структурой (без существенных фибропластических изменений) при помощи программно-аппаратного комплекса «Видео ТесТ-Морфология 5.2» (ООО «Видеотест», Россия). Содержание rKlotho оценивали как отношение площади продукта реакции к площади поля зрения в десяти полях зрения. Для всех микропрепаратов применяли окрашивание гемтоксилином и эозином, трихромную окраску по Массону, окраску конго красным, PAS-реакцию, серебрение по Джонсу. При световой микроскопии количественно оценивали долю склерозированных клубочков с признаками сегментарного и глобального склероза.
Выраженность гломерулярного склероза оценивали как индекс (ИГС):
ИГС (%) =[(rc+1/2^CC)/N ]-100, где
ГС - количество полностью склерозирован-ных клубочков, СС - количество клубочков с сегментарным склерозом, Nr - число клубочков в препарате.
Выраженность интерстициального фиброза, дистрофии и атрофии канальцев оценивали полуколичественно в баллах (0 - <10%; 1 балл -10-25%; 2 балла - 26-50%; 3 балла - 51-75%, 4 балла - >75%).
Статистический анализ
При нормальном распределении переменной данные представлены в виде среднего и стандартного отклонения (M±SD), для сравнения средних значений в двух выборках применяли t-критерий Стьюдента. При отсутствии нормального распределения данные представлены в виде медианы и интерквартильного размаха. Для сравнения средних значений в двух выборках применяли критерий Манна-Уитни. Для идентификации пар выборок, отличающихся друг от друга средними значениями, использовали апостериорный критерий Фишера (one-way ANOVA). Для исследования связей между переменными рассчитывали коэффициент корреляции Спирмена и выполняли множественный линейный регрессионный анализ. Критический уровень значимости для всех статистических тестов принимали равным 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Показатели метаболизма неорганического фосфата
Достоверных различий концентрации sPi и uPi24 в группах, стратифицированных по рСКФ,
sPi, ммоль/л
uPi24, ммоль
FEPi, %
1,6
1,5
F=1,34, р=0,27
F=0,98, р=0,41
Т 26 пг '
,4 Т 35 24
Т 22 а
■3 - 30 I 20 Т 1 Т ■
nil nil .ill
'1:140-100(22) 3:69-50(17) 1:140-100(22) 3:69-50(17) 1:140-100(22) 3:69-50(17)
2:99-70(24) 4:49-30(17) 2:99-70(24) 4:49-30(17) 2:99-70(24) 4:49-30(17)
F=7,49, p<0,001
CK4>(N)
□ Mean I MeantSD
CKO(N)
I Mean I MeantSD
В
CK<I>(N)
□I Mean X Mean±SD
Рис.1. Показатели метаболизма Р1 в группах 1-4: концентрация вР1 (А), абсолютная экскреция Р1 - иР124 (Б), РЕР| (В) в группах, стратифицированных по рСКФ. По оси абсцисс указан диапазон рСКФ и число наблюдений в группе (в скобках); а - р1-2=0,046; Ь - р1-3<0,001, р2-3=0,028; с - р1-4<0,001, р2-4=0,009, р3-4=0,49.
Рис. 2. Репрезентативные микрофотографии экспрессии aKlotho в почке (объектив 20х, окуляр 10х): А - группа 1, Б - группа 2, В - объединенная группа 3-4. В указанных стрелками областях наблюдается специфическая ИГХ реакция с антителами к aKlotho, ДК - дистальный каналец, ПК - проксимальный каналец, Кл - клубочек.
rKlotho (ИГХ), %
sKlotho, пг/мл
uKlotho/uCr, нг/ммоль
1400
----F=5,479; р=0,006 1300 [ -у F=3,599, р=0,032
1200
-?- 1100 —
J+ 1000 с 900
I 1II1 м
F=2,172; р=0,099
I
1:140-100(22) 2:99-70(24) 3-4:69-30(34) CKO(N)
А □ Mean I Mean±SD
1:140-100(22) 2:99-70(24) 3-4:69-30(34) 1:140-100(22) 2:99-70(24) CK«D(N) СКФ(М)
IT □ Mean I Mean±SD В П Median 1 25"75%
FGF23, пг/мл
PTH, пг/мл
180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
F=8,486, p <0,001
__Ш
"1:140-100(22) 3:69-50(17)
2:99-70(24) 4:49-30(17)
CK<D(N)
Г □ Median I 25-75%
140 120 100 80 60 40 20
F=9,097, p <0,001
g,h
3:69-30(34)
i ■ ■ W1:140-100(22) 3:69-50(17)
2:99-70(24) 4:49-30(17)
CKO(N)
Д D Median I 25-75%
Рис. 3. Относительная площадь экспрессии rKlotho (А), концентрация sKlotho в циркуляции (Б), концентрация uKlotho, стандартизированная по концентрации uCr (uKlotho/uCr) (В), FGF23 (Г) и РТН (Д) в группах, стратифицированных по рСКФ. По оси абсцисс указан диапазон рСКФ и число наблюдений в группе (в скобках); a - р=0,036, b - р=0,015, с - р=0,041 при сравнении с группой 1; d - р<0,034 при сравнении с группами 1, 2, 3; e - р=0,040, f - р=0,010, g - р=0,018 при сравнении с группой 1, h - р=0,028 при сравнении с группой 3.
выявлено не было (рис. 1 А, Б). Уровень FEpi достоверно возрастал по мере снижения рСКФ (см. рис. 1, В).
Klotho, FGF23 и PTH
Экспрессия rKlotho выявлена в тубулярном эпителии. Продукт ИГХ реакции в дистальных канальцах и собирательных трубках коркового вещества почки имел более интенсивную окраску, чем в проксимальных канальцах (рис. 2). Площадь экспрессии rKlotho была достоверно ниже в
группе 2 и объединенной группе 3-4 в сравнении с группой 1 (рис. 3, А).
Концентрация бЮоШо имела достоверную прямую связь с рСКФ (г=0,35, р=0,002) и обратную -с выраженностью склеротических изменений: атрофии канальцев (г=-0,44, р=0,037), очагового интерстициального фиброза (г=-0,43, р=0,025) и ИГС (г=-0,45, р=0,015). При сравнительном анализе уровень бЮоШо был ниже в объединенной группе с рСКФ 69-30 мл/мин на 1,73 м2 в сравнении
Таблица 1
Анализ корреляционных связей между показателями обмена Pi и фосфотоническими факторами (указаны коэффициенты корреляции Спирмена и значения р)
Показатель Вся группа, п=80 рСКФ>50 мл/мин на 1,73 м2, п=63 рСКФ 30-49 мл/мин на 1,73 м2, п=17
вР1, ммоль/л иР124, ммоль РЕР, % вР1, ммоль/л иР124, ммоль РЕР, % вР1, ммоль/л иР124, ммоль РЕр, %
гК!оШо, % -0,19 0,089 0,01 0,42 -0,28* 0,012 -0,11 0,41 -0,07 0,561 -0,22 0,09 -0,11 0,65 -0,04 0,86 -0,12 0,61
вК!оШо, пг/мл -0,15 0,20 0,03 0,21 -0,22 0,05 -0,11 0,42 -0,01 0,96 -0,07 0,61 0,22 0,44 0,40 0,14 -0,42 0,11
иК!о1Ьо/иСг, пг/ммоль 0,14 0,21 -0,18 0,07 -0,01 0,89 0,13 0,28 -0,12 0,34 -0,04 0,78 -0,01 0,97 -0,33 0,19 -0,25 0,31
РвР23, пг/мл 0,16 0,15 -0,03 0,71 0,35* 0,001 0,01 0,94 0,08 0,55 0,18 0,14 0,53* 0,027 -0,09 0,71 0,46 0,06
РТН, пг/мл 0,13 0,27 -0,04 0,73 0,45* <0,001 -0,06 0,65 0,02 0,90 0,28* 0,023 0,31 0,22 -0,07 0,76 0,58* 0,013
* Достоверные различия.
с группой 1 (см. рис. 3, Б), а уровень иК1оШо/иСг достоверно не различался (см. рис. 3, В).
По мере снижения рСКФ было выявлено достоверное увеличение РТН, начиная с рСКФ 99-70 мл/ мин на 1,73 м2 в сравнении с рСКФ 140-100 мл/мин на 1,73 м2 (см. рис. 3, Д). Значения FGF23 были достоверно выше только в группе пациентов с рСКФ 49-30 мл/мин на 1,73 м2 (см. рис. 3, Г).
При корреляционном анализе относительная экскреция фосфата ^Бр.) была прямо и достоверно связана с концентрациями FGF23, РТН в циркуляции и обратно - с гК1оШо в общей группе (табл. 1), иР124 не имел достоверных связей ни с одним из изученных фосфотонических факторов. Достоверных взаимосвязей показателей обмена Р1 и фосфотонических факторов aK1otho/FGF23 в подгруппах больных с рСКФ > 50 мл/мин на 1,73 м2 и рСКФ < 50 мл/мин на 1,73 м2 не выявлено. В этих же подгруппах FEpi имела достоверную корреляционную связь с уровнем РТН. У больных с рСКФ < 50 мл/мин на 1,73 м2 концентрация FGF23 прямо коррелировала с sPi (см. табл. 1).
Множественный регрессионный анализ показал, что факторами, независимо связанными с уровнем гК1оШо, являются только рСКФ (в= 0,52; р=0,044) и иК1оШо/иСг (р =-0,28; р=0,019), 8К1оШо - ИГС (Р=-0,30; р=0,018) и тубулоинтер-стициальные изменения (ТИИ) (р=-0,30; р=0,034). Концентрации FGF23, как и РТН, не зависели от уровней 8К1оШо и гК1оШо. Независимыми предикторами концентрации FGF23 были РТН (Р= 0,35; р= 0,011), sPi (р= 0,37; р= 0,003) и ТИИ (р= 0,30; р= 0,033), а РТН - рСКФ (р=-0,41; р= 0,032) и FGF23(p=-0,41; р= 0,011).
Ни аК1оШо, ни FGF23 не вошли в число независимых факторов, связанных с индексами мочевой
экскреции Р1 Прямую достоверную связь с sPi имел FGF23, с FEpi - РТН (табл. 2).
ОБСУЖДЕНИЕ
Клинические данные определенно показали, что на ранних стадиях снижения клубочковой фильтрации экспрессия белка аК1оШо в почке отчетливо снижается при отсутствии достоверных изменений уровня FGF23. Очевидно, что суммарная экспрессия аК1оШо в поврежденной почке должна определяться выраженностью фибропластических изменений органа в результате уменьшения массы тубулярного эпителия. Именно этим объясняется отчетливая прямая связь 8К1оШо и рСКФ, поскольку эпителиальные клетки канальцев считаются основным источником 8К1оШо в циркуляции [18]. Вместе с тем, нами впервые установлено, что, по крайней мере, при протеинурической гломеру-лопатии, уровень ренального аК1оШо снижается
Таблица 2
Переменные, связанные с показателями метаболизма Pi (множественный линейный регрессионный анализ); указаны значения коэффициента р и р
Зависимая Независимые переменные
переменная Пол рСКФ вР1 РТН РвР23
вР1 - - - 0,50 0,007
иР124 0,30 0,002 0,33 0,034 -0,25 0,022 - -
ЕЕр, 0,25 0,023 - - 0,43 0,003 -
Примечание. Коррекция моделей по возрасту, гК!о1Ьо, вК!о1:Ью, иК!оШо/иСг, индексу гломерулярного склероза, тубулоинтер-стициальным изменениям (кроме показателей, приведенных в таблице); знак «-» - указывает на отсутствие связи, пустая ячейка - на то, что данный параметр не был использован в модели.
параллельно с уменьшением рСКФ и в зонах органа с сохраненной структурой. Возможным механизмом может быть ингибирование экспрессии гена аК1оШо (К£), опосредованное увеличением трансформирующего фактора роста Р1 [19, 20], продукцией ингибиторов сигнального пути Wnt -белков Dickkopf1, склеростина [21], снижением образования кальцитриола [22, 23], а также снижением ингибирующих влияний последнего на ренин-ангиотензиновую систему [24].
Полученные нами результаты определенно указывают на то, что уменьшение почечного и циркулирующего пула аК1оШо является первичным событием по отношению к дисрегуляции FGF23. Предполагают, что на поздних стадиях ХБП повышение концентрации FGF23 в плазме обусловлено резистентностью почки к его действию на фоне выраженного снижения популяции эпителия канальцев и гК1оШо [25]. В отношении ранних стадий ХБП, когда канальцы относительно сохранны, нами не было получено никаких данных в пользу того, что инициальным механизмом повышения FGF23 может быть снижение аК1оШо в почке. Уровень интактного FGF23 достоверно повышался только при рСКФ 49-30 мл/мин на 1,73 м2 в сравнении с более высокими значениями рСКФ и был независимо ассоциирован с Pi сыворотки крови при множественном регрессионном анализе. Рост FGF23 происходит гораздо позднее снижения аК1оШо и не связана с последним при корреляционном и многомерном регрессионном анализах ни в общей выборке, ни в группах больных с рСКФ >50 и <50 мл/мин на 1,73 м2. Данные факты делают весьма вероятным предположение о том, что механизмы регуляции синтеза аК1оШо и FGF23 в условиях нарушения обмена Pi при ХБП различны и реализуются независимо. Редукция аК1оШо в почке и циркуляции является ранним признаком про-грессирования ХБП и может рассматриваться как биомаркер патологического процесса. Повышение же FGF23 отчетливо связано с развитием гипер-фосфатемии при выраженном снижении рСКФ и, с физиологической точки зрения, отражает реакцию остеоцитов на выраженную ретенцию Рг Согласно полученным результатам, другим независимым предиктором уровня FGF23 при ХБП является РТН (см. табл. 2), что соответствует экспериментальным данным о стимуляции РТН образования FGF23 остеоцитами [26-28].
В модельных исследованиях было показано, что аК1оШо может обладать и FGF23-опосредованным, и самостоятельным фосфатурическим действием [5]. Следовательно, снижение аК1оШо при неизме-
ненном уровне FGF23 должно было бы приводить к увеличению тубулярной реабсорбции Pi и снижению его мочевой экскреции. Вместе с тем, по мере снижения рСКФ при неизменной абсолютной экскреции фракционная экскреция Pi отчетливо увеличивалась вопреки снижению содержания aKlotho и в почке, и в циркуляции. Похожие результаты были недавно получены в независимом исследовании у больных с ранними стадиями дисфункции почек, у которых фракционная экскреция Pi продолжала увеличиваться по мере снижения клубочковой фильтрации и достоверного снижения экспрессии мРНК aKlotho в почке, при отсутствии изменений в уровнях FGF23 [9], что полностью согласуется и с экспериментальными наблюдениями, сделанными нами ранее [29].
Таким образом, полученные данные делают очевидным, что на ранних стадиях ХБП ни aKlotho, ни FGF23 не связаны с абсолютным и относительным выделением Pi почками. Если такая связь не является очевидной при ранней дисфункции почек, то на более поздних стадиях ХБП и при дальнейшем снижении числа функционирующих тубулярных эпи-телиоцитов возможность существенного влияния aKlotho/FGF23 на выделение Pi c мочой представляется маловероятной. В целом, подобные факты и рассуждения ставят под сомнение общепринятую точку зрения об участии почечных эффектов FGF23 и aKlotho в поддержании нейтрального баланса Pi на ранних стадиях ХБП [1, 5, 6, 15] и требуют пересмотра инициальных механизмов дисрегуля-ции почечного обмена Pi при начальном снижении клубочковой фильтрации. В то же время, хорошо известно о прямом действии PTH на проксимальные канальцы, приводящем к снижению реабсорбции Pi и фосфатурическому эффекту [30, 31]. Помимо этого, PTH осуществляет опосредованную регуляцию баланса Pi, ингибируя транскрипцию гена цинковой металлоэндопептидазы PHEX (phosphate regulating endopeptidase homolog X-linked) [32]. Физиологическим субстратом PHEX являются белки SIBLING семейства - DMP1 (dentin matrix protein 1), MEPE (matrix extracellular phosphoglycoprotein), остеопон-тин и др. В результате протеолиза SIBLING образуются фосфорилированные пептиды ASARM (acidic serine aspartate rich motif), устойчивые к гидролизу PHEX. В свою очередь, эта система может иметь прямое отношение к регуляции FGF23, поскольку известно, что интегрин-опосредованное взаимодействие PHEX и DMP1 вызывает снижение FGF23 в результате нарушения его стабильности [33]. Напротив, конкурентное высокоаффинное связывание пептидов ASARM с PHEX приводит к увеличению
FGF23 [33]. Кроме того, пептиды ASARM способны независимо от PHEX оказывать фосфатурический эффект, напрямую взаимодействуя с транспортерами Pi в проксимальных канальцах [34], и могут претендовать на роль фосфотонинов ранних стадий ХБП. В целом, ревизия вклада РТН, РТН-опосредованных механизмов регуляции экскреции Pi почками в условиях начального снижения функции почек требует дополнительных исследований.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Системное снижение уровня aKlotho в почке и циркуляции происходит на ранних стадиях ХБП, предшествует росту концентрации FGF23 и, предположительно, связано с повреждением тубуло-интерстиция. На ранних стадиях ХБП изменение тубулярной реабсорбции и почечной экскреции Pi, как важного фактора поддержания нейтрального баланса данного аниона, происходит независимо от FGF23, циркулирующего и ренального aKlotho.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Berndt T, Kumar R. Novel mechanisms in the regulation of phosphorus homeostasis. Physiology 2009; 24: 17-25
2. Kestenbaum В, Sampson JN, Rudser KD et al. Serum phosphate levels and mortality risk among people with chronic kidney disease. J Am SocNephrol 2005; 16(2): 520-528
3. Craver L, Marco MP, Martinez I et al. Mineral metabolism parameters throughout chronic kidney disease stages 1-5-achieve-ment of K/DOQI target ranges. Nephrol Dial Transplant 2007; 22(4): 1171-1176
4. Hruska KA, Mathew S, Lund R et al. Hyperphosphatemia of chronic kidney disease. Kidney Int 2008; 74(2): 148-157
5. Hu MC, Kuro-o M, Moe OW et al. Klotho and chronic kidney disease. Contrib Nephrol 2013; 180: 47-63
6. Добронравов ВА. Современный взгляд на патофизиологию вторичного гиперпаратиреоза: роль фактора роста фибробластов 23 и Klotho. Нефрология 2011; 15(4): 11-20 [Dobronravov VA. Sovremennyj vzgljad na patofiziologiju vtorich-nogo giperparatireoza rol' faktora rosta fibroblastov 23 i Klotho. Nefrologija 2011; 15(4): 11-20]
7. Asai O, Nakatani K, Tanaka T et al. Decreased renal alpha-Klotho expression in early diabetic nephropathy in humans and mice and its possible role in urinary calcium excretion. Kidney Int 2012; 81: 539-547
8. Pavik I, Jaeger P, Ebner L et al. Secreted Klotho and FGF23 in chronic kidney disease Stage 1 to 5: a sequence suggested from a cross-sectional study. Nephrol Dial Transplant 2013; 28(2): 352-359
9. Sakan H, Nakatani K, Asai O et al. Reduced Renal a-Klotho Expression in CKD Patients and Its Effect on Renal Phosphate Handling and Vitamin D Metabolism. PLoS One 2014; 9(1): e86301. doi: 10.1371/journal.pone.0086301
10. Fliser D, Kollerits B, Never U et al. Fibroblast growth factor 23 (FGF-23) predicts progression of chronic kidney disease: the Mild to Moderate Kidney Disease (MMKD) Study. J Am Soc Nephrol 2007; 18 (9): 2600-2608
11. Haruna Y, Kashihara N, Satoh M et al. Amelioration of progressive renal injury by genetic manipulation of Klotho gene. Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104: 2331-2336
12. Wang Y, Sun Z. Klotho gene delivery prevents the progression of spontaneous hypertension and renal damage. Hypertension 2009; 54: 810-817
13. Aizawa H, Saito Y, Nakamura T et al. Downregulation of the
Klotho gene in the kidney under sustained circulatory stress in rats. Biochem Biophys Res Commun 1998; 249: 865-871
14. Isakova T, Xie H, Barchi-Chung A et al. Fibroblast growth factor 23 in patients undergoing peritoneal dialysis. Clin J Am Soc Nephrol 2011; 6: 2688-9520
15. Kuro-o М. Phosphate and Klotho. Kidney Int 2011; 79 (121): 20-23
16.Yilmaz MI, Sonmez A, Saglam M et al. FGF-23 and vascular dysfunction in patients with stage 3 and 4 chronic kidney disease. Kidney Int 2010; 78 (7): 679-685
17. Levey AS, Stevens LA, Schmid CH et al A new equation to estimate glomerular filtration rate. Ann Intern Med 2009. 150(9):604-612
18. Kuro-o M, Matsumura X Aizawa H et al. Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling ageing. Nature 1997; 6;390(6655):45-51
19. Irifuku T, Doi S, Sasaki K. Inhibition of H3K9 histone methyltransferase G9a attenuates renal fibrosis and retains klotho expression. Kidney Int 2015;doi: 10.1038/ki.2015.291
20. Sutariya B, Jhonsa D, Saraf MN. TGF-ß: the connecting link between nephropathy and fibrosis. Immunopharmacol Im-munotoxicol 2016; 38(1):39-49
21. Fang Y Ginsberg C, Seifert M et al. CKD-Induced Wingless/ Integration1 Inhibitors and Phosphorus Cause the CKD-Mineral and Bone Disorder. JASN 2014; 25(8):1760-1773
22. Tsujikawa H, Kurotaki Х, Fujimori T et al. Klotho, a gene related to a syndrome resembling human premature aging, functions in a negative regulatory circuit of vitamin D endocrine system. Mol Endocrinol 2003; 17 (12): 2393-2403
23. Forster RE, Jurutka PW, Hsieh JC. Vitamin D receptor controls expression of the anti-aging klotho gene in mouse and human renal cells. Biochem Biophys Res Commun 2011; 28;414(3):557-562
24. De Borst MH, Vervloet MG, Ter Wee PM, Navis G. Cross talk between the renin-angiotensin-aldosterone system and vitamin D-FGF-23-klotho in chronic kidney disease. J Am Soc Nephrol 2011;22(9):1603-1609
25. Spichtig D, Zhang H, Mohebbi N. Renal expression of FGF23 and peripheral resistance to elevated FGF23 in rodent models of polycystic kidney disease. Kidney Int 2014;85(6):1340-1350
26. Rhee Y et al. Parathyroid hormone receptor signaling in osteocytes increases the expression of fibroblast growth fac-tor-23 in vitro and in vivo. Bone 2011; 49: 636-643
27. Lavi-Moshayoff V, Wasserman G, Meir T et al. PTH increases FGF23 gene expression and mediates the high-FGF23 levels of experimental kidney failure: a bone parathyroid feedback loop. Am J Physiol Renal Physiol 2010; 299:F882-F889
28. Lypez I, RodrHguez-Ortiz ME, AlmadMn Y et al. Direct and indirect effects of parathyroid hormone on circulating levels of fibroblast growth factor 23 in vivo. Kidney Int 2011; 80 (5): 475-482
29. Добронравов ВА, Богданова ЕО, Семенова НЮ и др. Почечная экспрессия белка aKlotho, фактор роста фибробластов 23 и паратиреоидный гормон при экспериментальном моделировании ранних стадий хронического повреждения почек. Нефрология 2014; 18(2):72-78 [Dobronravov VA, Bog-danova EO, Semenova NJu i dr. Pochechnaja ehkspressija belka aKlotho faktor rosta fibroblastov 23 i paratireoidnyj gormon pri ehksperimental'nom modelirovanii rannih stadij hronicheskogo povrezhdenija pochek. Nefrologija 2014; 18(2):72-78]
30. Potts JT. Parathyroid hormone: past and present. J Endocrinol 2005; 187 (3): 311-325
31. Silver J, Naveh-Many T. FGF-23 and secondary hyperparathyroidism in chronic kidney disease. Nature Reviews Nephrology 2013; 9: 641-649
32. Pellicelli M, Taheri M, St-Louis M. PTHrP(1-34)-mediated repression of the PHEX gene in osteoblastic cells involves the transcriptional repressor E4BP4. J Cell Physiol 2012; 227(6):2378-2387
33. Rowe PSN. The chicken or the egg: PHEX, FGF23 and SIBLINGs unscrambled. Cell Biochem Funct 2012; 30(5):355-375
34. David V, Martin A, Hedge AM. ASARM peptides: PHEX-dependent and -independent regulation of serum phosphate. Am J Physiol Renal Physiol 2011;300(3):783-791
Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант №13-04-01886).
Сведения об авторах:
Богданова Евдокия Олеговна
Россия, 197022, Санкт-Петербург, ул. Л. Толстого, д.17, корп. 54. Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, Научно-исследовательский институт нефрологии, лаборатория биохимического гомеостаза. Тел.: (812) 338-69-01; E-mail: evdokia. [email protected]. Bogdanova Evdokia
Affiliations: Russia, 197022, St. Petersburg, L. Tolstoy st., 17, build. 54, Pavlov First Saint Petersburg State Medical University Institute of Nephrology Laboratory of Biochemical Homeostasis Phone (812) 338-69-01; E-mail: [email protected].
Галкина Ольга Владимировна, канд. биол. наук Россия, 197022, Санкт-Петербург, ул. Л. Толстого, д.17, корп. 54. Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, Научно-исследовательский институт нефрологии, лаборатория биохимического гомеостаза. Тел.: (812) 338-69-01; E-mail: [email protected]. Olga V. Galkina PhD
Affiliations: Russia, 197022, St. Petersburg, L. Tolstoy st., 17, build. 54, Pavlov First Saint Petersburg State Medical University Institute of Nephrology Laboratory of Biochemical Homeostasis, head, Phone (812) 338-69-01; E-mail: [email protected].
Зубина Ирина Михайловна, канд. биол. наук Россия, 197022, Санкт-Петербург, ул. Л. Толстого, д.17, корп. 54. Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, Научно-исследовательский институт нефрологии, лаборатория биохимического гомеостаза. Тел.: (812) 338-69-01; E-mail: [email protected]. Irina M. Zubina PhD
Affiliations: Russia, 197022, St. Petersburg, L. Tolstoy st., 17, build. 54, Pavlov First Saint Petersburg State Medical University Institute of Nephrology Laboratory of Biochemical Homeostasis, Phone (812) 338-69-01; E-mail: [email protected].
Проф. Добронравов Владимир Александрович Россия, 197022, Санкт-Петербург, ул. Л. Толстого, д.17, корп. 54. Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, Научно-исследовательский институт нефрологии, заместитель директора. Тел.: (812) 338-69-01; E-mail: [email protected] Prof. Vladimir A. Dobronravov, MD, PhD, DSc Affiliations: Russia, 197022, St. Petersburg, L. Tolstoy st., 17, build. 54, Pavlov First Saint Petersburg State Medical University Institute of Nephrology, Vice Director, Phone (812) 338-69-01; E-mail: [email protected]
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Поступила в редакцию: 10.03.2016 г.
Принята в печать: 12.05.2016 г.
