CC BY
66
КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ДИС КЕРАТОЗОВ ШЕЙКИ МАТКИ И ЦЕРВИКАЛЬНЫХ ИНТРАЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ НЕОПЛАЗИЙ
И.И. ФРОЛОВА
Госпиталь для ветеранов войн № 2. Москва, 109472, Волгоградский проспект, д. 168
И.И. БАБИЧЕНКО
Кафедра патологической анатомии. РУДН Москва, 117198, ул. Миклухо-Маклая, д.8
В статье изложены результаты комплексного клинико-морфологического исследования 210 пациенток с гистологически подтвержденной патологией эктоцервикса. Иммуногистохимическим методом изучены: локализация эстрогеновых рецепторов в эктоцервиксе, локализация антител к папилломавирусам 16 и 18 типов, факторы апоптоза Р53 и ВСЬ-2, пролиферативная активность изучалась с помощью моноклональных антител к К|- 67 Выявлена корреляция между клиническими проявлениями гиперэстрогении и молекулярными изменениями эктоцервикса
Рак шейки матки (РШМ) является одной из наиболее серьезных медицинских и социальных проблем женского репродуктивного здоровья в экономически развитых странах и остается убийцей номер один в развивающихся странах. Ежегодно в мире от РШМ умирает около 23! ООО женщин и диагностируется около 370 ООО новых случаев РШМ [17]. Данные литературы свидетельствуют о том, что снижение заболеваемости раком шейки матки в основном происходит за счет старших возрастных групп, а среди женщин до 30 лет отмечается тревожная тенденция к ее повышению [19]. Считается, что снижения смертности от рака только за счет совершенствования методов лечения собственно опухоли достигнуть нельзя. Известно также, что тайна рака скрыта в предраке. Следовательно, ключ к решению проблемы снижения заболеваемости РШМ находится в области профилактики, ранней диагностики, своевременного и адекватного лечения фоновых и предраковых заболеваний шейки матки.
Общеизвестна прямая связь между вирусами папилломы человека (ВПЧ) типов высокого риска и развитием предраковых состояний и РШМ, однако роль кофакторов опухолевой трансформации изучена недостаточно. К перспективным направлениям дальнейшего изучения роли ВПЧ в этиологии и патогенезе цервикальных интраэпителиаль-ных неоплазий (ЦИН) и РШМ относят поиск инициирующих факторов [9], одним из которых может быть гиперэстрогенемия. Поэтому изучение особенностей распределения эстрогеновых рецепторов при дискератозах шейки матки (ДШМ) и неопластических изменениях эктоцервикса представляется нам актуальным. Кроме того, до сих пор мало изучена взаимосвязь между различными видами гинекологической патологии, характеризующейся гиперэстрогенией и молекулярными изменениями эпителиальных клеток эктоцервикса при фоновых и предраковых заболеваниях шейки матки.
В то же время нарушение генетически запрограммированных процессов клеточной гибели может привести к неуправляемому со стороны гормональной системы организма клеточному росту и развитию в шейке матки неоплазии либо рака, в связи с чем исследования, направленные на изучение экспрессии факторов апоптоза в эпителиальных клетках эктоцервикса считаются весьма перспективными [18].
Материал и методы исследования.
С целью изучения взаимосвязи между различными видами гинекологической патологии, характеризующейся гиперэстрогенией и молекулярными изменениями эктоцервикса при ДШМ и ЦИН, нами проведено комплексное клинико-морфологическое исследование 210 пациенток в возрасте от 19 до 79 лет с гистологически подтвержденными изменениями эктоцервикса. Для удобства оценки результатов исследований все пациентки были разделены на 3 клинические группы в зависимости от степени поражения эктоцервикса. В первую группу вошли 115 женщин с диагнозом дискератоз шейки матки, во вторую группу мы объединили больных ЦИН 1 и дискератозом шейки матки с атипией легкой степени (63 человека), третью группу составили 32 пациентки с ЦИН И-Ш степе-
ни и дискератозом шейки матки с атипией средней и тяжелой степени. 196 пациенткам произведены прицельная биопсия шейки матки, гистероскопия и раздельное диагностическое выскабливание слизистой оболочки матки, 2 больным - электроконизация шейки матки, 12 пациенток были прооперированы в объеме экстирпации матки. Всем пациенткам было проведено комплексное обследование, включающее клиническое исследование, специальное гинекологическое исследование (расширенная кольпоскопия), гистологическое исследование операционного материала или прицельно взятого биоптата. По показаниям проводилось УЗИ органов малого таза. Клиническое исследование было традиционным и включало изучение анамнеза жизни, анамнеза заболевания, данных объективного исследования, общепринятых в гинекологии. Обработка полученных образцов ткани шейки матки осуществлялась по стандартной гистологической методике.
Иммуногистохимическим методом исследовали операционный материал и (или) биоптаты, взятые с атипично измененного участка шейки матки 18 пациенток из различных клинических групп. Семь препаратов с участками неизмененного эктоцервикса служили контролем в гистологических и иммуногистохимических исследованиях. Иммуногистохимическим методом изучены особенности распределения эстрогеновых рецепторов, экспрессия факторов апоптоза Р53 и BCL-2, пролиферативная активность, локализация вирусных антигенов ВПЧ 16 и 18 типов в неизмененных эпителиальных клетках шейки матки, при простом дискератозе, дискератозе с атипией и ЦИН различной степени тяжести.
Иммуногнстохнмнческнй метод [3, 16]. Из фиксированных в нейтральном формалине и залитых в парафин кусочков ткани эктоцервикса делали срезы толщиной 4 мкм. Выявление тканевых антигенов проводили авидин-биотиновым методом, в котором био-тинилированные вторичные антитела реагируют с соответствующими молекулами пе-роксидазно-конъюгированного стрептовидина. В качестве вторичных использовали ан-тимышиные биотинилированные антитела козы фирмы ИМТЕК (Россия) в концентрации 1:100 и конъюгированную со стрептовидином полипероксидазу (ИМТЕК, Россия) в концентрации 1: 100. В качестве демаскирующего приема проводили нагревание стекол со срезами в микроволновой печи. Использовали мышиные моноклональные антитела к эстрогеновому рецептору (ER; клон 1D5, DAK.O, США); BCL-2 (клон 100/D5, Novocastra, Англия); Ki-67 (клон Ki-S5, DAKO, США); Р53 (клон DO-7, DAKO, США) и папилломавирусам (HPV, клон К1Н8 DAKO, США). На каждом стекле один срез (контрольный) обрабатывали неиммунной мышиной сывороткой (DAKO, США). Срезы докрашивали гематоксилином Майера. Все буферные растворы, используемые в работе, готовили на деионизированной воде. При интерпретации результатов распределения продуктов иммуногистохимической реакции учитывали локализацию и интенсивность окрашивания, которую оценивали полуколичественным методом по следующим критериям: (-) - реакция отсутствует, (+) - слабая реакция, (++) - умеренная реакция, (+++) -сильная, выраженная реакция.
Результаты исследования и их обсуждение.
Прежде всего следует отметить отсутствие достоверных различий в возрастных показателях пациенток первой и второй клинических групп, в которых максимальное количество больных приходится на возрастную группу от 40 до 49 лет. В то же время большая часть пациенток с ЦИН II-III находится в возрастной группе от 20 до 30 лет, что можно связать с высокой вероятностью инфицирования ВПЧ в группе сексуально активных молодых женщин.
На момент исследования при расширенной кольпоскопии у всех пациенток определялся атипичный эпителий, представленный различными кольпоскопическими картинами (лейкоплакия, уксусно-белый эпителий, мозаика, пунктация и их сочетания). Размер поражения при первичном осмотре варьировал от 1/8 до всего эктоцервикса. Преобладали изменения, занимающие 1/2 часть эктоцервикса. У 2/3 больных участки атипичного
эпителия определялись в зоне трансформации, у 1/3 наблюдались локальные изменения. Результаты исследования свидетельствовали об отсутствии значимых различий между кольпоекопическими картинами у больных трех клинических групп. Таким образом, наше исследование подтвердило мнение многих авторов, утверждающих, что под любой кольпоскопической картиной атипического эпителия может скрываться вся гамма морфологических признаков эпителиальных неоплазий и преклинического рака [1,5].
В клинической части работы проанализированы анамнестические данные, касающиеся менструальной и репродуктивной функций, перенесенных ранее гинекологических заболеваний, методов контрацепции. Наше исследование не показало какой-либо зависимости возникновения ДШМ и ЦИН от наличия и количества родов и абортов, а также от применения оральных контрацептивов.
В результате изучения анамнеза и клинического обследования нами выявлены следующие особенности: в гинекологическом анамнезе преобладают доброкачественные опухоли миометрия, эндометриоз матки, гиперпластические процессы эндометрия и эн-доцервикса и нарушения функции яичников.
Характерно, что 129 пациенток из всех 3 клинических групп (61%) имеют в анамнезе заболевания шейки матки: подавляющему большинству из них (84%) ранее был поставлен диагноз «эрозия шейки матки».
Нами установлено, что дискератозы и ЦИН наиболее часто наблюдаются у больных, имеющих в анамнезе эктопию шейки матки (ЭШМ), особенно пролеченную методом ДЭК (диатермоэлектрокоагуляции). Вероятно, причиной этого является невозможность точного контроля глубины воздействия при выполнении данной методики, а также нарушение трофики тканей и сохранение пролиферативной активности после коагуляции [5]. Кроме того, ДЭК приводит к изменению количества рецепторов в эктоцервиксе и нарушению их чувствительности к нормальному содержанию эстрогенов в крови [8]. Поэтому метод ДЭК можно считать мало приемлемым для лечения фоновых заболеваний шейки матки. Кроме тогЬ, мы выяснили, что подавляющему большинству пациенток, имеющих в анамнезе лейкоплакию шейки матки и ЦИН (91,6% и 78% соответственно), лечения не проводилось. Исходя из этого, мы считаем некорректной тактику
Рис. 1. Процент выявления различных видов гинекологической патологии, сочетающейся с ДШМ, ЦИН I, ЦИН П-Ш
длительного наблюдения при данных видах патологии шейки матки.
Во всех исследуемых группах высок процент нарушений менструального цикла (в основном - по типу мено- и метроррагии). Максимальное количество таких пациенток приходится на группу ЦИН Н-Ш (63%), минимальное - на группу с ЦИН I (24%).
На рисунке представлено сочетание различных видов гинекологической патологии, характеризующейся гиперэстрогенией с ДШМ и ЦИН. Обращает на себя внимание высокий процент выявления миомы матки у пациенток с изучаемыми нами заболеваниями - он составил 39% среди женщин всех 3 клинических групп, что на 9% выше, чем в популяции. Наиболее высок процент сочетания миомы матки с простым дискератозом. Минимальным был процент сочетания миомы матки с ЦИН Н-Ш, в то же время в данной группе мы наблюдали наибольшее количество больных с симптомной миомой матки. Максимальное количество больных эндометриозом матки находится в группе с ЦИН Н-Ш, в этой же фуппе самый высокий процент пациенток, имеющих клинические проявления эндометриоза матки. Сочетание миомы матки с эндометриозом матки в нашем исследовании наблюдалось в 51% случаев, что не выше чем в популяции (до 60%). Наибольшее количество случаев гиперпластических процессов эндометрия и эндоцер-викса мы наблюдали в группе с ДШМ, наименьшее •- в группе с ЦИН I.
Согласно мнению исследователей, изучающих гиперпластические процессы гормо-нальнозависимымых органов женской репродуктивной системы, однотипность премор-бидного фона у пациенток с различными сочетаниями доброкачественных заболеваний женских половых органов предполагает сходство патогенетических механизмов их развития [7]. Этим, вероятно, можно объяснить нередкое последовательное выявление указанных патологических состояний в течение жизни женщины. Таким образом, наше исследование выявило сочетание клинических проявлений гиперэстрогении с морфологическими изменениями эктоцервикса при дискератозе и ЦИН и свидетельствует о том, что теория системного подхода к лечению различных звеньев репродуктивной системы с позиции целостного организма актуальна и для такой локальной патологии, как патология шейки матки. Мы считаем, что в группу риска по возникновению лейкоплакии шейки матки и ЦИН следует включить пациенток с гинекологической патологией, характеризующейся гиперэстрогенией (миома матки, эндометриоз матки, рецидивирующие гиперпластические процессы эндометрия).
Помимо применения деструктивных методов и иммуномодуляции для лечения ДШМ и ЦИН, нам представляются высокофункциональными и патогенетически обоснованными все виды воздействия на функцию яичников, снижающие продукцию эстрогенов у пациенток с хронической гиперэстрогенией. Данное положение актуально для профилактики ДШМ и ЦИН, а также для профилактики рецидивов этих заболеваний.
Пролиферативная активность эпителиальных клеток шейки матки определяется уровнем эстрогеновых гормонов в организме, а гормоночувствительность эпителиальных клеток связана с наличием специализированных ядерных рецепторов. Проведенные нами иммуногистохимические исследования показали, что в неизмененном эпителии шейки матки имеются рецепторы к эстрогенам, которые локализуются в ядрах базального и парабазального клеточных слоев. Известно, что клетки этих слоев эктоцервикса обладают митотической активностью, которая повышается по мере повышения уровня эстрогенов в крови [4]. При ДШМ мы наблюдали резкое увеличение количества клеток с рецепторами к эстрогенам и их выраженную экспрессию в ядрах клеток, что сочеталось с гиперплазией клеток парабазального слоя и явлениями акантоза с формированием стромальных сосочковых структур. При ЦИН-1 отмечалось уменьшение количества клеток с положительной иммуногистохимической реакцией на эстрогеновые рецепторы (даже по сравнению с контролем). Та же тенденция была выявлена нами у пациенток с ЦИН П-Ш степени: практически все эпителиальные клетки с явлениями неоплазии были лишены рецепторов к эстрогенам, что свидетельствует о постепенной утрате гормоно-чувствительности тканей эктоцервикса по мере повышения степени неоплазии. Подоб-
ное явление нередко отмечается при прогрессии опухолевого роста [2]. Полученные нами данные подтверждаются результатами исследований J.L. Gonzalez Sanchez et al. [12], в которых показано, что уровень эстрогеновых рецепторов у здоровых женщин выше, чем у пациенток с неопластическими поражениями шейки матки. В работе К.К. Kim et al. [ 15] также показано снижение уровня эстрогеновых рецепторов при ЦИН.
Таким образом, неопластическая трансформация эктоцервикса приводит к нарушению центрального контроля над ростом эпителиальных клеток. Тем не менее, учитывая гот факт, что для внедрения ВПЧ нужны именно активно пролиферирующие клетки па-рабазального эпителиального слоя, количество которых резко увеличивается на фоне гиперэстрогении, ее следует рассматривать как один из факторов, способствующих формированию неопластических поражений шейки матки.
Пролиферативную активность эпителиальных клеток шейки матки мы исследовали с помощью моноклональных антител к белку Ki-67. Ki-67 - универсальный маркер для оценки клеточного цикла, выявляющий пролиферирующие клетки, находящиеся на разных фазах цикла, отражая весь пул делящихся клеток [6]. В неизмененном эпителии и при дискератозе положительная иммуногистохимическая реакция на Ki- 67 наблюдается только в ядрах отдельных клеток парабазального слоя вокруг стромальных сосочков, что свидетельствует о высокой пролиферативной активности клеток этого слоя. При Д111М положительная реакция отмечается также вокруг стромальных сосочков, составляющих основу акантоза. По мере увеличения степени неоплазии количество клеток с положительной ядерной реакцией на Ki-67 прогрессивно увеличивалось, они занимали от трети до всей толщины эпителиального слоя. При ЦИН-Ш активно пролиферирующие клетки встречаются во всех слоях эктоцервикса. Наши данные подтверждают исследования других авторов, свидетельствующие о том, что экспрессия Ki-67 увеличивается по мере нарастания степени неопластических изменений эпителия шейки матки [10, 13].
В настоящее время большое значение придается папилломовирусному генезу неопластических изменений шейки матки, в связи с чем нами была изучена локализация антигенов ВПЧ 16 и 18 типов. Мы получили отрицательные результаты иммуногисто-химической реакции с моноклональными антителами к белкам ВПЧ в неизмененных эпителиальных клетках. Выраженная экспрессия этих антигенов выявлена нами только при ЦИН III, при этом реакция отмечалась в аномальных по форме и размерам ядрах клеток всех слоев эктоцервикса. Таким образом, еще раз подтверждена ведущая роль ВПЧ 16 и 18 типов в генезе предраковых заболеваний и рака шейки матки.
С целью оценки процессов апоптоза мы изучили экспрессию белков-регуляторов апоптоза р53 и BCL-2 в клетках нормального и неопластического эктоцервикса.
В неизмененном эпителии антиапоптозный фактор BCL-2 выявлялся только в цитоплазме клеток базального слоя, расположенных в виде тонкой полоски. Практически сходный тип распределения продуктов этого белка был отмечен и при простом дискератозе. По мере нарастания неопластических изменений в клетках базального слоя экспрессия BCL 2 уменьшалась. При ЦИН III, вместо монослойной полоски в базальном клеточном слое, выявлялись отдельные клетки с положительной реакцией на BCL 2, расположенные по всему эктоцервиксу, включая и поверхностные слои. Таким образом, наши исследования не выявили прямой связи высокой пролиферативной активности эпителиальных клеток при ЦИН III со сверх-экспрессией антиапоптозного фактора BCL-2.
Дальнейшее изучение процессов апоптоза в эктоцервиксе было проведено с моноклональными антителами к продуктам проапоптозного гена р53. Проведенные исследования показали, что в неизмененном эктоцервиксе продукты этого гена иммуногистохи-мическими методами не выявляются. По мере нарастания степени неопластических изменений в эпителии шейки матки экспрессия продуктов р53 увеличивается: они распределяются в ядрах клеток с признаками атипии во всех слоях эктоцервикса. По результатам наших исследований и по данным других авторов [11, 14], в неопластических тка-
нях шейки матки экспрессия р53 увеличивается в значительной степени. Поскольку считается, что иммуногистохимическая положительная реакция полностью зависит от наличия мутантного типа Р53 [6], полученные нами данные позволяют предположить, что экспрессия р53 может отражать атипические изменения в клетках эктоцервикса в процессе их неопластической трансформации.
Результаты иммуногистохимических исследований суммированы в табл. 1.
Таблица 1
Полу количественный анализ распределения белков в эпителиальных клетках шейки матки в зависимости от гистологического диагноза
Гистологический диагноз Число пациентов ER BCL-2 Ki-67 Р-53 HPV
Нормальный эпителий 7 ++ +-Н- + - -
ДМШ 5 +++ ++ + - -
ЦИН I 7 + + -н- + +
ЦИН II-III 6 + ++ -Н-+ ++ ++
Таким образом, на основании проведенных исследований разработан комплексный клинико-морфологический подход к оценке предраковых поражений эктоцервикса, который может быть использован для ранней диагностики заболеваний шейки матки. Исходя из предложенной нами патогенетической концепции гормонозависимости диске-ратоза и неопластических поражений шейки матки, возможна разработка нового направления патогенетической терапии и принципов профилактики этих распространенных заболеваний.
Литература
1. Бауэр Г. Цветной атлас по колыюскопии. / Пер с немецкого. Под ред. С И. Роговской - М.; ГЭОТАР-МЕД 2002. - С. 256-257.
2. Берштейн Л.М. Гормональный канцерогенез. - СПб : Наука - 2000. - 199 с.
3 Гуревич Л.Е., Исаков В.А. Использование в иммуногистохимических исследованиях метода восстановле-
ния антигенной специфичности воздействием микроволн на ткани, фиксированные формалином и заключенные в парафин. // Арх. Патол. - 1999 - Т. 61, № 2, С. 48-50.
4. Минкина Т.Н.. Манухин И.Б., Франк Г. А. Предрак шейки матки - М : Аэрограф-медиа, 2001 - 112с
5 Радзинский В.Е.. Буянова С.Н., Манухин И.Б., Кондриков Н И Патология влагалища и шейки матки / Под
редакцией В.И Краснопольского - М.: Медицина, 1997 - С 182-192
6 Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека /Под ред С В. Петрова, Н.Г. Райхмана. /Казань. - 2000. - 287 с
7 Савицкий ГА. Локальная гиперэстрадиолемия в патогенезе гиперпластических процессов эндометрия. // Вопросы онкол -1991- № 2. С. 164-169.
8. Серов В Н. Прилепская В.Н.. Пшеничникова ТЯ и др. Практическое руководство по гинекологической эндокринологии М.: Русфарммед. - 1995. - 425 с.
9. Сирионен К. Репродуктивное здоровье (в 2-х томах). Т.2. Редкие инфекции Пер. с англ / Под ред. Л Кейта, Г.Бергера, Д. Эдельмана. - М.: Медицина, 1998. - С. 169-189
10. Франк Г. А., Минкина Г И.. Симонова ТВ и др. Антиген ядер пролиферирующих клеток при предраковой патологии шейки матки. // Арх. Пат. - 1997. - Т. 59, № 1, С. 30-33.
11. Akasofu М., Oda У. Immunohystochemical detectionof р53 in cervical epithelial lesions with or without in 16 and 18. //Virchows Arch. - 1995. -V. 425, No. 6, P. 593-602.
12 Gonzalez Sanchez J.L.. Chavez Brambila J., Maricela Roman A. et al. // Ginecol. Obstet. Mex. - 2001 - Vol. 69. - P. 1-5.
13. Isncson С. Kessis T.D.. Hendrick L., Cho K.R Both cell proliferation and apoptosis increase with lesion grade in cervical neoplasia but do not correlate with human papillomavirus type. // Cancer Res. - 1996. - V. 53, No. 4, P. 669-674.
14. Kanai M . Shiozava Т.. Xin L. et al. Immunocytochemical detection of sex steroid receptors, cyclins and cyclin-dependent kinases in the normal and neoplastic squamous epithelia of the uterine cervix. // Cancer. - 1998 - V. 82, No. 9, P. 1709-1719.
15. Kim K.K., Jang T.J., Kim J.R. HSP70 and I. R expression in cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer. Hi. Korean Med. Sci.- 1998.-V. 13,No. 4, P. 383-388.
16. Madhabanda Snr. Application of avidin-biotin complex for the localization of estradiol receptor in target tissue using monoclonal antibodies. / In: Techniques in immunocytochemistry. Ed. by G.R. Bullock and P. Petrusz. -London-NY-Tokio: Acad. Press, 1985. - P. 43-45.
17. Parkin M. Personal communication. / IARC, 2000 (July).
18 Sheets E.E.. Crum C P . Yeh J. Association between cervical neoplasia and apoptosis as detected by in citu nuclear labeling. // Gynecol.Oncol. - 1996 - V. 63, No. 1, P. 94-100.
19. Shoell W.M.J., Jnnicek M.F., Mirhashemi R Epidemiology and biology of cervical cancer // Seminars in Surgical Oncology - 1999 -V. 16, P. 203-211.
CLINICAL-MORPHOLOGICAL INVESTIGATIONS OF CERVICAL DYSKERATOSIS AND CERVICAL
INTRAEPITHELIAL NEOPLASIA
1.1. FROLOVA
Hospital of the Veterans of Wars № 2, Moscow (Head of Hospital - G.M. Mestergazy) Moscow, 109472, Volgogradsky av., 168,
I.I. BABICHENKO
Department of Pathology RPFU, Moscow, 117198, Miklukho-Maklaya St., 8 Medical faculty
Immunohistochemical study was carried out with monoclonal antibodies to estrogen receptors (ERs), Ki-67, BCL-2, P53 and human papillomaviruses (HPV) at normal cervices (7 cases), cervical dyskeratosis (5), CIN 1 (7) and CIN II-lll (6). The correlations were also researched between hyperestrogenemia and molecular changes in exocervix. About two thirds of patients with dyskeratosis (115), CIN I (63) and CIN II-lll (32) had clinical signs of hyperestroge-nemia, which led to proliferation of estrogensensitive parabasal cells.
Due to neoplastic epithelial transformation, the number of cells with K.i-67, P53, BCL-2 and HPV positive reactions in nuclei increased, wile ERs expression decreased. Because for HPV replications are needed active proliferative parabasal cells, we consider hyperestrogenemia as one of prooncogenous factors at human cervix.
