Научная статья на тему 'Клиническое применение массивного параллельного секвенирования в молекулярной диагностике наследственных болезней накопления гликогена среди детского населения России'

Клиническое применение массивного параллельного секвенирования в молекулярной диагностике наследственных болезней накопления гликогена среди детского населения России Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

CC BY
304
86
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ГЛИКОГЕНОВАЯ БОЛЕЗНЬ У ДЕТЕЙ / GLYCOGEN DISEASE IN CHILDREN / МАССИВНОЕ ПАРАЛЛЕЛЬНОЕ СЕКВЕНИРОВАНИЕ / MASSIVE PARALLEL SEQUENCING / МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА / MOLECULAR GENETIC DIAGNOSIS / ГЕНЫ / GENES / МУТАЦИИ / MUTATIONS

Аннотация научной статьи по биотехнологиям в медицине, автор научной работы — Савостьянов Кирилл Викторович, Сурков Андрей Николаевич, Намазова-баранова Лейла Сеймуровна, Жанин Илья Сергеевич, Пушков Александр Алексеевич

Разработана и валидирована технология массивного параллельного секвенирования с целью молекулярно-генетической диагностики наследственных болезней накопления гликогена. Диагноз был верифицирован у 89 (92,6%) из 96 пациентов в возрасте от 15 мес до 18 лет. Самой частой формой гликогенозов у детей является гликогеновая болезнь (ГБ) IX типа, выявленная в 29,3% случаев, редкой формой гликогенозов оказалась ГБ IV типа, верифицированная в 1,1% случаев. У 39 (43,8%) детей из 89 генетически подтвержденных было обнаружено 35 (44,3%) неописанных ранее мутаций из 79 патогенных вариантов, выявленных в 9 (45%) различных генах из 20 исследованных, что указывает на значительную гетерогенность генетических факторов развития ГБ в российской популяции. Установлено, что мутации c.247C > T гена G6PC, c.1042_1043del гена SLC37A4, c.3980G >A и c.1423 + 1G >A гена AGL, c.-32-13T > G гена GAA, а также c.884G > A гена PHKA2 характерны для российской популяции детей с ГБ. Показана высокая чувствительность и специфичность массивного параллельного секвенирования для поиска однонуклеотидных замен в кодирующих и прилегающих интронных областях, а также небольших делеций и дупликаций генов, мутации в которых приводят к развитию ГБ. Массивное параллельное секвенирование представляется необходимым для быстрой постановки диагноза ГБ, своевременного назначения адекватного лечения, профилактики осложнений, улучшения качества жизни пациентов.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по биотехнологиям в медицине , автор научной работы — Савостьянов Кирилл Викторович, Сурков Андрей Николаевич, Намазова-баранова Лейла Сеймуровна, Жанин Илья Сергеевич, Пушков Александр Алексеевич

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

CLINICAL APPLICATION OF MASSIVE PARALLEL SEQUENCING IN MOLECULAR DIAGNOSTICS OF HEREDITARY DISEASES OF GLYCOGEN ACCUMULATION IN THE CHILDREN POPULATION OF THE RUSSIAN FEDERATION

There has been developed and validated the technology for massive parallel sequencing for the purpose of molecular genetic diagnosis of hereditary glycogen storage diseases. Among 96 patients aged of from 15 months up to 18 years, the diagnosis was verified in 89 (92.6%) children. Glycogen storage disease (GSD) type IX appeared to be the most frequent form of glycogenosis in children, diagnosed in 29.3% of cases, GSD type IV, verified in 1.1% of cases, was a rare form of glycogenesis. In 39 (43.8%) out of 89 genetically confirmed children, there were revealed 35 (44.3%) of the previously undescribed mutations from 79 pathogenic variants found in 9 (45%) of different genes of 20 examined cases, indicating to a significant heterogeneity of genetic factors of the development of GSD in the Russian population. Mutations c.247C>T of the G6PC gene, c.1042_1043del of the SLC37A4 gene, c.3980G>A and c.1423+1G>A of the AGL gene, c.-32-13T>G of the GAA gene, and c.884G>A of the PHKA2 gene were been established to be characteristic for the Russian population of GSD children. There was shown the high sensitivity and specificity of the massive parallel sequencing for the search for single nucleotide substitutions in coding and adjacent intron regions, as well as small deletions and duplications of genes, mutations in which lead to the development of GSD. Massive parallel sequencing is necessary for the rapid diagnosis of GSD, timely appointment of the adequate treatment, prevention of complications, which will improve the quality of the life of GSD patients.

Текст научной работы на тему «Клиническое применение массивного параллельного секвенирования в молекулярной диагностике наследственных болезней накопления гликогена среди детского населения России»

132

ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ

Оригинальные статьи

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017

УДК 616-008.934.586-055.5/.7-07/:577.21.08

Савостьянов К.В., Сурков А.Н., Намазова-Баранова Л.С., Жанин И.С., Пушков А.А., Басаргина Е.Н., Никитин А.Г., Потапов А.С., Пахомов А.В., Баранов А.А.

КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ МАССИВНОГО ПАРАЛЛЕЛЬНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ В МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ НАКОПЛЕНИЯ ГЛИКОГЕНА СРЕДИ ДЕТСКОГО НАСЕЛЕНИЯ РОССИИ

ФГАУ «Национальный научно-практический центр здоровья детей» Минздрава России, 119991, г Москва, Россия, Ломоносовский просп., д. 2, стр. 1

Разработана и валидирована технология массивного параллельного секвенирования с целью молекулярно-генетической диагностики наследственных болезней накопления гликогена. Диагноз был верифицирован у 89 (92,6%) из 96 пациентов в возрасте от 15 мес до 18 лет. Самой частой формой гликогенозов у детей является гликогеновая болезнь (ГБ) IXтипа, выявленная в 29,3% случаев, редкой формой гликогенозов оказалась ГБIVти-па, верифицированная в 1,1% случаев. У 39 (43,8%) детей из 89 генетически подтвержденных было обнаружено 35 (44,3%) неописанных ранее мутаций из 79 патогенных вариантов, выявленных в 9 (45%) различных генах из 20 исследованных, что указывает на значительную гетерогенность генетических факторов развития ГБ в российской популяции. Установлено, что мутации c.247C > Tгена G6PC, c.1042_1043del гена SLC37A4, C.3980G > A и c.1423 + 1G >A гена AGL, C.-32-13T > G гена GAA, а также c.884G > A гена PHKA2 характерны для российской популяции детей с ГБ. Показана высокая чувствительность и специфичность массивного параллельного секвенирования для поиска однонуклеотидных замен в кодирующих и прилегающих интронных областях, а также небольших делеций и дупликаций генов, мутации в которых приводят к развитию ГБ. Массивное параллельное секвенирование представляется необходимым для быстрой постановки диагноза ГБ, своевременного назначения адекватного лечения, профилактики осложнений, улучшения качества жизни пациентов.

Ключевые слова: гликогеновая болезнь у детей; массивное параллельное секвенирование; молекулярно-генетическая диагностика; гены; мутации.

Для цитирования: Савостьянов К.В., Сурков А.Н., Намазова-Баранова Л.С., Жанин И.С., Пушков А.В., Басаргина Е.Н., Никитин А.Г., Потапов А.С., Пахомов А.В., Баранов А.А. Клиническое применение массивного параллельного секвенирования в молекулярной диагностике наследственных болезней накопления гликогена среди детского населения России. Российский педиатрический журнал. 2017; 20 (3): 132-139. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/1560-9561-2017-20 (3) -132-139

Savostyanov K.V., Surkov A.N., Namazova-Baranova L.S., Zhanin I.S., Pushkov A.A., Basargina E.N., Nikitin A.G., Potapov A.S., PakhomovA.V., BaranovA.A.

clinical application of massive parallel sequencing in molecular diagnostics of hereditary

DISEASES of GLYcoGEN AccUMULATioN IN THE cHILDREN PoPULATioN of THE RUSSIAN FEDERATioN

National Scientific and Practical center of children's Health, 2, bld. 1, Lomonosov avenue, Moscow, 119991, Russian Federation

There has been developed and validated the technology for massive parallel sequencing for the purpose of molecular genetic diagnosis of hereditary glycogen storage diseases. Among 96 patients aged offrom 15 months up to 18 years, the diagnosis was verified in 89 (92.6%) children. Glycogen storage disease (GSD) type IX appeared to be the most frequent form of glycogenosis in children, diagnosed in 29.3% of cases, GSD type IV, verified in 1.1% of cases, was a rare form of glycogenesis. In 39 (43.8%) out of 89 genetically confirmed children, there were revealed 35 (44.3%) of the previously undescribed mutations from 79 pathogenic variants found in 9 (45%) of different genes of 20 examined cases, indicating to a significant heterogeneity of genetic factors of the development of GSD in the Russian population. Mutations c.247C>T of the G6PC gene, c.1042_1043del of the SLC37A4 gene, c.3980G>A and c.1423+1G>A of the AGL gene, c.-32-13T>G of the GAA gene, and c.884G>A of the PHKA2 gene were been established to be characteristic for the Russian population of GSD children. There was shown the high sensitivity and specificity of the massive parallel sequencing for the search for single nucleotide substitutions in coding and adjacent intron regions, as well as small deletions and duplications of genes, mutations in which lead to the development of GSD. Massive parallel sequencing is necessary for the rapid diagnosis of GSD, timely appointment of the adequate treatment, prevention of complications, which will improve the quality of the life of GSD patients.

Keywords: glycogen disease in children; massive parallel sequencing; molecular genetic diagnosis; genes, mutations.

Для корреспонденции: Савостьянов Кирилл Викторович, канд. биол. наук, зав. лаб. молекулярной генетики и клеточной биологии ФГАУ ННПЦЗД Минздрава России, e-mail: [email protected]

Russian pediatric journal (Russian journal). 2017; 20(3) DOI: http://dx.doi.org/10.18821/1560-9561-2017-20-3-132-139

133.

ORIGINAL ARTICLE

For citation: savostyanov K.V., surkov A.N., Namazova-Baranova L.s., Zhanin I.s., Pushkov A.A., Basargina E.N., Nikitin A.G., Potapov A.s., Pakhomov A.V., baranov A.A. clinical application of massive parallel sequencing in molecular diagnostics of hereditary diseases of glycogen accumulation in the children population of the Russian Federation. Rossiiskii Pediatricheskii Zhurnal (Russian Pediatric Journal). 2017; 20(3):132-139. (in Russian). DOi: http://dx.doi. org/10.18821/1560-9561-2017-20-3-132-139

For correspondence: Kirill V. Savostyanov, MD, PhD, Head of the Laboratory of Molecular Genetics and Cell Biology of the National Scientific and Practical Center of Children's Health, 2, bld. 1, Lomonosov avenue, Moscow, 119991, Russian Federation. E-mail: [email protected]

Information about authors:

Namazova-Baranova L.S., http://orcid.org/0000-0002-2209-7531 Basargina E.N. http://orcid.org/0000-0002-0144-2885 Surkov A.N., http://orcid.org/0000-0002-3697-4283 BaranovA.A., https://orcid.org/0000-0003-3987-8112

Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Acknowledgement. The study had no sponsorship.

Received 05.04.2017 Accepted 20.04.2017

аследственные болезни накопления гликогена или гликогеновая болезнь (ГБ), код по МКБ - Е74.0 - это обширная группа генетически детерминированных заболеваний, причина развития которых - мутации в генах, кодирующих белки, способствующие образованию и распаду гликогена в печени, мышцах и других клеточных тканях. Частота встречаемости болезней накопления гликогена составляет 1 случай на 40 000 живых новорожденных в европейском регионе и 1 случай на 20 000-25 000 новорожденных в США [1, 2]. Показатели распространенности отдельных форм ГБ все еще недооценены в связи с их редкой встречаемостью, отсутствием эффективных алгоритмов молекулярно-генетической и биохимической диагностики.

Впервые гликогеноз описал Эдгар фон Гирке в 1929 г. [3]. В 1952 г. супруги Кори обнаружили дефицит печеночной глюкозо-6-фосфатазы не у всех пациентов со схожими клиническими проявлениями болезни, что позволило высказать предположение о гетерогенности гликогеновых болезней [4]. Однако только в 1978 г. удалось идентифицировать недостаточность внутриклеточного транспортера глюкозо-6-фосфата [5], что позволило разделить ГБ I типа на подтипы 1а (ОМ1М 232200) и 1Ь (ОМ1М 232220). Было установлено, что причиной формирования ГБ 1а типа служат мутации гена G6PC, длиной 12,5 т. п. н., расположенного в хромосомной области 17q21, который состоит из 5 экзонов и кодирует белок длиной 357 аминокислотных остатков с молекулярной массой 63 кДа, тогда как фактором развития ГБ 1Ь типа служат мутации гена SLC37A4 длиной 5,3 т. п. н., состоящего из 9 экзонов, который расположен в хромосомной области 1^23 и кодирует белок, состоящий из 427 аминокислотных остатков с молекулярной массой 46 кДа [6, 7].

В 1954 г. была идентифицирована болезнь Помпе (БП) как ГБ II типа (ОМ1М 232300), а в 1963 г. впервые описан фермент альфа-глюкозидаза и выявлено отсутствие этого фермента у больных ГБ II типа [8-10]. В основе патогенеза БП было выявлено патологическое изменение референсной последовательности гена GAA, длиной 18,31 т. п. н., расположенного в хромосомной области 17q25.3 и кодирующего альфа-глюкозидазу (молекулярной массой 105 кДа),

состоящую из 952 аминокислотных остатков [11]. Установлено также, что гликоген, содержащийся в печени и мышечных тканях пациента с ГБ III типа (ОММ 232400), имеет аномальную структуру благодаря коротким внешним цепям и представляет собой достаточно крупный белок, состоящий из 1532 аминокислот с молекулярной массой около 170 кДа [12-14].

Позднее было показано, что причиной развития ГБ IV типа (ОММ 232500) является дефицит альфа-1,4-глюкана, при этом ее патогенетической основой были патологические варианты гена GBE1, расположенного в хромосомной области 3р12.3, состоящего из 16 экзонов и кодирующего гликоген-ветвящий фермент ^ВЕ) альфа-1,4-глюкан : альфа-1,4-глюкан-6-гликозилтрансферазу, состоящую из 702 аминокислотных остатков и имеющую молекулярную массу 80,4 кДа [15-17].

Гликогеноз V типа (ОММ 232600) обусловлен сниженной активностью мышечной гликогенфосфо-рилазы, которая кодируется геном PYGM, расположенным в хромосомной области 1^13.1, состоящим из 20 экзонов [18, 19]. При ГБ VI типа (ОММ 232700) удалось обнаружить и описать 3 изоформы гликогенфосфорилазы с местами их преобладающей экспрессии и генами, которые их кодируют [20-22]. Было показано, что в основе ее патогенеза лежат мутации гена PYGL, расположенного в хромосомной области 14q22.1, состоящего из 20 экзонов и кодирующего гликогенфосфорилазу печени, состоящую из 845 аминокислотных остатков с молекулярной массой 97 кДа [23].

Формирование ГБ VII типа (ОМШ 232800) обусловлено недостаточностью мышечной изоформы фосфофруктокиназы, возникающей вследствие мутаций гена PFKM, расположенного в хромосомной области 12q13.11, состоящего из 24 экзонов и кодирующего белок, включающий 779 аминокислотных остатков с молекулярной массой 85 кДа [24, 25].

ГБ IX типа определяется мутациями в генах, кодирующих первые 3 субъединицы киназы фосфо-рилазы, что приводит к клиническим проявлениям ГБ Ш/а типа (ОММ 300559/306000); ГБ ГСЬ типа (ОММ 261750); ГБ Кс типа (ОММ 613027) соответственно. Ген PHKA2, расположенный в хромо-

оригинальная статья

сомной области Хр22, охватывает 91,3 т. п. н. и содержит 33 экзона, кодируя альфа-субъединицу печеночной киназы фосфорилазы, состоящую из 1235 аминокислотных остатков и экспрессирующуюся в клетках печени и головном мозге и не экспрессирующуюся в мышечной ткани [26]. ГБ КЬ типа возникает и развивается из-за мутаций гена PHKB, длиной 140 т. п. н., расположенного в хромосомной области 16q12, состоящего из 33 экзонов и кодирующего бета-субъединицу киназы фосфорилазы, состоящую из 1092 аминокислотных остатков и экспрессируе-мую как в печени, так и в мышечной ткани [27]. ГБ Кс типа характеризуется дефицитом фермента в печени, так как ген PHKG2, расположенный в хромосомной области 16р11, длиной 9,5 т. п. н., состоит из 10 экзонов и кодирует печеночную изоформу гамма-субъединицы киназы фосфорилазы, состоящую из 406 аминокислотных остатков [28]. ГБ типа IXd развивается вследствие мутаций гена PHKA1, расположенного в хромосомной области Xq13, длиной 133 т. п. н., состоит из 32 экзонов и кодирует мышечную изоформу альфа-субъединицы киназы фосфорилазы, состоящую из 1223 аминокислотных остатков молекулярной массой 138 кДа [29].

Другие формы наследственных болезней накопления гликогена встречаются крайне редко. К настоящему времени описаны мутации генов PGAM2, ШШ, ALDOA, ENO3, PGM1 и GYG1, вызывающие развитие ГБ X, XI, XII, XIII, XIV и XV типов соответственно.

Основными клиническими проявлениями печеночных форм ГБ являются выраженная гепатомега-лия, задержка роста и гипогликемия, а лабораторными - лактат-ацидоз, гиперлипидемия и гиперури-кемия [30]. Мышечные формы ГБ характеризуются непереносимостью физической нагрузки, мышечной слабостью и спазмами, возникающими из-за неспособности расщеплять гликоген в случае ГБ V типа либо ингибирования гликолиза в случае ГБ VII типа [31]. При БП поражаются сердце, почки и центральная нервная система [32]. Одни мутации гена могут вызывать фатальные формы ГБ с манифестацией в дородовом или неонатальном периоде, что приводит к гибели плода или смерти ребенка в течение первого года жизни, в то время как другие мутации того же гена могут выражаться полным отсутствием каких-либо клинических проявлений вплоть до взрослой жизни [33, 34].

Для верификации диагноза необходимо биохимическое исследование биопсийного материала печени либо мышц (за исключением БП), что в большинстве случаев не представляется возможным ввиду тяжелого состояния пациентов, тогда как проведение молекулярно-генетической диагностики генов-кандидатов методом секвенирования по Сэнгеру в большинстве случаев требует значительных материальных затрат и занимает много времени ввиду значительной генетической гетерогенности ГБ, что замедляет осуществление надлежащего ухода за больными детьми и затрудняет семейное медико-генетическое консультирование.

Массивное параллельное секвенирование, из-

вестное как секвенирование нового поколения, -точный и экономически эффективный метод выявления мутаций генома, в том числе для генетически гетерогенных заболеваний, вызванных мутациями в генах-кандидатах, связанных общим метаболическим путем [35, 36]. В связи с этим для оптимизации молекулярно-генетической диагностики ГБ у детей нами была использована технология массового параллельного секвенирования путем анализа панели генов-кандидатов, ответственных за развитие этих форм патологии [37-40].

Материалы и методы

Исследование включало пациентов с подозрением на ГБ, в возрасте от 15 мес до 18 лет (n = 96, 61 мальчик и 35 девочек), которые были отобраны из числа детей, поступивших из различных регионов нашей страны и наблюдавшихся в клинических отделениях Национального научно-практического центра здоровья детей Минздрава России.

Всем пациентам осуществлялось выделение геномной ДНК с помощью набора реактивов DNeasy Blood & Tissue Kit (Германия) на автоматической станции QIAcube (Германия). Качество и количество выделенной геномной ДНК исследовалось при помощи прибора NanoView, (Швеция). Геномная ДНК, соответствующая всем необходимым требованиям, была отправлена на молекулярно-генетическую диагностику методом массового параллельного секве-нирования, подразумевающим мультиплексную диагностику таргетных областей 20 генов: GYsi, GYs2, G6Pc, SLC37A4, GAA, AGL, GBEi, PYGM, PYGL, PFKM, PHKA2, PHKB, PHKG2, PHKAi, PGAM2, PGMi, LDHA, ALDOA, ENO3 и GYGi, мутации в которых приводят к развитию известных форм ГБ. Под таргетными областями подразумевались все про-моторные, кодирующие и прилегающие интронные области этих 20 генов. Таргетные области, включающие 54605 п. н., были обогащены со средним покрытием 100X. Длина среднего прочтения одного фрагмента составила 200 п. н. Пробоподготовка и массовое параллельное секвенирование проводились на оборудовании Ion S5 (Thermo Fisher Scientific, США) в соответствии с протоколами и рекомендациями производителя. Все найденные варианты исследованных генов с частотой встречаемости менее 1% по базам Exac и 1000 Genomes, в том числе новые нуклеотидные замены, неописанные в мире ранее, были подвергнуты биоинформатическому анализу с использованием программ Alamut Focus и Alamut Visual (Interactive Biosoftware, Франция) на предмет возможной патогенности и валидированы при помощи метода секвенирования по Сэнгеру. Неописанные ранее мутации, чья патогенность была подтверждена биоинформатическим путем, были подвергнуты семейному анализу. Для валидации разработанной технологии олигонуклеотиды были подобраны на все кодирующие последовательности генов, входящих в исследуемую панель, заблаговременно.

Поиск нуклеотидных последовательностей генов проводился в биоинформационной базе данных NCBI

Russian pediatric journal (Russian journal). 2017; 20(3) DOI: http://dx.doi.org/10.18821/1560-9561-2017-20-3-132-139

135.

ORIGINAL ARTicLE

(National Center forBiotechnological Information, USA). Для поиска консервативных участков использована программа BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi). Последовательности олигонуклеотидов подбирались с помощью программы Beacon Designer 8.10. Проверка специфичности пар праймеров проводилась с помощью программы Primer-BLAST (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast).

Для проведения секвенирования по Сэнгеру вся исходная геномная ДНК подвергалась амплификации на оборудовании ProFle PCR System, (Thermo Fisher Scientific, США). Продукты амплификации секвенировались при помощи набора реактивов BigDye Terminator v 3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific, США) в соответствии с протоколами и рекомендациями производителя на оборудовании ABI 3500X (Thermo Fisher Scientific, США). На молекулярно-генетическую диагностику БП поступили пациенты со сниженной активностью альфа-глюкозидазы, измеренной нами ранее в пятнах крови, высушенных на фильтровальной бумаге.

Результаты

Разработанный метод массового параллельного секвенирования позволил поставить диагнозы 89 (92,6%) пациентам из 96 исследованных (табл. 1). У 7 пациентов с подозрением на ГБ не было выявлено ни одной мутации либо были обнаружены гетерозиготные варианты исследованных генов с неизвестной патогенностью. Среди выявленных мутаций чаще всего встречались патогенные варианты гена PHKA2, мутации в котором были определены у 21 пациента (23,6%). Среди 12 различных обнаруженных вариантов гена PHKA2 6 (50%) оказались новыми мутациями, неописанными в мире ранее. Это миссенс мутации c.!33C > T (p.Arg45Trp), встретившаяся дважды у неродственных пациентов, c.755C > T (p.S252F) и c.772G > A (p.G258R), нонсенс мутации c.903T > G (p.W301X) и c.3277C > T (p.Q1093X), а также мутация, приводящая к нарушению сайта сплайсинга C.919-2A > G. В гене AGL мутации были выявлены у 20 (20,5%) детей. Среди 15 различных мутаций 6 (40%) мутаций оказались неописанными ранее. Это 4 миссенс мутации: C.643G > С (p.Asp215His), c.1289T > С (p.Phe430Ser), определенная дважды у неродственных пациентов, C.1667T > С (p.Leu556Pro), выявленная дважды у неродственных пациентов и c.2390A > G (p.Asn797Ser), нонсенс мутация, c.1218T > A (p.Tyr406X), а также мутация c.1735+5G > A, оказывающая влияние на сплайсинг. У 15 (16,8%) пациентов удалось выявить 20 вариантов гена GAA, 6 (30%) из которых оказались неописанными ранее. Среди новых мутаций встретились 3 миссенс мутации: C.1292T > С (p.Leu431Pro), C.1448G > A (p.Gly483Glu) и c.2853G > T (p.Trp951Cys), одна нонсенс мутация С.1961С > G (p.Ser654X) и 2 небольшие делеции: c.1030 1039del (p.Gly344Profs*45) и c.2011_2012del (p.M671Afs*65). Мутации гена SLC37A4 также встретились у 15 (16,8%) человек. Среди 15 различных выявленных мутаций 8 (53,3%) мутаций не были описаны в мире ранее. Это 6 мис-

сенс мутаций: с.2Т > С (р.М1?), С.85А > G (р.К29Е), c.148G > А (р^50Я), С.209Т > С (р.Ьеи70Рю), С.898С

> А (p.Arg370Ser) и с.10^ > Т (p.Gly339Val), встретившаяся у 3 больных детей из неродственных семей, а также одна нонсенс мутация c.413G > А (р.Тгр138Х), одна инсерция c.1077_1078insG (p.Asn360Glufs*42). У 7 (7,9%) человек обнаружились 3 различные мутации гена G6PС. У 5 человек были выявлены 6 разных вариантов гена PYGL, среди которых 4 (66,7%) оказались новыми миссенс мутациями: С.176С > G (р.Ш59А^, с.475С > Т (р^159С), c.697G > А (p.G233S) и С.841Т > А (р.Туг281Ат). У 4 детей удалось обнаружить 5 различных мутаций гена PHKG2, 2 (40%) из которых оказались неописанными ранее миссенс мутациями: С.584С > Т (p.A195V) и c.658G

> А (p.G220R). У одного ребенка были выявлены 2 не описанные ранее миссенс мутации гена GBЕ1: С.427А

> G (p.Lys143Glu) и С.1583А > G (р^528А^ и еще у одного ребенка была обнаружена новая мутация в гене РНКА1: С.776Т > С (р.1еи259Рт).

Среди частых мутаций, характерных для российской популяции детей с ГБ, обнаруженных в ходе исследования, выделяется миссенс мутация С.247С

> Т, приводящая к замене аминокислотных остатков p.Arg83Сys гена G6PС, встретившаяся в 11 (78,6%) ал-лельных вариантах из 14 возможных. В гене SLС37A4 частой мутацией является делеция двух нуклеотидов c.1042_1043del, приводящая к сдвигу рамки считывания р1еи348Уа^*53, обнаруженная в 11 (39,3%) ал-лельных вариантах из 28 возможных (из двух родных братьев учтен один). В гене AGL удалось выявить 2 мутации, характерные для российских детей с ГБ, тип III: нонсенс мутация c.3980G > А, приводящая к преждевременной терминации трансляции р.Тгр1327Х, найденная в 10 (25%) аллельных вариантах из 40 возможных, и мутация С.1423+Ю > А, оказывающая влияние на сайт сплайсинга, найденная в 6 (15,8%) аллельных вариантах из 38 возможных (из двух родных братьев учтен один). В гене GAA самой частой мутацией является сплайсинговая мутация С.-32-13Т

> G, обнаруженная в 4 (14,3%) аллельных вариантах из 28 возможных (из двух родных сестер учтена одна). В гене РНКА2 чаще всех прочих была обнаружена мутация c.884G > А, р^295Н, выявленная у 3 (15%) неродственных пациентов из 20 неродственных детей с диагнозом ГБ, тип IX, установленным в ходе исследования (из двух родных братьев учтен один). Остальные мутации встречались с частотой, не превышающей 10%.

Секвенирование по Сэнгеру подтвердило 100% чувствительность и специфичность технологии массивного параллельного секвенирования для поиска однонуклеотидных замен в кодирующих и прилегающих интронных областях, а также для поиска небольших делеций и дупликаций генов, мутации в которых приводят к развитию ГБ (табл. 2).

Обсуждение

Проведенные исследования показали, что в структуре гликогенозов большей частотой встречаемости среди детского населения России обладает ГБ IX

оригинальная статья

Таблица 1

Мутации, характерные для российской популяции детей с гликогеновой болезнью

№ Пол Возраст Ген Нуклеотидная, аминокислотная замена 1 Нуклеотидная, аминокислотная замена 2

1 м 8 лет 9 мес AGL с.39800 > А, p.W1327X c.3980G > A, p.W1327X

2 м 11 лет 11 мес AGL c.643G > С, p.D215H с.1423+Ю > A

3 м 10 лет 1 мес РНКЛ2 с.39^ > Т, p.H132Y -

4 м 7 лет 6 мес РНКЛ2 c.884G > A, рЯ295Н -

5 м 12 лет 7 мес РНКЛ2 c.884G > A, рЯ295Н -

6 ж 13 лет AGL с.408_41Ме1, p.Cys136Trpfs*21 c.4193G > A, p.Trp1398X

7 ж 14 лет 6 мес PYGL С.841Т >Л, p.Y281N С.841Т >Л, р^28Ш

8 м 5 лет 4 мес РН^1 c.776T > С, рХ259Р -

9 ж 4 года AGL c.3980G > A, р.Тгр1327Х с.1900-13Т > A

10 м 16 лет РНКЛ2 С.133С > Т, р.Л^45Тгр -

11 м 9 лет 7 мес AGL с.1423 + Ю > A с.1423 + Ю > A

12 м 7 лет 2 мес AGL с.1423 + Ю > A с.1423 + Ю > A

13 м 15 лет 6 мес РНКЛ2 С.919-2Л > G -

14 м 11 лет 7 мес РНКЛ2 c.557G > A, рЯ186Н -

15 м 16 лет 5 мес AGL c1735+5G > Л с.422^е1, p.Lys1407Asnfs*8

16 м 9 лет 2 мес AGL С.2390Л > G, p.Лsn797Ser С.2390Л > G,p.Лsn797Ser

17 м 18 лет РНКЛ2 c.557G > A, рЯ186Н -

18 ж 7 лет 3 мес PYGL c.1195C > Т, рЯ399Х с.176€ > G, p.T59Я

19 ж 5 лет 6 мес GBE1 С.427Л > G,р.К143Е С.1583Л > G, р^528Л^

20 м 4 года 7 мес РНШ2 c.130C > Т, р.Я44Х c.899G > A, p.W300X

21 м 5 лет 7 мес AGL c.1177C > Т, р^393Х c.3980G > A, p.W1327X

22 м 4 года 7 мес РНКЛ2 c.883C > Т, p.Я295C -

23 м 6 лет 9 мес РНКЛ2 c.3614C > Т, рЯПГЖ -

24 ж 3 года 11 мес AGL с.39800 > A, рЖ1327Х с.1423 + Ю > A

25 м 3 года 7 мес РНКЛ2 c.557G > A, р.Я186Н -

26 м 3 года 11 мес РНКЛ2 c.3614C > Т, рЯПОЖ -

27 ж 14 лет 11 мес G6PC c.247C > Т, p.Arg83Cys c.883C > Т, p.Arg295Cys

28 ж 5 лет 2 мес G6PC c.247C > Т, p.Arg83Cys c.247C > Т, p.Arg83Cys

29 ж 7 лет 6 мес G6PC c.247C > Т, p.Arg83Cys c.247C > Т, p.Arg83Cys

30 м 15 лет 11 мес G6PC c.247C > Т, p.Arg83Cys c.247C > Т, p.Arg83Cys

31 ж 9 лет 9 мес G6PC c.247C > Т, p.Arg83Cys c.247C > Т, p.Arg83Cys

32 м н/д SLC37A4 с.345dup, p.Leu116Alafs*15 c.1042_1043del, p.Leu348Vafs*53

33 м 6 лет 7 мес SLC37A4 с.41Ю > A, р.Тгр137Х с.413G >Лр.Тгр138Х

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

34 м 14 лет SLC37A4 c.1016G > Т, p.Gly339Val c.1016G > Т, p.Gly339Val

35 м 14 лет SLC37A4 с.10^ > Т, p.Gly339Val c.1042_1043del, p.Leu348Vafs*53

36 м 16 лет 6 мес SLC37A4 c.817G > A, p.Gly273Ser c.1042_1043del, p.Leu348Vafs*53

37 ж 14 лет 8 мес SLC37A4 c.1016G > Т, p.Gly339Val c.1042_1043del, p.Leu348Vafs*53

38 м 9 лет SLC37A4 c.1042_1043del, p.Leu348Vafs*53 c.1099G > A p.Ala367Thr

39 ж 14 лет 8 мес SLC37A4 c.1042_1043del, p.Leu348Vafs*53 c.1099G > A p.Ala367Thr

40 м 8 лет 8 мес SLC37A4 c.345dup, p.Leu116Alafs*15 c.1077_1078insG, p.Лsn360Glufs*42

41 м 4 года 3 мес SLC37A4 c.1042_1043del, p.Leu348Vafs*53 c.1015G > Т, p.Gly339Cys

42 ж 2 года 5 мес AGL С.1218Т >Л, р.Туг406Х c.3980G > A, p.Trp1327X

43 ж 5 лет 2 мес SLC37A4 С.209Т > С, рХеи70Рго С.898С > Л, pЛrg370Ser

44 м 15 лет РНКЛ2 c.884G > A, p.Я295H -

45 ж 8 лет 3 мес SLC37A4 c.1042_1043del, p.Leu348Vafs*53 c.1042_1043del, p.Leu348Vafs*53

46 м 15 лет AGL С.1289Т > С, p.Phe430Ser c.3980G > A, p.Trp1327X

47 м 6 лет 1 мес AGL С.1667Т > С, рХеи556Рго с.4089йар, р.Ляр1364Лг^я*2

48 ж 2 года 3 мес SLC37A4 c.1042_1043del, p.Leu348Vafs*53 c.1042_1043del, p.Leu348Vafs*53

49 м 2 года 1 мес SLC37A4 С.85Л > G, р.К29Е c.1042_1043del, p.Leu348Vafs*53

50 ж 3 года 4 мес AGL c.3980G > A, p.Trp1327X c.3980G > A, p.Trp1327X

51 м 11 лет РНКЛ2 С.133С > Т, рЯ45Ш -

52 ж 17 лет 4 мес PYGL c.38A > C, p.Q13P c.38A > C, p.Q13P

53 м 7 лет 5 мес РНКЛ2 c.772G > Л, p.G258R -

54 м 3 года 3 мес РНШ2 c.469G > A, p.E157K c.469G > A, p.E157K

Продолжение табл. 1 см. на стр. 137

Russian pediatric journal (Russian journal). 2017; 20(3) DOI: http://dx.doi.org/10.18821/1560-9561-2017-20-3-132-139

ORIGINAL ARTicLE

Продолжение табл. 1 со стр.136

№ Пол Возраст Ген Нуклеотидная, аминокислотная замена 1 Нуклеотидная, аминокислотная замена 2

55 ж 4 года 4 мес SLC37A4 c.2T > C, p.M1? c.148G > A, p.G50R

56 м 3 года 11 мес AGL c.3980G > A, p.W1327X c.3216_3217del, p.E1072Dfs*36

57 ж 10 лет 1 мес PYGL c.697G >A, p.G233S c.475C> T, p.G159C

58 м 12 лет 8 мес AGL c.1289T > C, p.F430S c.1289T > C, p.F430S

59 ж 2 года 11 мес AGL c.1667C > T, p.L556P c.1667C > T, p.L556P

60 ж 2 года 11 мес AGL c.1667C > T, p.L556P c.1667C > T, p.L556P

61 м 2 года 5 мес PHKA2 c.755C > T, p.S252F -

62 м 7 лет PHKA2 c.883C > T, p.R295C -

63 м 18 лет PHKG2 c.584C > T, p.A195V c.584C > T, p.A195V

64 ж 4 года G6PC c.247C > T, p.Arg83Cys c.247C > T, p.Arg83Cys

65 м 2 года 10 мес PHKA2 c.884G > A, p.R295H -

66 м 7 лет 8 мес PHKA2 c.3277C > T, p.Q1093X -

67 м 1 год 3 мес G6PC c.229T > C, p.W77R c.229T > C, p.W77R

68 м 4 года 8 мес PHKA2 c.903T > G, p.W301X -

69 ж н/д PYGL c.38A > C, p.Q13P c.697G >A, p.G233S

70 м 17 лет 5 мес PHKA2 c.3614C > T, p.P1205L -

71 м 5 лет 1 мес PHKA2 c.3025C > T, p.Q1009X -

72 ж 17 лет AGL c.1423 + 1G > A c.1423 + 1G > A

73 ж 16 лет 5 мес PHKG2 c.658G > A, p.G220R c.658G > A, p.G220R

74 ж 8 лет 2 мес AGL c.3613C > T, p.Q1205X c.3613C > T, p.Q1205X

75 ж 4 года 5 мес GAA c.1292T > C, p.Leu431Pro c.1292T > C, p.Leu431Pro

76 ж 5 лет 2 мес GAA c.1210G > A, p.Asp404Asn c.2853G > T, p.Trp951Cys

77 м 3 года 2 мес GAA c.506T > C, p.Leu169Pro c.2662G > T, p.Glu888X

78 м 6 лет 3 мес GAA c.307T > G, p.Cys103Gly c.1030 1039del, p.Gly344Profs*45

79 ж 11 лет 8 мес GAA c.2446G > A, p.Val816Ile c.2662G > T, p.Glu888X

80 м 12 лет 8 мес GAA c.2446G > A, p. Val816Ile c.2662G > T, p.Glu888X

81 ж 14 лет 2 мес GAA c.1000G > A, p.Gly334Ser c.1000G > A, p.Gly334Ser

82 ж 13 лет 2 мес GAA c.784G > A, p.Glu262Lys c.1448G > A, p. Gly483Glu

83 м 4 года 5 мес GAA c.1000G > A, p.Gly334Ser c.1735G > A, p. Glu579Lys

84 3 года 1 мес GAA c.-32-13T > G c.307T > G, p.Cys103Gly

85 ж 5 лет 2 мес GAA c.-32-13T > G c.1961C > G, p.Ser654X

86 м 16 лет 2 мес GAA c.670C > T, p.R224W c.2608C > T, p.R870X

87 м 2 года 1 мес GAA c.-32-13T > G c.2238G > A, p.Trp746X

88 ж 5 лет 6 мес GAA c.-32-13T > G c.1082C > T, p.P361L

89 м 7 лет 2 мес GAA c.1799G > A, p.R600H c.2011_2012del, p.M671Afs*65

Примечание. Жирным шрифтом выделены неописанные в базе HGMD prof мутации [37]. Отсутствие второй мутации в генах PHKA1 и PHKA2 у мальчиков связано с локализацией этих генов на X-хромосоме. Значение н/д в графе возраст указывает на отсутствие данных.

Таблица 2

Чувствительность и специфичность массивного параллельного секвенирования при гликогеновой болезни, вычисленные при помощи сравнительного анализа выявленных вариантов генома

Массивное параллельное секвенирование Секвенирование по Сэнгеру

истинно положительный ложно-отрицательный истинно отрицательный ложно-положительный чувствительность, % специфичность, % положительный

38 0 54567 0 100 100 38

39 0 54566 0 100 100 39

Примечание. 54605 п. н. - суммарное количество нуклеотидов, включенное в анализ данных. Истинно отрицательные варианты -варианты генома, совпадающие с эталонной последовательностью нуклеотидов. Истинно положительные варианты - варианты генома, отличающиеся от референсной последовательности нуклеотидов.

оригинальная статья

типа, выявленная в 29,2% случаев. ГБ I типа, выявленная в 24,7% случаев, оказалась второй по частоте встречаемости формой гликогенозов. ГБ III типа, считающаяся наиболее частой формой ГБ во многих странах, в нашем исследовании занимает третью по частоте позицию, встречаясь у 22,5% обследованных детей. Диагноз ГБ II типа был поставлен в 16,8% случаев, ГБ VI типа - в 5,6% случаев, ГБ IV типа - в 1,1% обследованных детей. Высокая частота встречаемости ГБ IX типа может указывать как на характерные особенности российской популяции, так и на недооб-следованность детей с гликогенозами, приводящую к значительному количеству ошибочных диагнозов, выставляемых лишь на основании клинической картины болезни без лабораторного подтверждения.

Частые мутации c.247C > T гена G6PC, c.1042_1043del гена SLC37A4, c.3980G > A гена AGL и c.-32-13T > G гена GAA и c.884G > A гена PHKA2 обладают высокой частотой встречаемости и в других популяционных группах, тогда как высокая частота мутации c.1423 + 1G > A гена AGL, впервые описанной в лишь в 2016 г. [41], характерна именно для российской популяции.

Среди 89 пациентов, которым в результате проведенного исследования удалось верифицировать диагноз ГБ, у 39 (43,8%) детей были обнаружены новые мутации. В общей сложности нами было выявлено 79 различных патогенных вариантов обследованных генов, 35 (44,3%) из которых оказались не описанными ранее в международной базе данных HGMD [42]. Высокий процент неописанных ранее мутаций может свидетельствовать о высокой гетерогенности и слабой изученности генетических причин развития ГБ у жителей, населяющих территорию современной России.

Проведенное исследование демонстрирует успешное применение технологии массивного параллельного секвенирования в диагностическом тестировании группы клинически и генетически разнородных заболеваний, объединенных дефектами в механизмах образования и распада гликогена в печени, мышцах и других тканях [37-40]. Разработанная и валидиро-ванная технология позволяет осуществлять раннее выявление ГБ у детей, что имеет решающее значение для быстрой постановки корректного диагноза, своевременного назначения адекватного лечения, профилактики осложнений, а также увеличения продолжительности и качества жизни пациентов.

Конфликт интересов. Авторы данной статьи подтвердили отсутствие финансовой поддержки/конфликта интересов, о которых необходимо сообщить.

ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES

1. Ausems M.G., Verbiest J., Hermans M.P., Kroos M.A., Beemer F.A., Wokke J.H. et al. Frequency of glycogen storage disease type II in The Netherlands: implications for diagnosis and genetic counselling. Eur. J. Hum. Genet. 1999; 7 (6): 713-6.

2. Roth K. Glycogen-storage disease type I. eMedicine Specialties. 2009. http://emedicine.medscape.com/article/949937-overview

3. von Gierke E. Hepato-nephromegalia glykogenica (Glykogenspeicherkrankheit der Leber und Nieren). Beitr. pathol. Anat. allg. Pathol. 1929; 82 (4): 497-513.

4. Cori G.T., Cori C.F. Glucose-6-phosphatase of the liver in glycogen storage disease. J. Biol. Chem. 1952; 199 (2): 661-7.

5. Narisawa K., Igarashi Y., Otomo H., Tada K. A new variant of glycogen storage disease type I probably due to a defect in the glucose-6-phosphate transport system. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1978; 83 (4): 1360-4.

6. Lei K.-J., Shelly L., Pan C.-J., Sidbury J., Chou J. Mutations in the glucose-6-phosphatase gene that cause glycogen storage disease type 1a. Science. 1993; 262 (5133): 580-3.

7. Gerin I., Veiga-da-Cunha M., Achouri Y., Collet J.-F., Van Schaftingen E. Sequence of a putative glucose 6-phosphate translocase, mutated in glycogen storage disease type Ib. FEBS Lett. 1997; 419 (2-3): 235-8.

8. Pompe J.C. Over idiopathische hypertrophie van het hart. Ned. Tijdschr. Geneesk. 1932; 76: 304-12.

9. Cori G.T. Enzymes and glycogen structure in glycogenosis. Ost. Z. Kinderheilk. 1954; 10 (1-2): 38-42.

10. Hers H.G. Alpha-glucosidase deficiency in generalize glycogen storage disease (Pompe's disease). Biochem. J. 1963; 86 (1): 11-6.

11. Hoefsloot L.H., Hoogeveen-Westerveld M., Reuser A.J. et al. Characterization of the human lysosomal alpha-glucosidase gene. Biochem. J. 1990; 272 (2): 493-7.

12. Forbes G. Glycogen storage disease. Report of a case with abnormal glycogen structure in liver and skeletal muscle. J. Pediatr. 1953; 42: 645-52.

13. Illingworth B., Cori G. Structure of glycogens and amylopectins, III. Normal and abnormal human glycogen. J. Biol. Chem. 1952; 199: 653-9.

14. Bao Y., Yang B.Z., Dawson T.L., Chen Y.T. Isolation and nucleotide sequence of human liver glycogen debranching enzyme mRNA: identification of multiple tissue-specific isoforms. Gene. 1997; 197 (1-2): 389-98.

15. Andersen D.H. Familial cirrhosis of the liver with storage of abnormal glycogen. Lab. Invest. 1956; 5 (1): 11-20.

16. Brown B.I, Brown D.H. Lack of an alpha-1,4-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyl transferase in a case of type IV glycogenosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1966; 56 (2): 725-9.

17. Thon V.J., Khalil M., Cannon J.F. Isolation of human glycogen branching enzyme cDNAs by screening complementation in yeast. J. Biol. Chem. 1993; 268 (10): 7509-13.

18. McArdle B. Myopathy due to a defect in muscle glycogen breakdown. Clin. Sci. 1951; 10 (1): 13-33.

19. Kubisch C., Wicklein E., Jentsch T. Molecular diagnosis of McArdle disease: revised genomic structure of the myophosphorylase gene and identification of a novel mutation. Hum. Mutat. 1998; 12 (1): 27-32.

20. Hers H.G. Enzymatic studies of hepatic fragments; application to the classification of glycogenoses. Rev. Int. Hepatol. 1959; 9 (1): 35-55.

21. David E.S., Crerar M.M. Quantitation of muscle glycogen phosphorylase mRNA and enzyme amounts in adult rat tissues. Biochim. Biophys. Acta. 1986; 880 (1): 78-90.

22. Newgard C.B., Littman D.R., van Genderen C., Smith M., Fletterick R.J. Human brain glycogen phosphorylase-cloning, sequence analysis, chromosomal mapping, tissue expression, and comparison with the human liver and muscle isozymes. J. Biol. Chem. 1988; 263 (8): 3850-7.

23. Newgard C.B., Fletterick R.J., Anderson L.A., Lebo R.V. The polymorphic locus for glycogen storage disease VI (liver glycogen phosphorylase) maps to chromosome 14. Am. J. Hum. Genet. 1987; 40 (4): 351-64.

24. Tarui S., Okuno G., Ikura Y., Tanaka T., Suda M., Nishikawa M. et al. Phosphofructokinase deficiency in skeletal muscle: a new type of glycogenosis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1965; 19 (3): 517-23.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

25. Yamasaki H., Nakajima H., Kono N., Hotta K., Yamada K., Imai E. et al. Structure of the entire human muscle phosphofructokinase-en-coding gene: a two-promoter system. Gene. 1991; 104 (2): 277-82.

26. Hendrickx J., Lee P., Keating J.P., Carton D., Sardharwalla I.B., Tuchman M. et al. Complete genomic structure and mutational spectrum of PHKA2 in patients with X-linked liver glycogenosis type I and II. Am. J. Hum. Genet. 1999; 64 (6): 1541-9.

27. Wullrich-Schmoll A., Kilimann M.W. Structure of the human gene encoding the phosphorylase kinase beta subunit (PHKB). Eur. J. Biochem. 1996; 238 (2): 374-80.

28. Burwinkel B., Maichele A.J., Aagenaes O., Bakker H.D., Lerner A., Shin Y.S. et al. Autosomal glycogenosis of liver and muscle due to phosphorylase kinase deficiency is caused by mutations in the phos-phorylase kinase beta subunit (PHKB). Hum. Mol. Genet. 1997; 6 (7): 1109-15.

Russian pediatric journal (Russian journal). 2017; 20(3) DOI: http://dx.doi.org/10.18821/1560-9561-2017-20-3-139-144

139.

ORIGINAL ARTIcLE

29. Zander N.F., Meyer H.E., Hoffmann-Posorske E., Crabb J.W., Heilmeyer L.M.G. Jr., Kilimann M.W. cDNA cloning and complete primary structure of skeletal muscle phosphorylase kinase (alpha subunit). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988; 85 (9): 2929-33.

30. Chou J.Y., Matern D., Mansfield B.C., Chen Y.T. Type I glycogen storage diseases: disorders of the glucose-6-phosphatase complex. Curr. Mol. Med. 2002; 2 (2): 121-43.

31. Nakajima H., Raben N., Hamaguchi T., Yamasaki T. Phosphofruc-tokinase deficiency; past, present and future. Curr. Mol. Med. 2002; 2 (2): 197-212.

32. Desnuelle C., Salviati L. Challenges in diagnosis and treatment of late-onset Pompe disease. Curr. Opin. Neurol. 2011; 24 (5): 443-8.

33. Ravenscroft G., Thompson E.M., Todd E.J., et al. Whole exome sequencing in foetal akinesia expands the genotype-phenotype spectrum of GBE1 glycogen storage disease mutations. Neuromuscul. Disord. 2013; 23 (2): 165-9.

34. Massa R., Bruno C., Martorana A., de Stefano N., van Diggelen O.P., Federico A. Adult polyglucosan body disease: proton magnetic resonance spectroscopy of the brain and novel mutation in the GBE1 gene. Muscle and Nerve. 2008; 37 (4): 530-6.

35. Bamshad M.J., Ng S.B., Bigham A.W. et al. Exome sequencing as a tool for Mendelian disease gene discovery. Nat. Rev. Genet. 2011; 12 (11): 745-55.

36. Coppieters F., De Wilde B., Lefever S. et al. Massively parallel sequencing for early molecular diagnosis in Leber congenital amaurosis. Genet. Med. 2012; 14 (6): 576-85.

37. Wang J., Cui H., Lee N.C., Hwu W.L., Chien Y.H., Craigen W.J. et al. Clinical application of massively parallel sequencing in the molecular diagnosis of glycogen storage diseases of genetically heterogeneous origin. Genet. Med. 2013; 15 (2): 106-14.

38. Chae J.H., Vasta V., Cho A., Lim B.C., Zhang Q., Eun S.H. et al. Util-

ity of next generation sequencing in genetic diagnosis of early onset neuromuscular disorders. J. Med. Genet. 2015; 52 (3): 208-16.

39. Peters D.G., Yatsenko S.A., Surti U., Rajkovic A. Recent advances of genomic testing in perinatal medicine. Semin. Perinatol. 2015; 39 (1): 44-54.

40. Levesque S., Auray-Blais C., Gravel E., Boutin M., Dempsey-Nunez L., Jacques P.E. et al. Diagnosis of late-onset Pompe disease and other muscle disorders by next-generation sequencing. Orphanet. J. RareDis. 2016; 11: 8. doi: 10.1186/s13023-016-0390-6.

41. https://portal.biobase-international.com/hgmd/pro/allmut.php#splice

42. https://portal.biobase-international.com/hgmd

Поступила 05.04.2017 Принята в печать 20.04.2017

Сведения об авторах:

Сурков Андрей Николаевич, канд. мед. наук, ученый секретарь ФГАУ ННПЦЗД Минздрава России; Намазова-Баранова Лейла Сей-муровна, доктор мед. наук, проф., акад. РАН, директор НИИ педиатрии ФГАУ ННПЦЗД Минздрава России; Жанин Илья Сергеевич, мл. науч. сотр. лаб. молекулярной генетики и клеточной биологии ФГАУ ННПЦЗД Минздрава России; Пушков Александр Алексеевич, канд. биол. наук, вед. науч. сотр. лаб. молекулярной генетики и клеточной биологии ФГАУ ННПЦЗД Минздрава России; Басаргина Елена Николаевна, доктор мед. наук, проф., зав. кардиологическим отд-нием ФГАУ ННПЦЗД Минздрава России; Никитин Алексей Георгиевич, канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. молекулярной генетики и клеточной биологии ФГАУ ННПЦЗД Минздрава России; Пахомов Александр Владимирович, науч. сотр. лаб. молекулярной генетики и клеточной биологии ФГАУ ННПЦЗД Минздрава России; Баранов Александр Александрович, доктор мед. наук, проф., акад. РАН, директор ФГАУ ННПЦЗД Минздрава России.

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 616.127-06:616-005.6]:577.21.08

Басаргина Е.Н., Умарова М.К., Савостьянов К.В., Деревнина Ю.В., Смирнов И.Е.

ЧАСТОТА ТРОМБОТИЧЕСКИХ ОСЛОжНЕНИЙ И ОСОБЕННОСТИ ГЕНОТИПОВ ПОЛИМОРФНЫХ МАРКЕРОВ ГЕНОВ ГЕМОСТАЗА У ДЕТЕЙ С НЕКОМПАКТНОЙ КАРДИОМИОПАТИЕЙ

ФГАУ «Национальный научно-практический центр здоровья детей» Минздрава России, 119991, г. Москва, Ломоносовский просп., д. 2, стр. 1

Некомпактная кардиомиопатия характеризуется аномальным строением миокарда, различными типами ре-моделирования сердца и в ряде случаев сопровождается тромботическими осложнениями. Однако причины и частота тромбозов при этих формах патологии у детей недостаточно изучены. Представлены данные определения частоты тромбозов у детей с некомпактной (НКМП) и дилатационной (ДКМП) кардиомиопатией и изменений генотипов полиморфных маркеров генов гемостаза при этих кардиомиопатиях. Наличие некомпактной кардиомиопатии было установлено при помощи эхокардиографии, аллели и генотипы полиморфных маркеров генов гемостаза и фолатного цикла определяли методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Установлено, что тромботические осложнения в 4 раза чаще определялись у больных с НКМП, чем при ДКМП. При этом не было выявлено различий между НКМП и ДКМП в частоте полиморфных маркеров c.1691G>A гена F5 (p = 0,61), c.20210G>A гена F2 (p = 1,0), c.1565T>C генаITGB3 (p = 0,32), 5G(-675)4G гена PLANH1 (p = 0,52), G(-455)A генаFGB (p = 0,82) , c.677C>TгенаMTHFR (p = 0,11). Таким образом, тромбозы встречаются чаще у больных с НКМП, чем у детей с ДКМП, однако полиморфизмы изученных генов гемостаза и фолатного цикла не являются причиной этих осложнений.

Ключевые слова: некомпактная кардиомиопатия; дети; тромбозы; полиморфизмы генов гемостаза и фолатного цикла.

Для цитирования: Басаргина Е.Н., Умарова М.К., Савостьянов К.В., Деревнина Ю.В., Смирнов И.Е. Частота тромботических осложнений и особенности генотипов полиморфных маркеров генов гемостаза у детей с некомпактной кардиомиопатией. Российский педиатрический журнал. 2017; 20 (3): 139-144. DOI: http://dx.doi. org/10.18821/1560-9561-2017-20 (3) -139-144

Для корреспонденции: Басаргина Елена Николаевна, доктор мед. наук, проф., руководитель кардиологического отделения ННПЦЗД, e-mail: [email protected]

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.