CC BY
88
УДК 634.13:631.541.11:631.527.6:631.533
клональное микроразмножение в системе
ПРОИЗВОДСТВА ОЗДОРОВЛЕННОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА КЛОНОВых ПОДВОЕВ ГРУШИ
И.Н. ПРОНИНА, кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник
О.В. МАТУШКИНА, кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник
Р.Д. ИСАЕВ, кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник
ВНИИ садоводства имени И.В. Мичурина Россель-хозакадемии
E-mail: [email protected]
Резюме. В статье рассмотрены особенности размножения in vitro перспективных клоновых подвоев груши селекции ВНИИ сельского хозяйства имени И.В. Мичурина - ПГ 2, ПГ12, ПГ17-16 в качестве важной составной части системы производства сертифицированного посадочного материала. Культивирование in vitro и in vivo выявило их высокую регенерационную способность. Подвой ПГ 12характеризовался наиболее высоким морфогенетическим потенциалом - через 2мес. после введения в культуру in vitro количество образованных им клонов было в 3,5-7,0 раз больше, чем в вариантах с другими генотипами. Впервые при клональном микроразмножении, наряду с общепринятыми средами Мурасиге-Скуга и Кворина-Лепуавра, изучена возможность применения комплексного водорастворимого вещества (КВ), эффективность которого зависит от генотипических особенностей растений. Его использование не оказало существенного влияния на коэффициент размножения, который варьировал у ПГ 2 от 5,5 до 6,3 шт./эксплант, у ПГ 12 - от 8,4 до 10,2 шт./эксплант, но увеличило количество пригодных для укоренения микропобегов на 22,5...44,2%. Культивирование на среде с комплексным водорастворимым веществом способствовало ускорению индукции ризогенеза на 1.2 нед. у всех клоновых подвоев. Так, у ПГ 17-16 процессы корнеобразования наблюдали уже через 10 дн., а количество укорененных микропобегов составило 93,3%, тогда как на среде Кворина-Лепуавра аналогичные результаты отмечены только через 4 нед. Применение КВ оказало положительное последействие на приживаемость растений-регенерантов ex vitro, которая была на 7,1% (ПГ 17-16). ..33,3% (ПГ 12) выше, по сравнению со средой Кворина-Лепуавра. При использовании размноженных методом in vitro растений продуктивность маточника клоновых подвоев увеличивалась в 1,1-1,4 раза. Ключевые слова: груша, клоновый подвой, клональное микроразмножение, питательные среды, маточник, продуктивность.
Груша - одна из важнейших плодовых культур средней полосы Российской Федерации. В последние годы наблюдается резкое сокращение площадей занятых ее посадками, что связано с отсутствием высокозимостойких подвоев со сдержанным ростом, маточных насаждений и технологий производства оздоровленного посадочного материала, а также плохой фитосанитар-ной обстановкой.
Вступление России в ВТО предусматривает необходимость производства высококачественного посадочного материала, свободного от вирусных, грибных и бактериальных болезней, важное место в технологии выращивания которого занимает метод in vitro.
Использование клонального микроразмножения сопряжено с трудностями переноса уже разработанных моделей размножения на другие объекты, что связано с генотипической реакцией растений на условия культивирования, которая проявляется на всех этапах.
При этом результат зависит от генотипа и состояния родительского растения, происхождения
эксплантов, особенностей введения в стерильную культуру, химических и физических условий культивирования.
Выбор минеральных компонентов питательной среды - важнейший фактор, влияющий на морфогенез растений in vitro. На сегодняшний день разработано множество различных по минеральному составу питательных сред, однако большинство исследователей при размножении плодовых культур отдают предпочтение средам Мурасиге-Скуга и Кворина-Лепуавра.
Информация о продуктивности меристемных растений плодовых культур in vivo недостаточна, однако имеющиеся сведения свидетельствует о том, что их регенерационная способность значительно выше, чем у размноженных традиционным способом [1...4].
На базе ВНИИ садоводства имени И.В. Мичурина созданы клоновые подвои груши ПГ 2, ПГ 17-16, ПГ 12, которые характеризуются высокой укореняемостью при размножении зелеными черенками, зимостойкостью, устойчивостью к буроватости и септориозу, хорошей совместимостью с сортами. В 2008 г. их включили в Государственный реестр селекционных достижений [5].
Цель наших исследований - изучение регенераци-онной способности перспективных клоновых подвоев груши in vitro на основе использования комплексного водорастворимого вещества, а также их последующей продуктивности в маточнике.
Условия, материалы и методы. Объекты исследований - перспективные клоновые подвои груши ПГ 12, ПГ 2, ПГ 17-16.
Для вычленения меристематических тканей использовали активно растущие верхушки побегов. Исходными эксплантами служили меристематические верхушки размером 0,5.1,5 мм.
Экспланты культивировали на средах Мурасиге-Скуга (МС), Кворина-Лепуавра (QL) и с комплексным водорастворимым веществом (КВ), дополненными 6-бензиламинопурином (БАП) - 0,3.1,0 мг/л. На этапе ризогенеза использовали питательные среды, а также комплексное водорастворимое вещество, разбавленные в 2 раза по минеральному составу, с индо-лилмасляной (ИМК, 1,0.1,5 мг/л) и индолилуксусной кислотами (ИУК, 4,0.5,0 мг/л).
Таблица 1. Регенерационная способность меристематических тканей клоновых подвоев груши через 2 мес. культивирования
Подвой Регенерировало, % Количество клонов, %*
всего в том числе достигло фазы розетки и конгломератов
ПГ 12 79,4 a** 16,1 7,0
ПГ 2 70,0 ab 7,1 2,0
ПГ 17-16 38,0 d 6,6 1,0
* - количество образованных клонов, полученных от введенных в культуру in vitro эксплантов
** - наличие одинаковых букв при цифровых показателях указывает на отсутствие различий на 5%-ном уровне значимости (по критерию Дункана)
Условия культивирования: температура воздуха -24±2оС, освещенность - 2...3 тыс. лк, продолжительность фотопериода - 16 ч.
Опыты закладывали в трехкратной повторности, в каждой по 10.15 эксплантов. Оценку продуктивности клоновых подвоев груши в маточнике проводили по методике [6].
Размноженные методом in vitro подвои груши высаживали в луговой маточник с целью выращивания материала для зеленого черенкования. Маточник был заложен в 2007 г., схема посадки - 1,0 х 0,2 м, густота -37 тыс. раст./га. В качестве контроля брали растения, размноженные традиционным способом.
Статистическую обработку экспериментальных данных осуществляли методом дисперсионного анализа [7]. Достоверность различий оценивали по наименьшей существенной разности (НСР05) и с помощью t-критерия Дункана.
результаты и обсуждение. На этапе введения в культуру темпы дифференциации меристематических тканей (меристема с субэпидермальным слоем ткани) клоновых подвоев груши в значительной степени определялись способностью эксплантов образовывать дополнительные пазушных почки (табл. 1). Среди изученных форм наиболее высоким морфогенетиче-ским потенциалом характеризовался подвой ПГ 12. Количество образованных клонов этого подвоя через 2 мес. культивирования было в 3,5-7,0 раз больше, чем в вариантах с другими генотипами.
При использовании общепринятых питательных сред значительное время затрачивается на их приготовление, что усложняет технологический процесс in vitro. Для упрощения и удешевления технологии размножения мы разработали питательную среду (КВ) с комплексным водорастворимым веществом, содержащим необходимый набор макро- и микроэлементов [8].
Сравнительное изучение питательных сред при размножении клоновых подвоев груши ПГ 2, ПГ 12 не выявило существенных различий (F. <F ) как по ко-
1 ^ ^ * факт теор'
эффициенту размножения, так и по количеству побегов пригодных для укоренения (см. рисунок).
Культивирование эксплантов клоновых подвоев груши на КВ также не оказало достоверного влияния на коэффициент размножения, но увеличило количество пригодных для укоренения микропобегов у ПГ 12 и ПГ 2 на 22,5.26,7 и 43,6.44,2% соответственно.
Применение ИМК для индукции корнеобразова-ния клоновых подвоев способствовало образованию каллуса, который замедлял процесс укоренения и тормозил рост корней. Лучшая ризогенная активность отмечена у подвоев ПГ 12 и ПГ 17-16.
Сравнение показало, что при использовании питательных сред Мурасиге-Скуга и Кворина-Лепуавра различия по укореняемо-сти и качеству корневой системы несущественны (табл. 2).
Культивирование микропобегов на 1/2 КВ спо-
Рисунок. Влияние минерального состава питательной среды на пролиферацию подвоев груши: i—i - коэффициент размножения, шт./экспл.; — количество микропобегов >
1,5 см, %.
собствовало ускорению индукции ризогенеза на 1.2 нед. у всех генотипов [9, 10]. У подвоя ПГ 17-16 процессы корнеобразования наблюдали уже через 10 дн., а количество укорененных микропобегов составило 93,3%, тогда как на разбавленной вдвое среде QL величина этого показателя достигала такого же уровня через 4 нед. У ПГ2 и ПГ12 укоре-няемость микропобегов через 4 нед. культивирования на среде с комплексным водорастворимым веществом была на 20,0.26,7% выше, чем в других вариантах опыта.
Использование среды с комплексным водорастворимым веществом оказало положительное последействие на приживаемость ex vitro растений-регенерантов в нестерильных условиях. При использовании 1/2КВ величина этого показателя была на 7,1% (ПГ 17-16) -33,3% (ПГ 12) выше, чем в варианте с 1/2QL.
Результаты исследований, проведенных в луговом маточнике, показали, что наиболее высокой продуктивностью обладали растения, первоначально размноженные in vitro - в 1,1-1,4 раза выше, чем в варианте с традиционным способом (табл. 3). Так, в 2013 г. (6-й год после посадки) у подвоя ПГ 2 средняя продуктивность маточных кустов в контроле составляла 8,2 побега (281,2 тыс./га), а при размножении in vitro -10,3 побега (325,6 тыс./га).
Средняя длина однолетних побегов у маточных растений, полученных методом клонального микроразмножения, в 1-2 декаде июня 2011-2013 гг. была
Таблица 2. влияние минерального состава питательной среды на ризогенез клоновых подвоев груши
Подвой Питательная среда Укореняемость, % Количество корней, шт./ раст. Длина корней, см
1 нед. 2 нед. 3 нед. 4 нед.
ПГ 2 1/2МС 0,0 0,0 26,7 60,0 b* 2,0 2,0
1/2QL 0,0 26,7 60,0 60,0 b 2,3 2,0
1/2КВ 6,7 53,3 73,3 80,0 a 2,0 1,2
НСР„„ РФ< рт
ПГ 12 1/2МС 0,0 13,3 60,0 73,3 b 2,3т 1,1 T
1/2QL 0,0 6,7 53,3 66,7 b 2,5 0,9
1/2КВ 0,0 80,0 100 100 a 6,3 3,1
НСР 3,3 1,0
ПГ 17-16 1/2МС 0,0 6,7 80,0 86,7 b 2,4 2,8
1/2QL 0,0 40,0 60,0 93,3ab 3,8 1,8
1/2КВ 0,0 93,3 100 100 a 5,7 2,1
НСР05 1,5 F*< Ft
* - наличие одинаковых букв при цифровых показателях указывает на отсутствие различий на 5%-ном уровне значимости (по критерию Дункана)
Таблица 3. Влияние способа размножения на продуктивность лугового наблюдали у подвоев ПГ
17-16 и ПГ 12 в течение трех лет исследований.
Выводы. Таким образом, наряду с общепринятыми питательными средами, для размножения и укоренения клоновых подвоев груши in vitro возможно использование комплексного водорастворимого вещества, эффективность которого зависит от ге-нотипических особенностей растений. В варианте с этой питательной средой количество пригодных для укоренения микропобегов выросло на 22,5.44,2%, ризогененная активность ускорилась на 1.2 нед., укореняемость и приживаемость растений ex vitro увеличилась на 6,7.33,3 и 7,1.33,3% соответственно. При использовании размноженных методом in vitro растений установлено по-
в 1,1 раза выше, чем в контроле. Аналогичные зако- вышение продуктивности маточника клоновых подвоев номерности изменения длины и количества побегов груши в 1,1-1,4 раза.
Литература.
1. Верзилин А.В., Минаев В.А., Тарасов A.M. Оздоровление и клональное микроразмножение слаборослых подвоев яблони: монография. Мичуринск: МГПИ, 2007. 146 с.
2. Еремин Г.В. Продуктивность суперэлитного черенкового маточника подвоев косточковых культур //Садоводство и виноградарство. 1995. №4. С. 14-15.
3. Карычев К.Г., Яноква А.И. Рост и плодоношение деревьев сливы, выращенной in vitro // Селекционно-генетическое совершенствование породно-сортового состава культур на Северном Кавказе: темат. сб. науч. трудов. Краснодар: СКЗНИИСиВ, 2005. С. 243-246.
4. Zimmtrman R.H., Steffens G.L. Cultivar, planting density, and growth regulator effects on growht and fruiting of tissue-cultured apple trees //Am. Soc. Hortic. Sc. 1995.Vol. 120. № 2. P. 183-193.
5. Исаев Р.Д., Сергеев Д.В. Использование новых клоновых подвоев груши в технологии выращивания посадочного материала // Плодоводство и ягодоводство России: сб. науч. работ. М.: ВСТИСП, 2012. Т. XXXI. ч. 1. С. 220-228.
6. Программа и методика сортоизучения плодовых, ягодных и орехоплодных культур / под общ. ред. Е.Н. Седова и Т.П. Огольцовой. Орел: ВНИИСПК, 1999. 608 с.
7. Доспехов, Б.А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований): 5-е изд., перераб. и доп. М.: Колос, 1985. 416 с.
8. Матушкина О.В., Пронина И.Н. Питательная среда для размножения яблони и груши in vitro. Патент № 2486237. Бюл. № 18. 27.06.2013.
9. Пронина И.Н., Матушкина О.В. Питательная среда для укоренения побегов яблони и груши in vitro. Патент № 2485766. Бюл. № 18. 27.06.2013.
10. Пронина И.Н., Матушкина О.В. Питательная среда для ризогенеза яблони и груши in vitro. Патент № 2485768. Бюл. № 18. 27.06.2013
CLONAL MiCROPROPAGATiON iN THE SYSTEM OF PRODUCTiON OF HiGH QUALiTY PLANTiNG MATERiAL OF PEAR CLONAL ROOTSTOCKS I.N. Pronina, O.V. Matushkina, R.D. Isaev
All-Russian Research institute on Horticulture named after i.V. Michurin
Summary. The paper deals with characteristics of propagation in vitro of pear clonal rootstocks PG 2, PG 12, PG 17-16 bred at All-Russian Research Institute on Horticulture named after I.V. Michurin considered as a major stage in the system of production of certified planting material. Pear rootstock culturing in vitro and in vivo has revealed high level of their regenerative capacity. The pear rootstock PG 12 is characterized by higher morphogenetic potential. In two months of production in in vitro culture the number of produced clonal was by 3,5-7,0 times higher in comparison with other genotypes. For the first time for clonal micropropagation complex water-soluble substance is considered for using as a basic nutrient medium in combination with conventional Murasige-Skoog and Quarine-Lepuavre medium and its efficiency depends on genotypic plant characteristics. The given nutrient medium has no significant effect on the propagation coefficient of studied pear clonal rootstocks that varies in PG 2 from 5,5 up to 6,3 pieces-explant and PG 12 - from 8,4 up to 10,2 pieces-explant but provides increase of number of microshoots suitable for rooting by 22,5.44,2%. Microshoot culturing on the medium with complex water-soluble promotes acceleration of rhizogenesis induction by 1.2 weeks in all clonal rootstocks and especially in PG 17-16 that shows root formation already in 10 days and 93.3% of rooted microshoots while on Quarine-Lepuavre medium the given index can be achieved only in 4 weeks. Usage of the complex water-soluble has a positive aftereffect on establishment of pear plant-regenerates ex vitro resulting in increase at 7,1% (PG 17-16).33,3 (PG 12) in comparison with Quarine-Lepuavre medium. Usage of plants propagated by in vitro method increased productivity of pear clonal rootstock mother bed in 1,1-1,4 times. Keywords: pear, clonal rootstock, clonal micropropagation, nutrient media, mother bed, productivity.
маточника клоновых подвоев груши
Подвой Способ Количество однолетних побегов Средняя длина побе- Средняя суммарная
размноже- на 1 маточном на 1 га, тыс. длина по-
ния кусте, шт. шт. гов, см бегов, см
2011 г.
ПГ 2 контроль 8,2 303,4 77,0 631,2
in vitro 9,4 347,8 82,3 773,6
ПГ 17-16 контроль 6,9 255,3 84,4 582,1
in vitro 7,3 270,1 89,5 653,4
ПГ 12 контроль 7,6 281,2 78,6 597,6
in vitro 8,8 325,6 82,8 728,6
НСР05 0,6 21,8 4,4 47,9
2012 г.
ПГ 2 контроль 11,2 414,4 60,9 682,1
in vitro 12,5 462,5 65,6 820,0
ПГ 17-16 контроль 7,8 288,6 69,3 540,5
in vitro 9,5 351,5 74,1 704,0
ПГ 12 контроль 10,2 377,4 63,1 643,6
in vitro 12,1 447,7 67,3 810,7
НСР05 1,1 34,1 3,5 39,9
2013 г.
ПГ 2 контроль 8,2 304,6 67,8 555,9
in vitro 10,3 381,1 73,5 757,1
ПГ 17-16 контроль 5,9 217,1 86,9 512,7
in vitro 7,4 273,8 88,1 651,9
ПГ 12 контроль 6,9 254,1 81,1 559,6
in vitro 9,5 351,5 84,4 801,8
НСР05 1,4 43,2 7,5 92,5
