CC BY
17_МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ И КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ_
УДК 636.028:57.088 doi: 10.25687/1996-6733.prodanimbiol.2018.1.19-28
КЛОНИРОВАНИЕ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ 5'- И 3'-ОБЛАСТЕЙ ГЕНА КИСЛОГО СЫВОРОТОЧНОГО БЕЛКА МЫШИ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ КОНСТРУКЦИЯХ, СОЗДАВАЕМЫХ НА ОСНОВЕ СИСТЕМЫ CRISPR/Cas9
Езерский В.А., Колоскова Е.М., Белова Н.В., Кутьин И.В., Рябых В.П.
ВНИИ физиологии, биохимии и питания животных, Боровск Калужской обл., Российская Федерация
Цель работы — освоение первичных этапов новой технологии CRISPR/Cas9 с целью эффективного получения трансгенных животных-продуцентов биологически активных белков человека. На основе геномной последовательности гена кислого сывороточного белка мыши (mWAP), были подобраны праймеры для ПЦР-амплификации 5' и 3'-фланкирующих областей, предназначенных для роли правого и левого плечей гомологии в генно-инженерных конструкциях (ГИК) с целью замещения mWAP кодирующей последовательностью биологически активного белка человека с применением системы CRISPR/Cas9. 5'WAP ПЦР-амплификат делали с геномной ДНК мыши, промоторной области гена mWAP, содержащей непосредственно перед ATG-кодоном сайт для рестриктазы KpnI. Обратный праймер для ПЦР-амплификации содержал сайт для KpnI, а в прямой праймер был введен сайт для EagI (NotI). 3'WAP ПЦР-амплификат делали с геномной ДНК мыши: для амплификации 3'W4P-фрагмента была выбрана область 3-го интрона гена mWAP. В прямой и обратный праймеры для ПЦР-амплификации были введены сайты для рестриктаз Sail и ClaI соответственно. В результате клонирования амплификатов в pTZ57R/T были получены плазмиды pTZ5'WAP и pTZ3'WAP. Достоверность клонирования подтверждена секвенированием клонированных фрагментов.
Ключевые слова: генно-инженерные конструкции, CRISPR/Cas9, mWAP, плазмиды, биомодели, трансгенные мыши
Проблемы биологии продуктивных животных, 2018, № 1: 19-28 Введение
До недавнего времени основным способом получения трансгенных животных (ТЖ) со специфическим сайтом нокаута, внесения мутаций или встраивания чужеродного гена был метод гомологичной рекомбинации с использованием эмбриональных стволовых клеток (ЭСК). Модифицированные ЭСК инъецировали в бластоцисты животных-реципиентов с получением химерного потомства, с последующим выведением линий, содержащих нужную генетическую модификацию (Capecchi, 2005). Этот способ получения нокаутных генно-модифицированных животных очень трудоемкий и длительный, выполнение которого недоступно для многих лабораторий.
Относительно недавно появились новые, более эффективные методы геномной модификации, основанные на непосредственном введении сайт-специфичных нуклеаз в одноклеточный эмбрион (или ЭСК) для создания двухнитевых разрывов ДНК. У таких методов, как ZFN (Zinc-finger Nuclease - «цинковые пальцы») и TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nucleases — эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции), существенным недостатком которых является высокая трудоемкость конструирования рекомбинант-ных векторов и дороговизна (Немудрый и др., 2014).
Начиная с 2013 года, активнее всего разрабатывается и интенсивно применяется новая система редактирования генома - CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/ CRISPR-associated nuclease 9). Предполагается, что с использованием CRISPR/Cas9-системы можно решать самые разнообразные задачи, связанные с разными областями фундаментальной и прикладной биологии, биотехнологии, медицины (Закия н и др., 2016).
Создание линий животных, способных продуцировать белки человека с молоком - одно из самых перспективных направлений прикладной биотехнологии - в настоящее время становится актуальным на рынке биотехнологической продукции. Содержание рекомбинант-ных белков в молоке трансгенных животных обычно невелико, что обусловлено как позиционным эффектом встраивания генно-инженерной конструкции (преимущественно - случайным), так и особенностями самой конструкции. В настоящее время в экспрессионный вектор для продукции рекомбинантных белков в молочной железе животных включают протяженную 5'-область гена молочного белка, состоящую из промотора, тканеспецифичных энхансе-ров, первых некодирующих экзонов и расположенных между ними интронов. В экспрессион-ный вектор также включают З'-нетранслируемую область гена, содержащую последние неко-дирующие экзоны и интроны, сайт полиаденилирования и прилежащие последовательности, потенциально способные усиливать терминацию транскрипции. Кроме того, для накопления целевого белка в молоке кодирующая часть гена должна содержать последовательность сигнального пептида, необходимого для секреции (Максименко и др., 2013). Все это делает конструкцию очень громоздкой, и создание таких ГИК превращается в достаточно сложный процесс с труднопредсказуемым конечным результатом. Высокая специфичность системы CRISPR/Cas9 позволяет существенно упростить и ускорить процедуру получения генно-модифицированных организмов. Метод получения генно-модифицированных животных путем микроинъекции в зиготы ГИК получил существенную техническую поддержку в виде CRISPR/Cas9-системы, позволяющую значительно увеличить его эффективность (Singh et al., 2014).
Проблема неспецифической модификации генома особенно актуальна для биомедицинских исследований: вероятность внесения нежелательных мутаций по нецелевым сайтам остаётся всегда (Mashiko et al., 2013). Тем не менее, в многочисленных исследованиях на мышах, проведенных с применением CRISPR/Cas9-системы в сочетании с микроинъекциями в зиготы, отмечено практически полное отсутствие новорожденных мышей, несущих неспецифические мутации.
Исходя из вышеизложенного, представляется крайне важным своевременно освоить перспективную CRISPR/Cas9 технологию с целью эффективного получения трансгенных животных-продуцентов биологически активных белков человека. В нашей лаборатории традиционным способом уже получены трансгенные кролики, продуцирующие с молоком лактофер-рин человека, хотя и в невысоких концентрациях (Езерский и др., 2013).
Освоение новых технологий получения ТЖ, как правило, начинается с лабораторных животных - мышей. Ген кислого сывороточного белка (whey acidic protein - WAP, основной белок сыворотки молока мыши с концентрацией около 2 г/л (Wall et al., 1991)) - потенциально очень перспективный кандидат для замены геном биологически активного белка человека при использовании системы CRISPR/Cas9. Фланкирующие области mWAP ранее успешно использовали в составе конструкций для получении ТЖ традиционным способом МИ (Maga @ Murray, 1995; Wall et al., 1997).
Логично предположить, что замена кодирующей части гена mWAP на ДНК (кДНК), например, лактоферрина человека, повлечет за собой изменение состава молока вплоть до полного замещения мышиного WAP белком человека у гомозиготных особей. Молекулярная масса mWAP - около 14.4 kDa, чЛФ - 80 kDa. Если экспрессия чЛФ у трансгенной мыши под управлением mWAP элементов будет происходить так же, как и эндогенного mWAP, ожидаемое содержание чЛФ может составлять 10-12 г на литр молока (Shi et al., 2009). Используя
ГИК, содержащую кодирующую последовательность выбранного белка и плечи гомологии к 5'- и 3'-фланкирующим областям mWAP совместно с компонентами системы CRISPR/Cas9, мы можем рассчитывать на желаемый эффект. Репарация сайт-специфичных двухнитевых разрывов хромосомной ДНК с использованием матрицы, имеющей плечи гомологии к сайту разрыва, по механизму HDR (прямой гомологичной рекомбинации) сможет обеспечить точное встраивание трансгена после работы сайт-специфичных gRNA и Cas9 нуклеазы, микро-инъецированных в эмбрионы в том или ином виде и составе, например, в виде плазмид, экс-прессирующих в клетках эукариот (компоненты CRISPR/Cas9), и HDR-матрицы, линеаризованной или в виде плазмиды.
Цель данной работы — освоение первичных этапов новой технологии CRISPR/Cas9 с целью эффективного получения трансгенных животных-продуцентов биологически активных белков человека.
Объекты и методы
Выделение геномной ДНК проводили методом щелочного лизиса и спиртового переосаждения. Временные и температурные параметры ПЦР были подобраны в зависимости от структуры праймеров. Праймеры заказывали и синтезировали в ЗАО «Синтол» (http://www.syntol.ru). При проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали смесь dNTP 2 мМ раствор (Fermen-tas), Taq-полимеразу 5 ед/мкл, 10xTaq-буфер с 25 mM MgCl2, Pfu-ДНК-полимеразу 5 ед/мкл (Силекс). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) при получении амплификатов и анализе ДНК клонов проводили на амплификаторе ДНК «Тер-цик» («ООО ДНК-Технология», Москва). Временные и температурные параметры ПЦР были подобраны в зависимости от структуры праймеров.
Амплификаты клонировали в промежуточный вектор pTZ57R/T из набора Thermo Scientific InsTAclone PCR Cloning Kit (Fermentas или Thermoscientific <http://www.thermoscientific.com/fermentas>). Трансформацию компетентных клеток E.coli Dh5a проводили по методике и с реагентами набора Transform-Aid Bacterial Transformation Kit (Thermoscientific). На конечном этапе брали 5 мкл лигазной смеси из 50 мкл клеточной суспензии в буфере Т(АВ). Трансформированные клетки высевали на твердую селективную среду, содержащую ампициллин (чашки Петри с ЛБ, Ам ) по 10-25 мкл. Выросшие клоны пересевали на чашки Петри с ЛБ, Ам+. ДНК из клонов для ПЦР- анализа выделяли с помощью лизирующей смеси с протеиназой К. Инкубировали при 50оС и инактивировали фермент при 94оС по 15 минут.
Для отбора положительных клонов после легирования и трансформации применяли метод ПЦР-анализа и рестриктного картирования. Отобранные клоны были использованы для наработки и очистки плазмидной ДНК. Выделение плазмидной ДНК проводили по методике и с реагентами набора GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermoscientific) .
Расщепление плазмидной ДНК рестриктазами проводили стандартными методами с учетом активности и условий работы каждого фермента, описанных в сертификатах анализа или справочных каталогах ("Fermentas", "Invitrogen"). Рестриктированные плазмидные ДНК после препаративного электрофореза выделяли из агарозного геля (АГ) с помощью набора Gene JET Gel Extraction Kit (Thermoscientific). ДНК снимали элюирующим буфером из набора (10 мМ Трис-На, pH 8,5).
Качество и количество выделенных плазмид и фрагментов оценивали визуально в УФ свете после электрофореза образцов в АГ. Электрофорез проводили в горизонтальном агароз-ном геле, содержащем бромистый этидий, с применением ><0,5 Трис-боратного буфера (ТВЕ), рН 8,0, с бромистым этидием, используя набор оборудования фирмы Hoeffer (USA). Размер фрагментов ДНК в агарозном геле оценивали, используя в качестве стандарта DNA Ladder Mix (Fermentas). Секвенирование клонированных последовательностей осуществляли в ЗАО «Синтол» (Москва).
Результаты и обсуждение
Выбор фрагментов клонирования
Основная мишень — кластер генов сывороточных белков молока с высокой экспрессией, выбрана с целью нокаута собственного гена кислого сывороточного протеина (mWAP) и интеграции на его место гена биологически активного белка человека (например, кДНК лак-тоферрина человека) по механизму прямой гомологичной рекомбинации.
Геномная последовательность mWAP была взята из интернет-базы данных GenBank, запись NC_000077.6, соответствует: Mus musculus strain C57BL/6J chromosome 11, GRCm38.p4 C57BL/6J.
В качестве плечей гомологии в потенциальной HDR-матрицы были выбраны фрагменты размером около 1 т.п.н. В 5'WAP фрагменте был сохранен сайт для уникальной рест-риктазы KpnI, примыкающий непосредственно к ATU-кодону. Это позволит облегчить сохранение рамки считывания при планировании конструкции HDR-матрицы.
Исходя из необходимости сохранения последних интронов генов для их нормального функционирования (как содержащих в себе некоторые регуляторные последовательности), 3'WAP амплификат делали в области 3-го интрона гена mWAP. На рис. 1 изображено расположение в гене mWAP 5'- и 3'-WAP плечей гомологии, выбранных для осуществления гомологичной рекомбинации.
Рис. 1. ПЦР-амплификация 5' и 3' плечей гомологии гена mWAP для использования в CRISPR/Cas9 системе, обусловленной HDR с участием ГИК, содержащей 5'и 3' плечи гомологии. Получение промежуточных плазмид pTZ5'WAP и pTZ3'WAP, содержащих 5'WAP и 3'WAP фрагменты. Указаны сайты для уникальных рестриктаз, сайты связывания используемых праймеров, размеры клонированных фрагментов.
Последовательность первого экзона mWAP (внутри которого для имеющихся РАМ будет подобрана первая gRNA) была проанализирована на возможный полиморфизм с целью подбора таргетных участков, общих для мышей линий C57BL/6J, CBA/J и их гибридов (наиболее часто используемых в нашей практике). Отличия в ДНК-последовательностях первого
экзона не обнаружены. Как видно из рис. 2, только на матричной ДНК гена (нити) mWAP в области первого экзона (72 п.н.) имеется 6, а на комплементарной - 7 РАМ-мотивов.
Transcript: MGP_CBAJ_T0027702.1
Description whey acidic protein [Source:MGI Symbol;Acc:MGI:98943] Location Chromosome 11: 4.310.241-4.313.268 reverse strand. Gene This transcript is a product of gene MGP CBAJ G0017758
1
CCTGACACCGGTACCATGCGTTGCCTCATCAGCCTTGTTCTTGGCCTGCTGGCCCTGGAG ......... ......... .......... *********.......
60
...............ATGCGTTGCCTCATCAGCCTTGTTCTTGGCCTGCTGGCCCTGGAG
45
...............-M — R — C — L — I — S — L — V — L — G — L — L — A — L — E-
15
Рис. 2. Фрагмент транскрипта, содержащего первый экзон гена m WAP.A TGCGT -чередующиеся кодоны. Деойнойлинией обозначены сыогои эыеооое. ОЫЫЫ ~ потенциальные РАМ—мотивы на матричной нити ДНК, CCN - потенциальные РАМ - мотивы комплементарной нити ДНК
1.1. Клонирование 5'MWAP, получение плазмиды ptz5'WAP
Обратный праймер для 5'mWAP на 100% саответсавовте выбранной предстартовой последовательности, содержащей уникальный сайт рестрикции для KpnI: прямой праймер подбирали к заведомо взятой последовательности обратного праймера W5'R.
В прямой праймер W5'F ввели сайт для EagI (NotI). Из предложенных программой Vector NTI 9 пар выбрали следующую:
#7: Product of length 959 (из них 945 - для HDR) (rating: 162) Contains region of the molecule from 233 to 1181
Sense Primer: W5 'F GAGCGGCCGC AATGTAGAAACAGAGCAGAGAGGTGGT Antisense Primer: W5'R CATGGTACCGGTGTCAGGCAAGTGACTG Tm Difference: 1.9 GC Difference: 0.4
Были подобраны следующие условия для проведения амплификации: денатурация ДНК 94оС - 45 сек (в первом цикле - 3 мин.), отжиг праймеров 64оС - 60 сек., элонгация 72оС - 1 мин (в последнем цикле -3 мин). Всего 26 циклов.
Таблица 1. Состав препаративной ПЦР-смеси для получения амплификата 5'mWAP
Компонент Объем, мкл
1 Taq buf x10 16
2 dNTP x10 (2 мМ) 12
3 W5'F (3 пМ/мкл) 8
4 W5'R (3 пМ/мкл) 8
5 Геномная ДНК мыши (=30 нг/мкл) 8
6 TaqPol (5 ед/мкл) 2,4
7 H2O 105,6
Итого 160
Получили ПЦР-амплификат размером 961 п.н. (с учетом А-нуклеотидов на 3'-концах в результате работы Тад-полимеразы) содержащий фрагмент 5'WAP размером 945 п.н.
Рис. 3. Препаративный электрофорез ПЦР-амплификата mWAP (А1-5) и выделенный из ага-розного геля фрагмент EagI-5WAP-KpnI (Б2). 0,8% агарозный гель, *0,5ТБЕ. А6, Б1 - маркер размеров ДНК
Очищенный препаративным электрофорезом и выделенный из АГ с помощью набора амплификат 5'WAP клонировали в рTZ57R/T (рис. 3). Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E.coli Dh5a и выросшие на селективной среде клоны проверили на наличие вставки (рис. 4). Положительный клон нарабатывали и выделяли рTZ5'WAP стандартной процедурой с помощью набора.
Таблица 2. Состав лигазной смеси
Компонент Объем, мкл
1 pTZ57R/T (55 нг/мкл или 0,17 пмоль/концов) 1
2 5 х лигазный буфер 4
3 5 ' WAP ПЦР-амплификат (=3 0 нг/мкл) 1 0
4 Н2О 4
5 Т4 ДНК-лигаза (5 ед/мкл) 1
Итого: 20
Рис.4. Проверка бактериальных клонов праймерами W5'F и W5'R. 0,8% агарозный гель, х 0,5ТБЕ.
1 -13 - клоны 1-13,
14 - лигазная смесь,
15 - маркер размеров ДНК,
16 - Н2О
1.2. Клонирование 3 'mWAP для HDR, получение плазмидырtz3'WAP
В прямой и обратный праймеры W1703 и W1704 ввели сайты для SalI и ClaI соответственно. Из предложенных программой Vector NTI 9 вариантов пар праймеров выбрали следующий:
#1: Product of length 991 (из них 980 - для HDR) (rating: 171) Contains region of the molecule from 3157 to 4135
Sense Primer: W1703 GTCGAC TGCATCAGATCCAAGTGCAGATACAATGTG Antisense Primer: W1704 ATCGAT TCACCTCTGCTTCTAGCCTAGTCAG Tm Difference: 2.7 GC Difference: 1.2
ПЦР-амплификацию, выделение и очистку 3'WAP фрагмента проводили как при получении 5 'WAP (рис.5). 3'WAP размером 993 п.н. (из них для HDR - 980 пар нуклеотидов) клонировали вpTZ57R/T. Все дальнейшие процедуры проводили как при получении (рис. 6). Положительный клон наработали и выделилиpTZ3'WAP (рис. 5).
Рис. 5. Препаративный электрофорез ПЦР-амплификата фрагмента 3'WAP (А1) и выделенный из агарозного геля фрагмент SalI-3 'WAP-ClaI (Б2). 0,8% агарозный гель, х0,5ТБЕ А2, Б1 - маркер размеров ДНК
Рис. 6. Проверка бактериальных клонов праймерами Ш1703 и Ш1704 . 0,8% ага-розный гель, *0,5ТБЕ 1-9 - клоны 1-9,
10 - маркер размеров ДНК,
11 - Н2О,
12 - лигазная смесь
Рис. 7. Полученные промежуточные плазмиды pTZ5'WAP и pTZ3'WAP, содержащие 5 'и 3'-WAP фрагменты для HDR. Указаны основные рестриктные сайты и сайты связывания используемых праймеров.
1.3. Секвенирование клонированных последовательностей
Наработанные и очищенные положительные клоны pTZ5'WAP1 и pTZ3'WAP2 секве-нировали с двух сторон с использованием стандартных праймеров.
После проведения сиквенса клонированные последовательности были сравнены с опубликованной в базе данных GenBank с помощью пакета программ BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Как оказалось, клонированная 3'WAP--последовательность 100% соответствует выбранной из GenBank NC_000077.6 (Mus musculus strain C57BL/6J chromosome 11, GRCm38.p4 C57BL/6J) (
У клонированной 5'WAP-последовательности из 945 нуклеотидов обнаружена одно-нуклеотидная замена в положении 494 (рис.8). Наличие этой замены может быть объяснено как ошибкой синтеза полимеразы, так и действительно существующим полиморфизмом генов. Идентичность выбранной последовательности с таковой у опубликованной матрицы составляет 99,89%. Последовательность соответствует записи NC_000077.6 для Mus musculus линии C57BL/6J, опубликованной в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Поскольку замена находится в некодирующей области, клон может быть использован в дальнейших работах.
Query Sbjct Query Sbjct Query Sbjct Query Sbjct Query Sbjct Query Sbjct Query Sbjct
6639568 61
6639508 121
6639448 181
6639388 241
6639328 301
6639268 361
6639208
Query 421 Sbjct 6639148
Query 481
Sbjct 6639088
Query 541 Sbjct 6639028
AATGTAGAAACAGAGCAGAGAGGTGGTTGCCAAGGTCTGGGGGCTCAGAGGACAAGCAAG 6 0
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
AATGTAGAAACAGAGCAGAGAGGTGGTTGCCAAGGTCTGGGGGCTCAGAGGACAAGCAAG 6639509
AGGCGCGGCTTTCCTTTGGGGCTGGCATGAAAGGAAATATCGAGGTTACAGCCTGAGAGG 120
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
AGGCGCGGCTTTCCTTTGGGGCTGGCATGAAAGGAAATATCGAGGTTACAGCCTGAGAGG 6639449
GCTTCCCCTGACACTTCGTATTCAAAGAGGCCATGGGCCACCAGTGAAGACAAAGGAGTA 180 I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
GCTTCCCCTGACACTTCGTATTCAAAGAGGCCATGGGCCACCAGTGAAGACAAAGGAGTA 6639389
TGGCCTGCACCACAGGCTGGCGCTGACAGTCAGTAAGCACACAGTCACTCTGGGTCATCC 240
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
TGGCCTGCACCACAGGCTGGCGCTGACAGTCAGTAAGCACACAGTCACTCTGGGTCATCC 6639329
CATCCCCTTCCTTGCAAGAGAAATCAAGGAAATGTCCCGAGAACAATGGGGCACAGTGCC 300 llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll
CATCCCCTTCCTTGCAAGAGAAATCAAGGAAATGTCCCGAGAACAATGGGGCACAGTGCC 66392 69
CAGCAGGACATCTCTTCCTGCCCATGACACCCTTGGCACAGTATGGGCCCTTCTGGGAAG 360
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
CAGCAGGACATCTCTTCCTGCCCATGACACCCTTGGCACAGTATGGGCCCTTCTGGGAAG 6 63 92 0 9
TGGCCTTCCAATGTGCTCTGCACAGGCAGCTCCTTTTCAATGTATGCCCGACACTCTCTA 420
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
TGGCCTTCCAATGTGCTCTGCACAGGCAGCTCCTTTTCAATGTATGCCCGACACTCTCTA 6639149
CATGGAGCAAGCGCCTCCACACTCTTAGAAGAATTTTTAGAAAACTCCAGAAAAGCACCA 480 llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll
CATGGAGCAAGCGCCTCCACACTCTTAGAAGAATTTTTAGAAAACTCCAGAAAAGCACCA 663908 9
GGAGAAGTCACCC|CAGATGTAGCCCGGACTCGAGCCTTGCTCAAAACCTCCTGTCTTGT 540 lllllllllllll I I I I I I I I I I I I I I I I II I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
GGAGAAGTCACCCTCAGATGTAGCCCGGACTCGAGCCTTGCTCAAAACCTCCTGTCTTGT 663902 9
TTTCTATGTGACTGTACAAATTTGGAGCTCAGAATTGCCTTTGTCTGTGATGGGTTCCAA 600 llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll
TTTCTATGTGACTGTACAAATTTGGAGCTCAGAATTGCCTTTGTCTGTGATGGGTTCCAA 6638969
Query Sbjct
601
6638968
Query 661 Sbjct 6638908
Query 721
Sbjct 6638848 Query 781
Sbjct 6638788
Query 841
Sbjct 6638728 Query 901 Sbjct 6638668
CCCAACCACTCAAAGTGACACTTGTCACATTTGTCACTGATCCTATTTCTTCTTTTTCTG 660 llllllllllllllllllllllllllllllllllllllilllllllllllllllllllll
CCCAACCACTCAAAGTGACACTTGTCACATTTGTCACTGATCCTATTTCTTCTTTTTCTG 6638909
CTCCTTCATTTTCTCCGCTTTCATAATAAACAAGTATTACTTTTTAAGTGGGGGAAAAAA 720 llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll
CTCCTTCATTTTCTCCGCTTTCATAATAAACAAGTATTACTTTTTAAGTGGGGGAAAAAA 6638849
TGACCACCCTTACAAAGGACTTTTTAAAAATGGCCTCCATTGTGGCCCTTGTTCCTGGCA 780 I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
TGACCACCCTTACAAAGGACTTTTTAAAAATGGCCTCCATTGTGGCCCTTGTTCCTGGCA 6638789
GCCTGGGCCTGCTCTCTCTGTGTGGCCAAGAAGGAAGTGTTGTAGCCCATCTAGAGCTGT 840 llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll
GCCTGGGCCTGCTCTCTCTGTGTGGCCAAGAAGGAAGTGTTGTAGCCCATCTAGAGCTGT 6638729
GCCAGCCTCTTCCCCCACCCCACCCCCAAAGTCTTCCTCCTGTGGGTCCTTTAAATGCAT 900
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
GCCAGCCTCTTCCCCCACCCCACCCCCAAAGTCTTCCTCCTGTGGGTCCTTTAAATGCAT 6638669 CCCAGACACTCAGACAGCCATCAGTCACTTGCCTGACACCGGTAC 945
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
CCCAGACACTCAGACAGCCATCAGTCACTTGCCTGACACCGGTAC 6638624
Рис. 8. Поиск соответствия сиквенса клонированной 5*- области гена тШЛР^шгу) известным последовательностям генома мыши ($>Ъ}ф. В положении 494 (отсутствие вертикальной черты между нуклеотидами) - замена нуклеотида (blast.ncbi.nlm.nih.gov).
Заключение
Созданы плазмиды pTZ5'WAP и pTZ3'WAP, содержащие 5'WAP и 3'WAP фрагменты (размером 945 и 980 п.н. соответственно) гена кислого сывороточного белка мыши. Эти последовательности предполагается использовать в качестве плечей гомологии в генно-инженерных конструкциях, содержащих ген или кДНК биологически активного белка человека. Такие ГИК могут быть использованы в качестве матрицы для замещения кодирующей последовательности гена mWAP новым структурным геном посредством механизма прямой гомологичной рекомбинации (HDR) в процессе репарации геномной ДНК мышиного эмбриона, разрезанной эндонуклеазой Cas9 в сайтах гена mWAP, узнанных gRNA(s) (компонентов CRISPR/Cas9 системы). Предполагается, что в результате будут получены мыши, продуцирующие с молоком вместо mWAP в равноценном количестве фармакологически ценный белок человека. Отработанная на мышах как на модельных животных технология впоследствии позволит перейти на сельскохозяйственных животных
ЛИТЕРАТУРА
1 Езерский В.А., Шишиморова М.С., Тевкин С.И., Трубицина Т.П., Колоскова Е.М., Безбородова О.А., Якубовская Р.И., Максименко С.В., Рябых В.П. Интеграция и тканеспецифическая экспрессия гена лактоферрина человека в молочной железе трансгенных кроликов // Проблемы биологии продуктивных животных. - 2013. - 4. - С. 32-52.
2 Закиян С.М., Медведев С.П., Дементьева Е.В., Власов В.В. (Ред.). Редактирование генов и геномов. - Новосибирск: Изд.. СО РАН, 2016, 419 с.
3 Максименко О.Г., Дейкин А.В., Ходарович Ю.М., Георгиев П.Г. Использование трансгенных животных в биотехнологии: перспективы и проблемы // Acta naturae. - 2013. - Т. 5. - № 1. - С. 33-47.
4 Немудрый А.А., Валетдинова К.Р., Медведев С.П., Закиян С.М. Системы редактирования геномов TALEN и CRISPR/Cas - инструменты открытий // Acta naturae. - 2014. - Т. 6. - № 3. - С. 20-42.
5 Capecchi M. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. - Nature Reviews | GENETICS. - 2005. - Vol. 6. - P. 507-512.
6 Maga E.A., J.D. Murray. Mammary gland expression of transgenes and the potential for altering the properties of milk // Bio. Technology. - 1995. - Vol. 13. - P. 1452-1457.
7 Mashiko D., Fujihara Y., Satouh Y., Miyata H., Isotani A., Ikawa M. Generation of mutant mice by pro-nuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA // Sci. Rep. - 2013. - Vol. 3. - P. 3355. doi:10.1038/srep03355.
8 Shi G., Chen H., Wu X., Zhou Y., Liu Z., Zheng T., Huang P. A mWAP-hLF hybrid gene locus gave extremely high level expression of human lactoferrin in the milk of transgenic mice // Transgenic Res. -2009. - Vol. 18. - P. 573-582.
9 Singh P., Schimenti J.C., Bolcun-Filas E. A mouse geneticist's practical guide to CRISPR applications // Genetics: Early Online. - published on September 29, 2014 as 10.1534/genetics.114.169771.
10 Wall R.J., Pursel V.G., Shamayt A., Mcknight R.A., Pittiustt C.W., Hennighausen L. High-level synthesis of a heterologous milk protein in the mammary glands of transgenic swine. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1991. - Vol. 88. - P. 1696-1700. doi: 10.1073/pnas.88.5.1696
11 Wall R.J., Kerr D.E., Bondioli K.R. Transgenic dairy cattle: genetic engineering on a large scale // J. Dairy Sci. - 1997. - Vol. 80. - P. 2213-2224.
REFERENCES
1. Capecchi M. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nature Reviews | GENETICS. 2005, 6: 507-512.
2. Ezerskii V.A., Shishimorova M.S., Tevkin S.I., Trubitsina T.P., Koloskova E.M., Bezborodova O.A., Yakubovskaya R.I., Maksimenko S.V., Ryabykh V.P. [Integration and tissue-specific expression of the human lactoferrin gene in the mammary gland of transgenic rabbits]. Problemy biologii produktivnykh zhivotnykh - Problems of Productive Animal Biology. 2013, 4: 32-52.
3. Maga E.A., J.D. Murray. Mammary gland expression of transgenes and the potential for altering the properties of milk. Bio. Technology. 1995, 13: 1452-1457.
4. Mashiko D., Fujihara Y., Satouh Y., Miyata H., Isotani A., Ikawa M. Generation of mutant mice by pro-nuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Sci. Rep. 2013, 3: 3355, D0I:10.1038/srep03355.
5. Maksimenko O.G., Deikin A.V., Khodarovich Yu.M., Georgiev P.G. [The use of transgenic animals in biotechnology: perspectives and problems]. Acta naturae. 2013, 5(1): 33-47. (In Russian)
6. Nemudryi A.A., Valetdinova K.R., Medvedev S.P., Zakiyan S.M. [Genome editing systems TALEN and CRISPR / Cas - discovery tools]. Acta naturae. 2014, 6(3): 20-42. (In Russian)
7. Shi G., Chen H., Wu X., Zhou Y., Liu Z., Zheng T., Huang P. A mWAP-hLF hybrid gene locus gave extremely high level expression of human lactoferrin in the milk of transgenic mice. Transgenic Res. 2009, 18: 573-582.
8. Singh P., Schimenti J.C., Bolcun-Filas E. A Mouse Geneticist's practical guide to CRISPR applications. Genetics: Early Online. Published on September 29, 2014 as 10.1534/genetics.114.169771
9. Wall R.J., Pursel V.G., Shamayt A., Mcknight R.A., Pittiustt C.W., Hennighausen L. High-level synthesis of a heterologous milk protein in the mammary glands of transgenic swine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991, 88: 1696-1700. doi: 10.1073/pnas.88.5.1696
10. Wall R.J., Kerr D.E., Bondioli K.R. Transgenic dairy cattle: genetic engineering on a large scale. J. Dairy Sci. 1997, 80: 2213-2224.
11. Zakiyan S.M., Medvedev S.P., Dement'eva E.V., Vlasov V.V. (Eds). Redaktirovanie genov i genomov (Editing genes and genomes). Novosibirsk: Izd. SO RAN Publ., 2016, 419 p.
Cloning nucleotide sequences 5'- and 3'-domains of the gene for acidic mouse serum protein for the use in gene-engineering constructions, created on the basis of CRISPR / Cas9 system
Yezersky V.A., Koloskova E.M., Belova N.V., Kutyin I.V., Ryabykh V.P.
Institute of Physiology, Biochemistry and Animal Nutrition, Borovsk Kaluga Region, Russian Federation
ABSTRACT. Based on the genomic sequence of the gene for acidic mouse serum protein (mWAP), primers were chosen for PCR amplification of 5 'and 3'-flanking regions intended for the role of the right and left arms of homology in genetically engineered constructs (GIC) for the purpose of replacing mWAP with coding sequence of a biologically active human protein using the CRISPR / Cas9 system. The 5'WAP PCR amplification was done with the mouse genomic DNA, the promoter region of the mWAP gene, containing the site for the restriction enzyme KpnI immediately before the ATG codon. The reverse primer for PCR amplification contained a site for KpnI, and a site for EagI (NotI) was introduced into the forward primer. 3'WAP PCR amplification was done with the mouse genomic DNA: the region of the 3rd intron of the mWAP gene was chosen to amplify the 3'WAP fragment. In the forward and reverse primers for PCR amplification, sites for the restriction enzymes SalI and ClaI were introduced, respectively. As a result of cloning of the amplifications in pTZ57R / T, the plasmids pTZ5WAP and pTZ3'WAP were obtained. The reliability of cloning is confirmed by the sequencing of cloned fragments.
Key words: genetic engineering, CRISPR/Cas9, mWAP, plasmids, biomodels, transgenic mice Problemy biologii productivnykh zhivotnykh - Problems of Productive Animal Biology, 2018, 1: 19-28
Поступило в редакцию: 11.11.2017 Получено после доработки: 22.12.2017
Езерский Вадим Александрович, с.н.с.; 8(906)642-59-92; Колоскова Елена Михайловна, к.б.н., с.н.с.; 8(910)590-92-83; Белова Надежда Викторовна, м.н.с., 8(903)635-83-57; Кутьин Иван Владимирович, м.н.с., 8(953)332-86-47;
Рябых Владимир Павлович, д.б.н., зав. лаб., 8(484)386-64-31, vlt03@kaluga.ru
