CC BY
69
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
Известия ТСХА, выпуск 2, 2010 год
УДК 631.421.1
КЛОНИРОВАНИЕ И АНАЛИЗ ИНТРОН-ЭКЗОННОГО УЧАСТКА ГЕНОВ ОРТОЛОГОВ ГЕНА VIVIPAROUS НЕКОТОРЫХ ВИДОВ ДИКИХ СОРОДИЧЕЙ ПШЕНИЦЫ
М.Г. ДИВАШУК, П.Ю. КРУПИН, И.А. ФЕСЕНКО, Г.И. КАРЛОВ (Центр молекуля рной биотехнологии)
В результате проведенного пря мого клонирования были получены сиквенсы интрон-экзонного участка генов ортологов гена Viviparous у видов Thinopyrum elongatum, Thinopyrum bessarabicum, Pseudoroegneria stripifolia, Dasypyrum villosum. Полученные сиквенсы имеют высококонсервативные последовательности в области экзона и полиморфны в области интрона. Было выделено два аллельных варианта участка гена Viviparous у Dasypyrum villosum, различающихся между собой в интронной части и несущих четыре аминокислотные замены в полипептидной цепи. Кластерный анализ показал, что полученные сиквенсы гена Viviparous у Thinopyrum elongatum, Thinopyrum bessarabicum, Pseudoroegneria stripifolia, Dasypyrum villosum попадают в кластер с видами, относящимися к родам Triticum и Hordeum.
Ключевые слова: Viviparous, устойчивость к прорастанию, Thinopyrum elongatum, Thinopyrum bessarabicum, Pseudoroegneria stripifolia, Dasypyrum villosum.
Ген Viviparous (Vp) я вля ется одним из важных регуля торов позднего эмбриогенеза у кукурузы и пшеницы [1]. Анализ и клонирование Vp1-генов кукурузы и зерновых культур, а также их ортологов у других растений, включа ген нечувствительности к абсцизовой кислоте (АБК) арабидоп-сиса Insensitive3 (ABI3), показали, что они кодируют факторы транскрипции, которые характеризуются высоким уровнем экспрессии в развивающихся зародышах семя н [1_3]. Все клонированные ортологи ABI3/VP1 (арабидопсиса, кукурузы, риса, овса, бобов и моркови) содержат функциональные домены B1, B2 и B3, которые св зываютс с ДНК и активизируют
целевые промоторы [1—6]. VP1-гены кукурузы и риса способствуют транскрипции многих регулируемых АБК генов в развивающемся алейроне [1,
7, 8]. Фенотипы мутантов кукуру-
зы по гену Vp-1 свидетельствуют о том, что ген выполня ет две различных функции: первая — обеспечение созревания зародыша, вторая — регул ци перехода семени в покой и репресси прорастани .
Три гена-гомолога Vp-1 клонированы и секвенированы у пшеницы [9]. Анализ структуры и экспрессии этих трех генов показал, что каждый из них потенциально кодирует полноразмерную цепь аминокислот. Однако некорректный сплайсинг проматрич-
ной РНК приводит к аберрантным продуктам трансл ции. Исследование уровня экспрессии гена Vp-1 в созревающих зародышах сортов, устойчивых и неустойчивых к доуборочному прорастанию, выявило положительную корреля цию между покоем семя н и чувствительностью к АБК [10]. Авторы [11] сообщили, что неправильный сплайсинг про-мРНК TaVp1 происходит вокруг домена B3 и приводит к синтезу аберрантных мРНК с наличием стоп-кодонов в открытой рамке считывания (ORF). Такой неправильный сплайсинг был также обнаружен в большинстве транскриптов TaVp1 у диплоидных и тетраплоидных предков мя гкой пшеницы, что позволя ет предполагать, что современная пшеница унаследовала структуру TaVp1 от предковых форм [11].
Анализ структуры и функциони-ровани гена Vp1 у различных злаков может дать новые сведения о механизмах взаимодействи генетических систем в организме, а также
о принципах регуляции важнейшего процесса толерантности к прорастанию на корню. Все это в целом позволит разработать биоинженер-ные и другие подходы к регул ции прорастани зерновых на корню. Таким образом, исследования гена Vp1 у диких сородичей пшеницы может послужить базой как для изучения функционировани данного гена у различных видов, что приблизит нас к понимаю всех сторон его функциональных особенностей, так и в дальнейшем дл направленного трансге-ноза или отдаленной гибридизации дл привнесени в пшеницу генов, обеспечивающих устойчивость ее к прорастанию на корню.
Целью нашей работы было пр мое клонирование и сравнительный анализ области В3 домена гена Viviparous у следующих видов злаков: Thinopyrum elongatum, Thinopyrum bessarabicum, Pseudoroegneria stripifolia, Dasypy-rum villosum.
Материалы и методы
В работе использовали образцы Thinopyrum elongatum (PI 401007), Thinopyrum bessarabicum (PI 531711), Pseudoroegneria stri pifolia (W621759), Dasypyrum villosum (W621717), полученные из Germplasm Research Intern ation al Network. ДНК выделяли из молодых листьев и корешков по методу Bern atzky и Tanksley [12]. Использовали праймеры VP-1BB4F и VP-1BB4R [11]. Условия амплификации — первоначальная денатурация 5 мин при 94°С, далее 35 циклов при следующих условиях 95°С —
1 мин, 66°С — 1 мин, 72°С — 1 мин, и конечна элонгаци в течении 10 мин при 72°С. Прямое секвенирование осуществл ли с ПЦР продукта с помощью праймеров VP-1BB4F и VP-1BB4R [11]. Секвенирование проводили на приборе ABI-3130XL. Выравнивание сиквенсов проводили с использованием программы GenDoc; поиск гомологий и построение филогенетических деревьев — с помощью программного обеспечения Blast и Mega 4,0.
Результаты и их обсуждение
При проведении ПЦР с праймерами VP-1BB4F и VP-1BB4R, комплементарными к шестому экзону и п тому интрону гена Viviparous у субгенома В м гкой пшеницы на всех исследуемых образцах были получены единичные продукты амплификации одного размера, что обеспечивало возможность пр мого секвенировани . Пр мое сек-венирование указало на однородность амплифицируемых фрагментов дл каждого из изучаемых образцов внутри одного вида. В результате проведенного пр мого секвенировани ПЦР-продуктов нами были получены сиквенсы, включающие в свой состав шестой экзон и часть п того интро-на гена Viviparous, у следующих видов Th. elongatum , Th. bessarabicum ,
P. stripifolia, D. villosum. Для разных растений D. villosum были получены различные сиквенсы, которые укладывались в два варианта, поэтому мы выделили у D. villosum два аллельных варианта этого участка гена Viviparous (рис. 1).
^к видно на рисунке 2, полученные нами сиквенсы на диких сородичах в основном различаютс своей неинформативной интронной частью, а на нуклеотидной последовательности, относя щейся к экзону, больших различий не наблюдаетс . При этом следует отметить, что именно полиморфизм в этой области интрона у белозерных пшениц вызывает различи в устойчивости к прорастанию на корню [11]. Это св зывают с альтернативным сплайсингом при наличии определенного полиморфизма в интронах. Таким образом, на функционирование гена Viviparous оказывает вли ние не только информаци , закодированна в экзонах, но и на-блюдающийс полиморфизм в интро-нах.
Трансляции полученных нами сик-венсов и выравнивание их между собой и с полипептидами, продуцируемыми генами пшеницы VP-lB и Vp-lD, представлены на рисунке 3.
^к видно, среди полипептидов наблюдаетс высокий консерватизм и сродство к полипетидам, продуцируемым субгеномами м гкой пшеницы. При этом различи в аминокислотах в основном повтор ют полиморфизм и у субгеномов м гкой пшеницы.
При построении филогенетических деревьев с участием полученных сик-венсов мы можем видеть, что все сиквенсы попадают в кластер с видами, относящимися к родам Triticum и Hordeum (рис. 4). При этом сиквенсы участка гена Viviparous, полученные нами на Th. elongatum и Th. Ъessara-Mcum, стоят ближе к видам Hordeum по сравнению с сиквенсами из Dasypyrum villosum и Pseudoroegneria stripifolia.
Таким образом, клонированные и охарактеризованные нами последовательности ДHK могут служить от-
Рис. 1. Выравнивание двух аллельных вариантов участка гена Viviparous, выявленных у Dasypyrum villosum
Рис. 2. Выравнивание полученных нами сиквенсов участка гена Viviparous у диких сородичей пшеницы. Цветом обозначен конец интрона (зеленый) и начало экзона (желтый)
Рис. 3. Выравнивание полипептидов генов VP-1B и Vp-1D и вновь полученных сиквенсов
диких сородичей пшеницы
12.5.
Triticum aestivum VIVIPAR0US1 (VP-1 B) g Triticum aestivum vp1 B gene for VIVIPAR Triticum aestivum VIVIPAR0US1 protein ( Triticum aestivum VP1 mRNA for transcri Triticum aestivum vp1A gene for VIVIPAR Triticum monococcum subsp. aegilopoides Triticum aestivum cuitivarZhongyou 950 Triticum aestivum cuitivar Yongchuanbai Pseudoroegneria stripifolia seq Dasypyrum villosum a 11 e 11 seq Dasypyrum villosum allel 2.seq Hordeum vulgare HvABI3 gene for B3 type Hordeum vulgare vip gene for viviparous Thinopyrum bessarabicum.seq Thinopyrum elongatum.seq Avena fatua clone 11 viviparous 1 mRNA, Avena fatua mRNA for VIVIPAROUS 1 homol
12
10 8 6 4
Nucleotide Substitutions (X1 00)
Рис. 4. Кластеризация пшеницы сиквенсов участка гена Viviparous диких сородичей
правной точкой дл клонировани
полноразмерных генов ортологов у изучаемых видов.
Выводы
1. Полученные сиквенсы ортологов гена Viviparous у Thinopyrum elonga-tum, Thinopyrum bessarabicum, Pseudoroegneria stripifolia, Dasypyrum villosum имеют высококонсервативные последовательности в области экзона и полиморфны в области интрона.
2. Нами выделены два аллельных варианта гена Viviparous у Dasypyrum villosum, различающиеся как в ин-
тронной части, так и несущие четыре аминокислотные замены в полипептид-ной цепи.
3. Полученные сиквенсы участка гена Viviparous у Thinopyrum elonga-tum, Thinopyrum ЪessaraЪicum, Pseudoroegneria stripifolia, Dasypyrum villosum попадают в кластер с видами, относя-щимис к родам Triticum и Hordeum.
Pабoта выполнена при финансовой поддержке Федерального агентства по образованию в рамках ФЦП «Hаyчные и научно педагогические кадры инновационной Poс-сии» 2009-2013 гг. (государственный контракт П59В «Koнстpyиpoвание ДHK-библиo-теки генов гомологов гена Vp-1 (viviparous) злаковых культур и её характеристика»).
BMG^Morpa—MnecKMM cnMCOK
1. Cao J. , Duan X. , McElroy D. , Wu R. Regeneration of herbicide resistant transgenic rice plants following microprojectile- mediated transformation of suspension culture cells. Plant Cell Rep, 1992. 11, 586-591.
2. Shen Q. , Gomez-Cadenas A., Zhang P., Walker-Simmons M.K., Sheen J. , Ho T.H. Dissection of abscisic acid signal transduction pathways in barley aleurone layers. Plant Mol. Biol, 2001. 47, 437-448.
3. Utsugi S., Maekawa M., Noda K. An efficient transient gene expression system using aleurones of diploid wheat seeds. Plant Biotechnology, 2006. 23, 413-417.
4. Jacobsen J.V., Close T.J. Control of transient expression of chimaeric genes by gibberellic acid and abscisic acid in protoplasts prepared from mature barley aleurone layers. Plant Mol. Biol., 1991. 16, 713-724.
5. Kushiro T., Okamoto M., Nakahayashi K., Yamagishi K., Kitamura S., Asa-mi T., Hirai N., Koshka T., Kamiya Y., Namtara E. The Arabidopsis cytochrome P450 CYP707A encodes ABA В’-hydroxylases: key enzymes in catabolism. EMBO J, 2004. 23, 1647-1656.
6. Nakamura S. , Toyama T. Isolation of a VP1 homologue from wheat and an aly-sis of its expression in embryos of dormant and non-dormant cultivars. J. Exp. Bot., 2001. 52, 875-876.
7. Ezcurra I., Wycliffe P., Nehlin L. , Ellerstrom M. , Rask L. Transactivation of the Brassica napus napin promoter by ABI3 requires interaction of the conserved B2 and B3 domains of ABI3 with different cis-elements: B2 mediates activation through an ABRE, whereas B3 interacts with an RY/G-box. Plant J., 2000. 24, 2457-2466.
8. Zentella R. , Yamauchi D. , Ho T.H. Molecular dissection of the gibberellin/abscisic acid sign aling pathways by transiently expressed RNA interference in barley aleurone cells. Plant Cell, 2002. 14, 2289-2301.
9. Gomez-Cadenas A. , Zentella R. , Walker-Simmons M.K. , Ho T.H. Gibberellin/abscisic acid antagonism in barley aleurone cells: site of action of the protein kin ase PKABA1 in relation to gibberellin sign aling molecules. Plant Cell, 2001. 13, 667-679.
10. McKiЪЪin R.S., Wilkinson M.D., Bailey P.C., Flintham J.E., Andrew L.M., Lazzeri P.A. , Gale M.D. , Lenton J.R., Holdsworth M.J. Transcripts of Vp-1 homeologues are misspliced in modern wheat and ancestral species. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 2002. 10203-10208.
11. Yang Y., Zhao X.L., Xia L.Q., Chen X.M., Xia X.C., Yu Z., He Z.H., Ro-der M. Development and validation of a Viviparous-1 STS marker for pre-harvest sprouting tolerance in Chinese wheats. Theor. Appl. Genet., 2007. 115, 971-980.
12. Bernatzky R. , Tanksley S.D. Toward a saturated linkage map in tomato based on isozyme and random cDNA sequences // Genetics, 1986. Vol. ll2. P. 887-898.
SUMMARY
As a result of carried out direct cloning, some sequences of intron-exon genes’ part of Viviparous gene orthologues in varieties Trunopyrum elongatum, Thinopyrum ЪessaraЪicum, Pseudoroegneria stripifolia, Dasypyrum villosum have been obtained. These sequences have highly conservative successions in exon area and are polymorphous in intron zone. Two allelic variants of gene part Vivaparous in Dasypyrum villosum, differing in intron area and having four aminoacidic changes in a polypeptide chain, have been detected and sorted out. Cluster an alysis shows that the sequences of the gene Vivaparous in Trunopyrum elongatum, Thinopyrum ЪessaraЪicum, Pseudoroegneria stri pifolia, Dasypyrum villosum come to the cluster with varieties of Triticum and Hordeum families.
Key words: Viviparous, resistance to germination, Trunopyrum elongatum, Thinopyrum ЪessaraЪicum, Pseudoroegneria stripifolia, Dasypyrum villosum.
Дивашук Михаил Георгиевич — к. б. н. Тел. 977-70-01.
Крупин Павел Юрьевич — асп. центра молекуля рной биотехнологии РГАУ -МСХА имени К.А. Тимирязева. Тел. 977-70-01.
Фесенко Игорь Александрович — к. б. н. Тел. 977-70-01.
Карлов Геннадий Ильич — к. б. н. Эл. почта: karlov@timacad.ru
